Summary
DT40, ein Modell Wirbeltieren genetische System bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur Funktion von Proteinen zu analysieren. Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die qualitative Analyse der Parameter, die DNA-Synthese Einfluss während der S-Phase in DT40 Zellen bei der Ebene einzelner Moleküle erlaubt.
Abstract
Wartung von Replikationsgabel Stabilität ist von größter Bedeutung für sich teilende Zellen lebensfähig zu erhalten und Krankheiten vorzubeugen. Die Prozesse sorgen nicht nur für Gläubige Genomduplikation in das Gesicht von endogenen und exogenen DNA-Schäden, sondern auch verhindern, dass genomische Instabilität, einem anerkannten ursächlicher Faktor bei der Tumorentstehung.
Hier beschreiben wir eine einfache und kostengünstige Fluoreszenzmikroskopie-basierte Methode zur DNA-Replikation in den Vogelgrippe B-Zell-Linie DT40 zu visualisieren. Diese Zelllinie ist ein leistungsstarkes Tool, um Protein-Funktion in vivo durch reverse Genetik in Vertebraten-Zellen 1 zu untersuchen. DNA-Faser Fluorographie in DT40 Zellen fehlt ein bestimmtes Gen ermöglicht es, die Funktion dieses Genprodukt in der DNA-Replikation und Stabilität des Genoms aufzuklären. Traditionelle Methoden zur Replikationsgabel Dynamik in Zellen von Wirbeltieren zu analysieren verlassen sich auf die Messung der Gesamtrate der DNA-Synthese in einer Population von Puls-markierten Zellen. Dies ist ein quantitativer Ansatz und nicht für die qualitative Analyse der Parameter, die DNA-Synthese beeinflussen können. Im Gegensatz dazu kann die Geschwindigkeit der Bewegung des aktiven Gabel direkt verfolgt werden, wenn Sie die DNA-Faser-Technik 2-4. In diesem Ansatz wird entstehenden DNA in vivo durch den Einbau von Halogen-Nukleotiden (Abb. 1A) gekennzeichnet. Anschließend werden einzelne Fasern auf einen Objektträger gestreckt, und die markierte DNA-Replikation Verträge werden mit spezifischen Antikörpern angefärbt und im Fluoreszenzmikroskop (Abb. 1B). Initiation der Replikation sowie Gabel Ausrichtung wird durch die fortgesetzte Verwendung von zwei unterschiedlich modifizierten Analoga bestimmt. Darüber hinaus die Dual-Label-Ansatz für die quantitative Analyse von Parametern, die DNA-Synthese Einfluss während der S-Phase ermöglicht, dh Replikation Strukturen wie laufende und installiert Gabeln, Replikationsursprung Dichte sowie Gabel Kündigungen. Schließlich können die experimentellen Verfahren werden erreichened innerhalb eines Tages, und erfordert nur allgemeiner Laborgeräte und einem Fluoreszenz-Mikroskop.
Protocol
Die hier beschriebene Methode wurde in der folgenden Publikation verwendet: Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5..
1. DT40 Zellkultur
Materialien: fötales Rinderserum (FBS), Huhn Serum, Penicillin / Streptomycin, 2-Mercaptoethanol, RPMI
- Bereiten Zellkulturmedium: add 7% FBS, 3% Hühnerserum, 1x Penicillin / Streptomycin und 10 uM 2-Mercaptoethanol in RPMI Medium.
- DT40 Zellen werden in sterile Zellkulturflaschen bei 38 ° C gezüchtet und 5% CO 2 in einem befeuchteten Inkubator. Split-Zellen jeden Tag bis zu einer Dichte von 5 x 10 5 Zellen / ml 6.
2. In-vivo-Markierung
Materialien: IdU, CldU
- Stammlösungen von Nukleotid-Analoga: Man löst IdU bis 5 mm und CldU bis 2,5 mM in Medium. Hitze beide Lösungen kurz auf 60 ° C und vortexen, bis die NukleotidanalogDie Werte sind völlig aufgelöst.
- Add IdU bis zu einer Endkonzentration von 25 uM bis exponentiell wachsenden DT40 Zellen und mischen die Zellsuspension gut. Inkubieren Zellen für 20 Minuten bei 38 ° C und 5% CO 2.
- Nach der Inkubation mit dem ersten Etikett, fügen CldU bis zu einer Endkonzentration von 250 uM und behandeln Zellen als in den vorherigen Schritt beschrieben.
- Wash-Zellen mit eiskaltem PBS resuspendieren und sie in einer Konzentration von 7,5 x 10 5 Zellen / ml in kaltem PBS. Halten Sie die markierten Zellen auf Eis.
Die Kennzeichnung beschriebene Verfahren ist nur ein Vorschlag und kann modifiziert werden, um spezifische Fragen zu beantworten sein. Bitte beachten Sie die Diskussion für weitere Informationen auf experimentelles Design.
3. Zell-Lyse und DNA Verbreitung
Material: Glas Dias, Faser-Lyse-Lösung
- Bereiten Sie die Faser Lyse-Lösung: 50 mM EDTA und 0,5% SDS in 200 mM Tris-HCl, pH 7,5
- Pipettieren 7 ul Lyse-Lösung auf der Zellsuspension und vorsichtig mit der Pipettenspitze auf die Lösungen zu mischen rühren. Inkubieren für 2 Minuten für die Zell-Lyse, um fortzufahren.
- Tilt Dias bis 15 °, damit die Fasern entlang der Folie verteilen.
- Sobald die Faser-Lösung der Unterseite der Folie erreicht hat, legen Sie sie horizontal an der Luft trocknen. Nach dem Trocknen sollte eine dünne, opake Linie sichtbar entlang der Folie. An dieser Stelle sollte der Beginn der gestreckten Fasern mit einem Bleistift als nach dem Färben wird die Linie nicht mehr sichtbar gekennzeichnet sein. Dieses Zeichen wird später helfen, die Fasern unter dem Mikroskop zu finden.
4. Immunfluoreszenzfärbung
Materialien: Methanol, Essigsäure, HCl, 5% BSA in PBS, Küvette, anti-BrdU (Maus)-Antikörper,anti-BrdU (Ratte)-Antikörper, Schaf-anti-Maus-Cy3 Antikörper, Ziege-anti-Ratte Alexa Fluor 488 Antikörper, Vectashield Eindeckmedium, Deckgläser, Nagellack
- Tauchen Sie gleitet in Methanol / Essigsäure (3:1) in einer Küvette und inkubieren für 10 Minuten.
- Waschen Sie die Objektträger in destilliertem H 2 O, dann tauchen in 2,5 M HCl für 80 Minuten.
- Waschen Sie die Objektträger dreimal in PBS für 5 Minuten.
- Die Objektträger aus der Küvette und sammeln überschüssige PBS mit einem Papiertuch. Setzen Sie die Dias horizontal und Pipette 5% BSA übereinander gleiten. Decken Sie die Folien vorsichtig mit einem Deckglas auf die BSA gleichmäßig über die Folie und inkubieren für 20 Minuten.
- Verdünnen Sie die primären Antikörper in 5% BSA in den folgenden Konzentrationen: 1:25 anti-BrdU (Maus) und 1:400 anti-BrdU (Ratte).
- Bewegen Sie das Deckglas vorsichtig ins Glas Folie, um sie zu entfernen. Bitte keine Gewalt anwenden, wenn das Deckglas klebt an der Folie. Die Folie kann in PBS rehydriert werden, bis das Deckglas wird locker eind kann leicht entfernt werden. Sammeln Sie überschüssige BSA mit einem Papiertuch und Objektträger horizontal. Pipet 50 ul der Primärantikörper-Lösung auf jeder Folie. Deckel wieder mit einem Deckglas auf die Antikörper-Lösung gleichmäßig über die Folie und inkubieren in einer feuchten Kammer für 2 Stunden.
- Nach dem Entfernen der Deckgläser, waschen Sie die Objektträger dreimal in PBS für 5 Minuten
- Verdünnen Sie die Sekundärantikörper in 5% BSA in den folgenden Konzentrationen: 1:500 Schaf Anti-Maus-Cy3 und 1:400 Ziegen-anti-Ratte Alexa Fluor 488.
- Übernehmen 50 ul der sekundären Antikörper-Lösung als für den primären Antikörper beschrieben. Schützen Sie die Folien aus Licht und Inkubation für 1 Stunde.
- Nach dem Entfernen der Deckgläser, waschen Sie die Objektträger dreimal in PBS für 5 Minuten.
- Fügen Sie einen Tropfen Vectashield Eindeckmedium auf jeder Folie auftragen und Deckglas. Drücken Sie vorsichtig die Deckgläser und die überschüssige Flüssigkeit entfernt um sie mit einem Papiertuch. Seal Deckgläser mit transparenten Nagel polish und trocknen lassen. Bewahren Sie die Objektträger bei -20 ° C.
5. Bildaufnahme
Materialien: Fluoreszenz-Mikroskop, Kamera
Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf eine Folie in der Nähe der Bleistift und starten Auffinden der Fasern. In der Regel gibt es eine Haupt-Faserbündel, aber diese Fasern sind zu verstrickt und kann später nicht mehr analysiert werden. Entfernen Sie sich von der Haupt-Bundle zu Bereichen, in denen Fasern deutlich voneinander (Abb. 2) sind getrennt zu finden. Wir würden uns wählen Bilder nur mit einem Farbkanal, um Verzerrungen zu vermeiden. Dann würden wir etwa 10 Bilder von jedem Zeitpunkt, Konzentrations-oder Zell-Linie. Allerdings hängt die Anzahl der Bilder auf, wie viele Fasern können auf jedes Bild gezählt werden. Bewegen Sie sich entlang der Folie, um die verschiedenen Bilder zu machen, wenn ein Bereich einer Folie nicht liefern können Vertreter Faserlängen oder Replikation Strukturen.
6. Datenanalyse
Materialien: Picture-Analyse-Programm, z. B. ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ )
Importieren von Bildern in ein Bild-Analyse-Programm. Messen Sie die Länge der Nervenbahnen und / oder die Anzahl der verschiedenen Replikations-Strukturen (Abb. 3). Nur zählen Fasern, die deutlich sichtbar und welche nicht über den Rand des Bildes zu erweitern sind. Wir messen typischerweise die Länge von etwa 100 Fasern und zählen 150-200 Replikation Strukturen und wir würden wiederholen einzelnen Versuchen mindestens dreimal.
7. Repräsentative Ergebnisse:
Neu replizierte DNA kann als Linien von Antikörper-markierten Nukleotid-Analoga visualisiert werden. In unseren Experimenten eine laufende Gabel ist neben roten und grünen Signale (Abb. 3) dargestellt. Die doppelte Kennzeichnung Protokoll erlaubt uns auch, vier große Klassen von Replikation Strukturen zu definieren: 1) neue Einleitung Ereignisse können divid werden ed in Herkunft, die ausgelöst werden, während die Zellen mit dem ersten Label und Herkunft, die während der Inkubation mit dem zweiten Label gefeuert haben inkubiert haben. Erstere bestehen aus benachbarten Grün-Rot-Grün-Signale und die letztere von einer grünen Linie. 2) Kündigung Ereignisse manifestieren sich als angrenzende rot-grün-roten Signalen. 3) durchsetzt Ursprünge sind Stellen im Genom mit eng beieinander liegenden Ursprünge. Solche Seiten bestehen aus aufeinander Herkunft und Stopp-Signale. 4) je nach experimentellem Design, gekippt / zusammengebrochen Gabeln kann entweder als nur rot-Signal 7 oder eine rote Linie durch einen kurzen grünen Trakt 8,9 gefolgt definiert werden.
Mit den hier beschriebenen Bedingungen, Wildtyp DT40 Zellen haben eine durchschnittliche Gabel Geschwindigkeit von 0,4 mu m / min. Wir können erkennen, etwa 63% laufenden Gabeln, 10% Herkunft, 16% ins Stocken geraten Gabeln (red nur Flächen), 8% Kündigungen und 3% durchsetzt Fasern.
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. Abbildung 1 (A) Die linke Seite der Karikatur zeigt den ersten Schritt der DNA-Markierung vor: Zugabe IdU exponentiell wachsenden DT40 Zellen führt das Nukleotid-Analogon zu leicht in die neu synthetisierten und nacheilenden DNA-Stränge eingebaut werden. Dies kann durch Verwendung eines spezifischen Antikörpers sichtbar gemacht werden, und wird als eine rote Linie angezeigt, wenn unter dem Mikroskop betrachtet. Anschließend wird die gleiche Prozedur mit CldU wiederholt auf der rechten Seite der Abbildung dargestellt. Nach der Inkubation mit dem zweiten Nukleotid-Analogon, wird eine aktive Gabel sichtbar sein als eine angrenzende Rot-Grün-Darm-Trakt. Die durchschnittliche Faserlänge ist proportional zur Inkubationszeit der Nukleotid-Analoga. (B) DNA aus lysierten DT40 Zellen wird durch die Schwerkraft auf einen Objektträger gestreckt und die inkorporierte Nukleotid-Analoga werden visualisiert durch die Verwendung von spezifischen Antikörpern und Fluoreszenzmikroskopie.
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Abbildung 2. Ein Vertreter Fluoreszenzbild zeigt Fasern, die aus Wildtyp DT40 Zellen anschließend mit IdU und CldU für jeweils 20 Minuten markiert. Die meisten Fasern sind gut voneinander getrennt und können somit leicht analysiert werden. Der weiße Balken repräsentiert 10 pm.
. Abbildung 3 Die Doppel-Kennzeichnung Faser Technik erlaubt es, zwischen verschiedenen Replikation Strukturen zu unterscheiden; 1 - aktiv repliziert Gabeln, 2 - neue Standorte der DNA-Replikation (Abfeuern von neuen Wurzeln), 3 - Gabel Kündigungen (zwei konvergierenden Gabeln), 4 - durchsetzt Fasern (Seiten von eng beieinander liegenden Ursprünge) und 5 - ins Stocken geraten Gabeln (nur rot-Signal).
Discussion
Wir beschreiben eine Methode, die für die quantitative Analyse von Parametern, die DNA-Synthese während der Einfluss der S-Phase zu einem einzelnen Molekül ermöglicht. In den vergangenen zehn Jahren wurden verschiedene Versionen der DNA-Faser Fluorographie Technik entwickelt, um die Bewegung der einzelnen Replikationsgabeln in lebenden Zellen sichtbar zu machen. Die kritischen Parameter in allen diesen Techniken ist das Verfahren verwendet werden, um den bestmöglichen Streckung der DNA auf Glasflächen bietet der Bereich getrennt DNA Fasern zu erreichen. Ein entscheidender Schritt, um dies zu erreichen, ist die Inkubationszeit der Zellsuspension auf dem Objektträger sowie Lyse Zeit. Diese Parameter sind abhängig von der Temperatur und der Luftstrom in einem bestimmten Labor und sollten empirisch ermittelt werden. Der praktische Teil eines DNA-Faser-Experiment ist in der Regel innerhalb eines Tages durchgeführt. Allerdings ist die nachträgliche Bild Erfassung und Analyse mehr Zeit in Anspruch und erfordert Übung.
Die Kennzeichnung Protokoll kann ad werdenApted zu verschiedenen wissenschaftlichen Fragestellungen zu beantworten: mit Hilfe eines Agenten, der mit der Replikation stört während der zweite Puls Kennzeichnung überwacht Gabel Dehnung / Abwürgen in Reaktion auf replikativen Stress. In diesem Szenario wird das erste Etikett muss nicht als das zweite Nukleotid gewaschen werden im Überschuss zugegeben. Alternativ können Medikamente, die die Replikation behindern in Kombination oder auch nur nach der Zugabe des ersten Etiketts verwendet werden. Dies erfordert das erste Etikett und das Medikament vor dem zweiten Nukleotid-Analogon entfernt werden angewandt wird. Dieses Verfahren erlaubt es, die Bedeutung der verschiedenen DNA-Reparatur-Faktoren auf replikativen Gabel Stabilität / Recovery unter den Bedingungen der replikativen Stress (zB Gabel Abwürgen und / oder Kollaps) zu bestimmen. Bemerkenswert ist, könnte eine genauere Analyse der Angaben der DNA-Replikation Programm mit der Verwendung eines alternativen Ansätzen kombiniert DNA Kämmen und die Fluoreszenz in situ Hybridisierung durchgeführt werden. Dies ist jedoch technisch anspruchsvoll und erfordert teuresive Anlagen.
Die Fähigkeit, qualitativ und quantitativ zu analysieren Angaben der DNA-Replikation bietet ein wesentliches Instrument für die Untersuchung von Defekten in der DNA-Replikation selbst als auch die Wege, die genomische Instabilität mit Replikationsgabeln assoziiert zu unterdrücken. Zweifellos wird dieser Test weiter helfen, Licht auf die Mechanismen der Replikation-vermittelten DNA-Reparatur, die normalen Zellen zu reagieren / Anpassung an Veränderungen der Umwelt und wie Krebszellen nutzen diese Mechanismen, um die Toxizität von Medikamenten, die an Replikationsgabeln widerstehen können vergossen.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir danken Dr. T. Helleday und Dr. E. Petermann für die Hilfe bei der Faser-Technik sowie die Mitglieder des Labors für hilfreiche Diskussionen. WN wird von einem Senior International Research Fellowship von der Association for International Cancer Research und vom polnischen Staat Committee for Scientific Research Grant (N301 165935) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum gold (FBS) | PAA Laboratories | A15-151 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA Laboratories | P11-010 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 21875 | |
| 5-Iodo-2’-deoxyuridine (IdU) | Sigma-Aldrich | I7125 | |
| 5-Chloro-2’-deoxy-uridine (CldU) | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| Microscope slides SuperFrost | VWR international | 631-0910 | |
| Cover slips No1 | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3234 | |
| Vectashield mounting medium | H-1000 Vector lab | H-1000 | |
| Anti-BrdU antibody (mouse) | BD Biosciences | 347580 | |
| Anti-BrdU antibody (rat) | Abcam | ab6326 | |
| sheep anti-mouse Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | |
| goat anti-rat Alexa Fluor 488 antibody | Invitrogen | A110060 |
References
- Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40. Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).
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