Summary
DT40, um sistema de vertebrados modelo genético, fornece uma ferramenta poderosa para analisar a função da proteína. Aqui nós descrevemos um método simples que permite a análise qualitativa dos parâmetros que influenciam a síntese de DNA durante a fase S em células DT40 no nível única molécula.
Abstract
Manutenção da estabilidade de forquilha de replicação é de extrema importância para dividir células para preservar a viabilidade e prevenir a doença. Os processos envolvidos não só garantir a duplicação do genoma fiéis em face de danos no DNA endógenos e exógenos, mas também evitar a instabilidade genômica, um fator causador reconhecido no desenvolvimento do tumor.
Aqui, nós descrevemos um microscópio baseada simples e cost-effective de fluorescência método para visualizar a replicação do DNA na linha de células B aviária DT40. Esta linhagem celular fornece uma poderosa ferramenta para investigar a função da proteína in vivo por genética reversa em células de vertebrados 1. DNA fluorography fibra em DT40 células falta um gene específico permite elucidar a função deste produto gene na replicação do DNA e estabilidade do genoma. Métodos tradicionais para analisar a dinâmica do garfo de replicação em células de vertebrados dependem de medir a taxa global de síntese de DNA em uma população de pulso marcado com células. Esta é uma abordagem quantitativa e não permite a análise qualitativa dos parâmetros que influenciam a síntese de DNA. Em contraste, a taxa de movimento de garfos ativo pode ser seguido diretamente ao utilizar a técnica de fibra de DNA 2-4. Nesta abordagem, o DNA nascente é rotulado in vivo por incorporação de nucleotídeos halogenados (Fig 1A). Posteriormente, as fibras individuais são esticadas sobre uma lâmina de microscópio, e os tratos replicação rotulados de DNA são marcadas com anticorpos específicos e visualizados por microscopia de fluorescência (Figura 1B). Início da replicação, bem como direcionalidade garfo é determinada pelo uso consecutivo de dois análogos de forma diferente modificada. Além disso, a abordagem rotulagem dupla permite a análise quantitativa dos parâmetros que influenciam a síntese de DNA durante a fase S, as estruturas de replicação ou seja, como garfos em andamento e paralisadas, a densidade de origem de replicação, bem como rescisões garfo. Finalmente, o procedimento experimental pode ser realizared em um dia, e requer apenas equipamentos de laboratório geral e um microscópio de fluorescência.
Protocol
O método descrito aqui foi usado na seguinte publicação: Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5..
1. DT40 cultura de células
Materiais: soro fetal bovino (FBS), frango soro, penicilina / estreptomicina, 2-mercaptoetanol, RPMI
- Prepare meio de cultura celular: FBS adicionar 7%, 3% de soro de frango, 1x penicilina / estreptomicina e 10 mM 2-mercaptoetanol para meio RPMI.
- DT40 células são cultivadas em frascos de cultura de células estéreis, a 38 ° C e 5% de CO 2 em uma incubadora umidificada. Dividir células todos os dias para uma densidade de 5 x 10 5 células / ml 6.
2. Na rotulagem vivo
Materiais: UDI, CldU
- Preparar soluções estoque de nucleótidos: dissolver UDI a 5 mM e 2,5 mM para CldU no meio. Calor ambas as soluções rapidamente para 60 ° C e vortex até que o análogo dos nucleótidosues são dissolvidos completamente.
- Adicionar UDI a uma concentração final de 25 mM para crescimento exponencial DT40 células e mistura da suspensão de células também. Incubar as células durante 20 minutos a 38 ° C e 5% CO 2.
- Após a incubação com a primeira etiqueta, adicione CldU para uma concentração final de 250 mM e tratar células, como descrito no passo anterior.
- Lavar as células com PBS gelado e ressuspenda-los em uma concentração de 7,5 x 10 5 células / ml em PBS frio. Manter as células rotuladas no gelo.
O procedimento de classificação e rotulagem é apenas uma sugestão e pode ser modificado para tratar de questões específicas. Por favor, consulte a seção de discussão para obter mais informações sobre design experimental.
3. Lise celular e DNA se espalhando
Materiais: lâminas de vidro, fibra de solução de lise
- Prepare a solução de lise de fibras: 50 mM EDTA e SDS 0,5% em 200 mM Tris-HCl, pH 7,5
- Pipeta 7 mL de solução de lise no topo da suspensão de células e agitar suavemente com a ponta da pipeta para misturar as soluções. Incubar por 2 minutos para lise celular para prosseguir.
- Tilt slides de 15 ° para permitir que as fibras se espalhar ao longo do slide.
- Uma vez que a solução de fibra atingiu o fundo do slide, colocá-lo horizontalmente para secar ao ar. Após a secagem, uma linha fina, opaca deve ser visível ao longo do slide. Neste ponto, o início das fibras esticadas devem ser marcadas com um lápis como depois da coloração da linha não será visível por mais tempo. Esta marca irá mais tarde ajudar a localizar as fibras sob o microscópio.
4. Imunofluorescência
Materiais: metanol, ácido acético, HCl, BSA 5% em PBS, tina de coloração, anti-BrdU anticorpos (mouse),anticorpo anti-BrdU (rato), ovinos anti-rato Cy3 de anticorpos, de cabra anti-rato Alexa Fluor 488 anticorpos, Vectashield meio de montagem, lamínulas, unha polonês
- Imergir as lâminas em metanol / ácido acético (3:1) em uma tina de coloração e incubar por 10 minutos.
- Lavagem das lâminas em água destilada H 2 O, em seguida, mergulhar em 2,5 M HCl por 80 minutos.
- Lavagem das lâminas três vezes em PBS por 5 minutos.
- Retirar as lâminas da tina de coloração e recolher PBS excesso com uma toalha de papel. Colocar as lâminas na horizontal e BSA pipeta de 5% em cima de cada slide. Cobrir os slides suavemente com uma lamela para espalhar a BSA uniformemente sobre a lâmina e incubar por 20 minutos.
- Diluir os anticorpos primários em BSA 5% nas seguintes concentrações: 1:25 anti-BrdU (mouse) e 1:400 anti-BrdU (rato).
- Mover a lamela suavemente a lâmina de vidro para removê-lo. Não force se a lamínula adere ao slide. O slide pode ser reidratados em PBS até a lamela fica solto umd pode ser removido com facilidade. Coletar BSA excesso com uma toalha de papel e coloque os slides na horizontal. Pipete 50 da solução de anticorpo primário em cada slide. Cubra novamente com uma lamela para espalhar a solução de anticorpos uniformemente sobre a lâmina e incubar em câmara úmida por 2 horas.
- Depois de retirar as lamelas, lavar as lâminas três vezes em PBS por 5 minutos
- Diluir os anticorpos secundários em BSA 5% nas seguintes concentrações: 1:500 ovelhas anti-rato Cy3 e 1:400 de cabra anti-rato Alexa Fluor 488.
- Aplicar 50 ul da solução de anticorpo secundário como descrito para os anticorpos primários. Proteger os slides da luz e incubar por 1 hora.
- Depois de retirar as lamelas, lavar as lâminas três vezes em PBS por 5 minutos.
- Adicionar uma gota de Vectashield meio de montagem em cada slide e uma lamela. Pressione suavemente as lamelas e remover o excesso de fluido em torno dele com uma toalha de papel. Lamínulas selo com unhas transparente polish e deixe-os secar. Armazenar os slides a -20 ° C.
5. Aquisição de imagem
Materiais: microscópio de fluorescência da câmera,
Coloque uma gota de óleo de imersão em uma corrediça de perto da marca de lápis e começar a localizar as fibras. Normalmente, há um feixe de fibras principais, mas essas fibras são muito preso e não pode ser analisada mais tarde. Afastar-se do feixe principal para encontrar áreas onde as fibras são claramente separados uns dos outros (Fig. 2). Gostaríamos de selecionar fotos usando apenas um canal de cor a fim de evitar viés. Então, levaria cerca de 10 fotos de cada linha de concentração ponto, ou de células da hora. No entanto, o número de imagens depende de quantas fibras podem ser contadas em cada imagem. Se movem ao longo do slide para tirar as fotos diferentes, como uma área de um slide pode não fornecer comprimentos de fibra representante ou estruturas de replicação.
6. A análise dos dados
Materiais: programa de análise de imagem, por exemplo, ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ )
Importar imagens em um programa de análise de imagem. Medir o comprimento dos feixes de fibras e / ou contar as estruturas de replicação diferentes (Fig. 3). Só contam as fibras que são claramente visíveis e que não se estendem ao longo da borda da imagem. Normalmente, medir o comprimento de cerca de 100 fibras e contagem de 150-200 estruturas de replicação e gostaríamos de repetir experiências individuais, pelo menos, três vezes.
7. Resultados representativos:
DNA recém-replicada pode ser visualizado como linhas de anticorpo marcado com nucleótidos. Em nossos experimentos um garfo em curso é representado como adjacentes sinais vermelho e verde (Fig. 3). O protocolo a dupla marcação também nos permite definir quatro classes principais de estruturas de replicação: 1) eventos de iniciação novo pode ser divid ed em origens que dispararam enquanto as células foram incubadas com o rótulo de primeiro e origens que dispararam durante a incubação com o rótulo de segundo. O primeiro consiste de vizinhos verde-vermelho-verde e os últimos sinais de uma linha verde só. 2) manifestar-se como eventos de rescisão adjacentes vermelho-verde-vermelho sinais. 3) intercaladas origens são os locais no genoma com origens espaçados. Esses sites consistem de origens consecutivos e sinais de terminação. 4) dependendo do projeto experimental, parado / garfos colapso pode ser definido como um sinal vermelho apenas 7 ou uma linha vermelha seguido de um intervalo curto verde 8,9.
Usando as condições aqui descritas, as células do tipo selvagem DT40 têm uma velocidade de garfo média de 0,4 mM / min. Podemos detectar aproximadamente 63% garfos em curso, a origem de 10%, 16% garfos parado (vermelho folhetos apenas), terminações 8% e 3% de fibras intercaladas.
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. Figura 1 (A) O lado esquerdo do desenho animado retrata o primeiro passo do processo de rotulagem DNA: a adição de UDI para crescimento exponencial DT40 células leva o análogo de nucleotídeo para ser facilmente incorporados ao líder recém-sintetizado e atraso fitas de DNA. Isto pode ser visualizado utilizando um anticorpo específico, e será exibido como uma linha vermelha quando visto sob o microscópio. Posteriormente, o mesmo procedimento é repetido com CldU como mostrado no lado direito da figura. Após a incubação com o análogo de nucleotídeo segundo, um garfo de ativos será visível como um trato vermelho-verde adjacente. O comprimento médio de fibra é proporcional ao tempo de incubação da nucleótidos. (B) o DNA de células lisadas DT40 é esticada por gravidade para uma lâmina de microscópio e os análogos de nucleotídeos incorporados são visualizados através da utilização de anticorpos específicos e de microscopia de fluorescência.
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Figura 2. A imagem representativa mostra de fluorescência de fibras de tipo selvagem DT40 células posteriormente rotulados com UDI e CldU por 20 minutos cada. A maioria das fibras são bem separadas umas das outras e podem, portanto, ser facilmente analisado. A barra branca representa 10 mM.
. Figura 3 A técnica de fibra rotulagem dupla permite distinguir entre as estruturas de replicação diferentes; 1 - garfos ativamente replicar, 2 - novos locais de replicação do DNA (disparo de novas origens), 3 - terminações fork (dois garfos convergentes), 4 - fibras intercaladas (sites de origens espaçados) e 5 - garfos parado (único sinal vermelho).
Discussion
Nós descrevemos um método que permite a análise quantitativa dos parâmetros que influenciam a síntese de DNA durante a fase S em um nível única molécula. Nos últimos dez anos, diferentes versões da técnica de DNA fluorography fibra foram desenvolvidos para visualizar o movimento de garfos de replicação individuais dentro de células vivas. O parâmetro crítico em todas estas técnicas é o procedimento utilizado para alcançar o melhor possível alongamento de DNA em superfícies de vidro fornecendo fibras bem separados DNA. Um passo crucial para atingir este é o tempo de incubação da suspensão de células sobre a lâmina de microscópio, bem como tempo de lise. Estes parâmetros dependem da temperatura e fluxo de ar em um laboratório particular e deve ser determinada empiricamente. A parte prática de uma experiência de fibra DNA é tipicamente realizada em um dia. No entanto, a aquisição de imagem e posterior análise é mais demorado e requer prática.
O protocolo de rotulagem podem ser adApted para responder a vários problemas científicos: usando um agente que interfere com a replicação durante a rotulagem segundo pulso monitores alongamento garfo / stalling em resposta ao estresse replicativo. Neste cenário, o primeiro rótulo não precisa ser lavada como o segundo nucleotídeo é adicionado em excesso. Alternativamente, as drogas que impedem a replicação pode ser usado em combinação ou apenas após a adição da primeira etiqueta. Isto requer a primeira etiqueta e que a droga a ser removido antes do segundo nucleotídeo análogo é aplicado. Este procedimento permite determinar a importância dos fatores de reparo de DNA em vários estabilidade replicativa garfo / recuperação sob condições de estresse replicativo (garfo ou seja, estagnação e / ou colapso). Notável, uma análise mais detalhada dos elementos do programa de replicação do DNA pode ser realizada com o uso de uma combinação de abordagens alternativas DNA pentear ea hibridização fluorescente in situ. Isso, entretanto, é tecnicamente mais desafiador e requer despesassive equipamentos.
A capacidade de analisar qualitativa e quantitativamente elementos da replicação do DNA fornece uma ferramenta essencial para a investigação de defeitos na replicação do DNA em si, bem como os caminhos que suprimem instabilidade genômica associada com garfos de replicação. Sem dúvida, este ensaio continuará a ajudar a lançar luz sobre os mecanismos de replicação mediada reparo de DNA que permitem que as células normais para responder / se adaptar às mudanças ambientais, bem como a forma como células de câncer de utilizar estes mecanismos para resistir à toxicidade de drogas que alvejam garfos de replicação.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos ao Dr. T. Helleday e Dr. E. Petermann para ajudar com a técnica de fibras, bem como os membros do laboratório para discussão útil. WN é apoiado por uma Bolsa de Investigação Sênior Internacional da Associação Internacional para Pesquisa do Câncer e pelo Comitê de Estado polaco de Investigação Científica de subvenção (N301 165935).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum gold (FBS) | PAA Laboratories | A15-151 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA Laboratories | P11-010 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 21875 | |
| 5-Iodo-2’-deoxyuridine (IdU) | Sigma-Aldrich | I7125 | |
| 5-Chloro-2’-deoxy-uridine (CldU) | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| Microscope slides SuperFrost | VWR international | 631-0910 | |
| Cover slips No1 | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3234 | |
| Vectashield mounting medium | H-1000 Vector lab | H-1000 | |
| Anti-BrdU antibody (mouse) | BD Biosciences | 347580 | |
| Anti-BrdU antibody (rat) | Abcam | ab6326 | |
| sheep anti-mouse Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | |
| goat anti-rat Alexa Fluor 488 antibody | Invitrogen | A110060 |
References
- Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40. Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).
- Petes, T. D., Williamson, D. H. Fiber autoradiography of replicating yeast DNA. Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).
- Takeuchi, F. Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells. Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).
- Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).
- Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells. EMBO. J. 29, 806-818 (2010).
- Saribasak, H., Arakawa, H.
- Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses. Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).
- Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair. Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).
- Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40. Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).
