Summary
DT40, en modell ryggradsdjur genetiska system, ger ett kraftfullt verktyg för att analysera proteiners funktion. Här beskriver vi en enkel metod som möjliggör kvalitativ analys av parametrar som påverkar DNA-syntesen under S-fas i DT40 celler vid enda molekyl nivå.
Abstract
Underhåll av replikationsgaffeln stabilitet är av yttersta vikt för delande celler för att bevara lönsamheten och förebygga sjukdom. De processer som inte bara se till trogna genomet dubbelarbete i ansiktet av endogena och exogena DNA-skador men också förebygga genomisk instabilitet, en erkänd orsakande faktor i tumörutveckling.
Här beskriver vi en enkel och kostnadseffektiv fluorescensmikroskopi-baserad metod för att visualisera DNA-replikation i aviär B-cellinje DT40. Denna cellinje ger ett kraftfullt verktyg för att undersöka proteiners funktion in vivo genom omvänd genetik i ryggradsdjur celler 1. DNA-fiber RADIOFOTOGRAFERING i DT40 celler som saknar en specifik gen gör att man kan belysa funktionen av denna gen produkt i DNA-replikation och arvsmassa stabilitet. Traditionella metoder för att analysera dynamiken replikationsgaffeln i ryggradsdjur celler är beroende av att mäta den totala frekvensen av DNA-syntesen i en population av puls-märkta celler. Detta är en kvantitativ metod och inte tillåter kvalitativ analys av parametrar som påverkar DNA-syntesen. Däremot kan graden av rörligheten för aktiva gafflar följas direkt när man använder tekniken DNA-fiber 2-4. I denna metod är begynnande DNA-märkt in vivo genom inkorporering av halogenerade nukleotider (Fig. 1A). Därefter är individuella fibrer sträcks ut på ett objektglas, och den märkta DNA-replikation skrifter färgas med specifika antikroppar och visualiseras genom fluorescensmikroskopi (Fig. 1B). Inledande av replikering samt gaffel riktning bestäms av efterföljande användning av två olika modifierad analoger. Dessutom tillåter dubbla märkning metod för kvantitativ analys av parametrar som påverkar DNA-syntesen under S-fasen, dvs replikering strukturer såsom pågående och stannade gafflar, replikering ursprung densitet samt avslutningar gaffel. Slutligen kan experimentell förfarandet åstadkommaED inom en dag, och kräver endast allmän laboratorieutrustning och en fluorescensmikroskop.
Protocol
Den här beskrivna metoden har använts i följande publikationen: Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5..
1. DT40 cellodling
Material: Fetal bovint serum (FBS), kyckling serum, penicillin / streptomycin, 2-merkaptoetanol, RPMI
- Förbered cellkulturens medium: lägg till 7% FBS, 3% kyckling serum, 1x penicillin / streptomycin och 10 mikrometer 2-merkaptoetanol till RPMI medium.
- DT40 celler odlas i sterila flaskor cellkultur vid 38 ° C och 5% CO 2 i en fuktig kuvös. Split celler varje dag till en densitet på 5 x 10 5 celler / ml 6.
2. In vivo märkning
Material: IDU, CldU
- Bered stamlösningar av nukleotidanaloger: Lös IDU till 5 mm och CldU till 2,5 mm i medium. Värm båda lösningarna kort till 60 ° C och skaka tills nukleotid analogaUES upplöses helt.
- Lägg IDU till en slutlig koncentration av 25 mikroM till exponentiellt växande DT40 celler och blanda cellsuspension väl. Inkubera cellerna i 20 minuter vid 38 ° C och 5% CO 2.
- Efter inkubation med den första etiketten, lägg CldU till en slutlig koncentration av 250 mikroM och behandla celler som beskrivs i föregående steg.
- Tvätta cellerna med iskall PBS och resuspendera dem vid en koncentration av 7,5 x 10 5 celler / ml i kallt PBS. Håll märkta celler på is.
Märkningen förfarande som beskrivs är bara ett förslag och kan ändras för att lösa specifika frågor. Se diskussionen för mer information om experimentell design.
3. Cellslys och DNA sprids
Material: Glas diabilder, fiber lyseringslösning
- Förbered fibern lyseringslösning: 50 mM EDTA och 0,5% SDS i 200 mM Tris-HCl, pH 7,5
- Pipettera 7 l lyseringslösning på toppen av cellsuspensionen och försiktigt rör om med pipettspetsen att blanda lösningar. Inkubera i 2 minuter för cell-lys för att fortsätta.
- Tilt diabilder till 15 ° så att fibrerna att sprida sig längs bilden.
- När fibern lösningen har nått botten på bilden, placera den vågrätt för att lufttorka. Efter torkning ska en tunn, genomskinlig linje syns längs bilden. Vid det här laget bör i början av sträckte fibrerna vara märkta med en penna som efter färgning linjen inte kommer att vara synlig längre. Detta märke kommer senare hjälp att hitta fibrerna under mikroskop.
4. Immunofluorescens färgning
Ämnen: metanol, ättiksyra, HCl, 5% BSA i PBS, färgning burk, anti-BrdU (mus) antikropp,anti-BrdU (råtta)-antikroppar, får anti-mus Cy3 antikropp, get anti-råtta Alexa Fluor 488 antikropp, Vectashield monteringsmedium, täckglas, nagellack
- Sänk ned objektglasen i metanol / ättiksyra (3:1) i en färgning burk och inkubera i 10 minuter.
- Tvätta objektglasen i destillerat H 2 O, sedan fördjupa sig i 2,5 M HCl i 80 minuter.
- Tvätta diabilder tre gånger i PBS i 5 minuter.
- Ta bort bilder från färgning burken och samla upp läckande PBS med en pappershandduk. Placera bilderna horisontellt och pipettera 5% BSA på toppen av varje bild. Täck glider försiktigt med ett täckglas för att sprida BSA jämnt över bilden och inkubera i 20 minuter.
- Späd primära antikroppar i 5% BSA i följande nivåer: 1:25 mot BrdU (mus) och 1:400 mot BrdU (råtta).
- Flytta täckglas försiktigt ner glasskiva för att ta bort det. Applicera inte kraft om locket glida fastnar på bild. Bilden kan vara uppblött i PBS tills täckglas blir löst ettd kan tas bort med lätthet. Samla upp överflödig BSA med hushållspapper och placera bilderna horisontellt. Pipettera 50 ìl av den primära antikroppen lösningen på varje bild. Täck igen med ett täckglas för att sprida antikroppen lösningen jämnt över bilden och inkubera i en fuktig kammare i 2 timmar.
- Efter att de täckglasen, tvätta glasen tre gånger i PBS i 5 minuter
- Späd sekundära antikroppar i 5% BSA i följande nivåer: 1:500 får anti-mus Cy3 och 1:400 get anti-råtta Alexa Fluor 488.
- Applicera 50 ìl av sekundär antikropp lösningen som beskrivs för den primära antikroppar. Skydda bilderna från ljus och inkubera i 1 timme.
- Efter att de täckglasen, tvätta glasen tre gånger i PBS i 5 minuter.
- Tillsätt en droppe Vectashield monteringsmedium på varje bild och lägg på ett täckglas. Tryck försiktigt täckglas och avlägsna överflödig vätska runt den med en pappershandduk. Täta täckglas med transparent spiken polish och låt dem torka. Lagra bilderna vid -20 ° C.
5. Bild förvärv
Material: fluorescensmikroskop, kamera
Placera en droppe immersionsolja på en bild nära penna markera och börja lokalisera fibrer. Vanligtvis finns det en huvudsaklig fiber bunt, men dessa fibrer är alltför intrasslad och kan inte analyseras senare. Flytta bort från de största bunten för att hitta områden där fibrerna är tydligt separerade från varandra (Fig. 2). Vi skulle välja bilder bara använder en färgkanal för att undvika bias. Sen skulle vi ta ungefär 10 bilder på varje tidpunkt, koncentration eller cellinje. Men beror antalet bilder på hur många fibrer kan räknas på varje bild. Röra sig längs bilden för att ta olika bilder, som ett område av en bild inte kan ge representativa fiber längder eller strukturer replikering.
6. Dataanalys
Material: Bild analys program, t.ex. ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ )
Importera bilder till en bild analys program. Mät längder av fiber avtal och / eller räkna olika replikering strukturer (Fig. 3). Bara räkna fibrer som är klart synliga och som inte sträcker sig över kanten på bilden. Vi mäter typiskt längd på ca 100 fibrer och räkna 150-200 replikering strukturer och vi skulle upprepa enskilda experiment minst tre gånger.
7. Representativa resultat:
Nyligen replikeras DNA kan visualiseras som rader av antikropp märkt nukleotidanaloger. I våra experiment en pågående gaffel representeras som angränsande röda och gröna signaler (Fig. 3). Den dubbla märkningen Protokollet gör det också möjligt för oss att definiera fyra stora klasser av replikering strukturer: 1) ny initiering händelser kan indelas ED i ursprung som har avlossats medan celler inkuberades med den första etiketten och ursprung som har avfyrats under inkubation med den andra etiketten. Den tidigare består av angränsande grön-röd-grön signaler och den senare av en grön linje bara. 2) uppsägning händelser manifesteras som gränsar till röd-grön-röda signaler. 3) varvat ursprung är platser i arvsmassan med tätt ursprung. Sådana webbplatser består av varandra följande ursprung och signaler uppsägning. 4) beroende på experimentell design, stannade / kollapsade gafflar kan antingen definieras som en röd enda signal 7 eller en röd linje följt av en kort grön tarmkanalen 8,9.
Använda de villkor som beskrivs här, vildtyp DT40 celler har en genomsnittlig gaffel hastighet av 0,4 ìm / min. Vi kan upptäcka cirka 63% pågående gafflar, 10% ursprung, 16% stannade gafflar (röd bara skrifter), 8% uppsägningar och 3% varvas fibrer.
ure 1 "/>
. Figur 1 (A) Den vänstra sidan av den tecknade skildrar första steget i DNA-märkning förfarande: lägga IDU att exponentiellt växande DT40 celler leder nukleotid-analog vara lätt integreras i den nyligen syntetiserade ledande och eftersläpande DNA-strängar. Detta kan visualiseras med hjälp av en specifik antikropp, och kommer att visas som en röd linje när de ses i mikroskop. Därefter är det samma procedur upprepas med CldU som visas på höger sida av bilden. Efter inkubation med den andra nukleotid-analog, kommer en aktiv gaffel synas som en närliggande röd-grön-tarmkanalen. Den genomsnittliga fiberlängd är proportionell mot inkubationstiden för nukleotidanaloger. (B) DNA från lyserade DT40 celler sträcks av gravitationen på ett objektsglas och införlivas nukleotidanaloger visualiseras genom användning av specifika antikroppar och fluorescensmikroskopi.
igure 2 "/>
Figur 2. En representant fluorescens bilden visar fibrer från vildtyps DT40 celler därefter märkt med IDU och CldU i 20 minuter vardera. De flesta av fibrerna är väl separerade från varandra och kan därmed enkelt analyseras. Den vita stapeln visar 10 mikrometer.
. Figur 3 dubbel-märkning fiber tekniken gör att man kan skilja mellan olika replikering strukturer, 1 - aktivt replikera gafflar, 2 - nya platser för DNA-replikation (bränning av nya ursprung), 3 - gaffel uppsägningar (två konvergerande gafflar), 4 - varvas fibrer (i nätverket tätt placerade ursprung) och 5 - stannade gafflar (röd bara signal).
Discussion
Vi beskriver en metod som möjliggör kvantitativ analys av parametrar som påverkar DNA-syntesen under S-fas vid en enda molekyl nivå. Under de senaste tio åren har olika versioner av DNA-fiber RADIOFOTOGRAFERING teknik som utvecklats för att visualisera flödet av enskilda replikering gafflar i levande celler. Den kritiska parametern i alla dessa tekniker är det förfarande som används för att uppnå bästa möjliga sträckningen av DNA på glasytor ger väl separerade DNA fibrer. Ett viktigt steg för att uppnå detta är inkubationstiden av cellsuspensionen på objektglas samt lys tid. Dessa parametrar är beroende av temperatur och luftflöde i en viss labb och bör bestämmas empiriskt. Den praktiska delen av en DNA-fiber experiment vanligen genomförda inom ett dygn. Det är dock följande bild insamling och analys mer tidskrävande och kräver övning.
Märkningen protokollet kan justerasApted att svara på olika vetenskapliga problem: att använda en agent som stör replikering under den andra pulsen märkning monitorer gaffel töjning / stopp som svar på replikationsförmåga stress. I detta scenario inte den första etiketten inte behöver tvättas ut som den andra nukleotid läggs i överskott. Alternativt kan läkemedel som hämmar replikationen användas i kombination eller strax efter tillägg av den första etiketten. Detta kräver den första etiketten och läkemedlet tas bort innan den andra nukleotid-analog tillämpas. Detta förfarande gör att man kan avgöra betydelsen av olika faktorer DNA-reparation på replikationsförmåga gaffel stabilitet / återhämtning under förhållanden med replikationsförmåga stress (dvs. gaffel motorstopp och / eller kollaps). Anmärkningsvärt, kan en mer detaljerad analys av uppgifter om DNA-replikation programmet utföras med hjälp av ett alternativa metoder som kombinerar DNA kamning och fluorescens in situ hybridisering. Detta är dock tekniskt mer utmanande och kräver utgifteromfattande utrustning.
Förmågan att kvalitativt och kvantitativt analysera uppgifter om DNA-replikation ger ett viktigt verktyg för att undersöka defekter i DNA-replikation sig liksom de vägar som undertrycker genomisk instabilitet i samband med replikering gafflar. Utan tvekan kommer denna analys bidra till att ytterligare belysa mekanismerna för replikering-medierad DNA-reparation som gör att normala celler att reagera / anpassa sig till förändringar i miljön samt hur cancerceller använder dessa mekanismer att motstå toxicitet av läkemedel riktade replikering gafflar.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar Dr T. Helleday och Dr E. Petermann för hjälp med fiber-tekniken samt medlemmar i lab för hjälpsamma diskussion. WN stöds av en Senior International Research Fellowship från föreningen för internationell cancerforskning och av den polska statliga kommittén för vetenskaplig forskning bevilja (N301 165.935).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum gold (FBS) | PAA Laboratories | A15-151 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA Laboratories | P11-010 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 21875 | |
| 5-Iodo-2’-deoxyuridine (IdU) | Sigma-Aldrich | I7125 | |
| 5-Chloro-2’-deoxy-uridine (CldU) | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| Microscope slides SuperFrost | VWR international | 631-0910 | |
| Cover slips No1 | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3234 | |
| Vectashield mounting medium | H-1000 Vector lab | H-1000 | |
| Anti-BrdU antibody (mouse) | BD Biosciences | 347580 | |
| Anti-BrdU antibody (rat) | Abcam | ab6326 | |
| sheep anti-mouse Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | |
| goat anti-rat Alexa Fluor 488 antibody | Invitrogen | A110060 |
References
- Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40. Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).
- Petes, T. D., Williamson, D. H. Fiber autoradiography of replicating yeast DNA. Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).
- Takeuchi, F. Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells. Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).
- Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).
- Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells. EMBO. J. 29, 806-818 (2010).
- Saribasak, H., Arakawa, H.
- Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses. Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).
- Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair. Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).
- Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40. Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).
