Summary
此方法允许EpiAirways，初级人类呼吸道上皮组织生长在气 - 液界面，生物有关延长细菌共同培养的表征
Abstract
Nontypeable 流感嗜血杆菌 （NTHI）是人类适应革兰氏阴性菌，可引起复发和慢性感染的呼吸道粘膜1 2。要研究的机制，这些生物生存和呼吸组织内，一个是必需的，可以进行长期成功的细菌和人类细胞的共培养模式。我们使用初级人类呼吸道上皮组织，提高气 - 液界面，EpiAirway模型（MatTek，阿什兰，马萨诸塞州）。这些都是非永生化，分化良好，3维的组织，包含紧密连接，纤毛和nonciliated细胞，杯状细胞产生的粘蛋白，并保留产生细胞因子对感染的反应能力。
有关这种生物在人类上呼吸道的体外模型可以用在许多方面;这种方法的总体目标是，随着时间的推移执行长期NTHI和定量EpiAirway组织共培养细胞相关的和内在的细菌。同时，受感染的共同文化的生产和粘蛋白，细胞因子的个人资料才能确定。这种方法提高了，许多当前的协议后，现有的方法，利用人体细胞淹没单层或Transwell小文化，这是不能够支持长时间的细菌感染超过3。例如，如果一个有机体，可以在覆媒体复制，这可能导致在宿主细胞的细胞毒性和损失不可接受的水平，逮捕了实验。 EpiAirway模型允许长期宿主 - 病原体相互作用的特性。此外，由于EpiAirway源是人体正常细胞，而不是一个永生行气管支气管，每一个实际人类上呼吸道组织的优秀代表，在结构和功能4 ，。
对于这种方法，EpiAirway组织断奶2天交货前的抗微生物和抗真菌化合物，和所有的程序都无抗生素的条件下进行。这就需要特殊的考虑，因为这两种细菌和小学的人体组织在同一生物安全柜使用，并长时间共同培养。
Protocol
1。为EpiAirway组织准备生物安全柜
- 穿着专用的白大褂，头发绑背和手套，开始层流。 5分钟后，将在内阁（移液器，小技巧，离心管等），任何一方的工具，喷洒生物安全柜内部和窗框用70％乙醇，并用干净的纸巾擦拭。用70％乙醇再次喷洒清洁的室内，并留下来干。干净的一侧移动工具和重复乙醇的过程。
- 在内阁中的气溶胶屏障枪头和专用的移液器。要使用单独包装的无菌血清移液器，通过层流插入年底，破开，滑入机柜的吸管，丢弃的包装外面。
- EpiAirway插入必须用无菌镊子处理。放置6英寸的细尖弧形分割成自我封闭消毒袋和高压灭菌镊子。准备足够的至少有6个每天准备使用。
2。开箱EpiAirway组织
- 喷雾用70％乙醇在生物安全柜的工作表面，并用干净的纸巾擦拭。喷一遍，让表面干燥，使用前。打开EpiAirway盒和丢弃的发泡胶及包装材料。
- EpiAirway不含抗生素的维护媒体，AIR - 100 - MM的亚洲债券基金（MM），是专有的MatTek在插入套件发送。在生物安全柜，媒体类型和日期的标签六个无菌的50 mL离心管，并松开帽。喷雾用70％乙醇的媒体的瓶子，并打开机柜内的。分装成每管每使用一个新的血清无菌吸管管25毫升的MM，收紧的上限，并储存在4 ° C使用新鲜的MM等分的每一天。
- 重复上述新鲜瓶使用1 ×贝科的磷酸盐缓冲液（D - PBS）与钙和镁的2.2。再次重复使用的D - PBS无钙和镁的。所有分装保存在4 ° C。
- EpiAirway插入空气- 100到达在24孔板中，在4 ° C的固体培养基含有琼脂糖中，必须放置到6孔板使用。标签的日期和使用乙醇耐标记的描述，每块板。将1毫升到每口井的4℃EpiAirway的MM。删除其包装，喷以70％的乙醇和生物安全柜中进行，运输板块。取出磁带和开放的板块。使用高压灭菌镊子，取出EpiAirway插入潮湿的纱布。
- 拿起与使用，扭转运动，以帮助释放琼脂糖蒸压钳插入，并将其放置到6孔板以及。一些琼脂糖可能会坚持到插入的，特别是运输板的温度升高到环境。使用无菌棉签小心地取出插入琼脂糖。避免接触的膜，并检查，无气泡下方插入被困。放入5％的CO 2饱和湿度37℃培养箱中培养板。
- 允许至少24小时的组织，以平衡前开始联合培养的孵化器。
3。 EpiAirway组织维修
- 使用高压灭菌镊子，拿起一个插入，轻轻吸液管200微升预热的D - PBS到组织中的钙和镁的岩石插入。倾斜角度的插入和对持有膜插入底部的塑料环，无菌P1000的枪头。请勿触摸的组织。吸的D - PBS漂洗，并放入一个标记的无菌离心管。样品可以冷冻在-20 ° C，并在稍后的日期为粘蛋白和/或细胞因子的表达的测定。
- 更改基础MM每天吸和替换用1毫升的新鲜MM。每口井使用一个新的障碍枪头。治疗用10％漂白粉的使用媒体过夜，并丢弃。
4。接种EpiAirway组织
- nontypeable 流感嗜血杆菌 （NTHI）从冰冻甘油的新鲜培养了数到巧克力琼脂。成长在加湿5％ 二氧化碳培养箱中培养过夜。
- 第二天，在预热的D - PBS重悬与钙和镁的OD（600 nm）的约0.7 NTHI单菌落。涡大力前的光密度测量。光密度的关系，集落形成单位每毫升（CFU / ml的）的NTHI，外径为0.2（600纳米）约等于1.0 × 10 8 CFU /毫升。因此，外径为0.7（600 nm）的约3.5 × 10 8 CFU / ml的。每个NTHI应变，以接种前，应验证该算法。
- EpiAirway组织AIR - 100是生长在插入了0.6厘米和0.4微米膜的表面积。组织是由〜8.0 × 10 5〜1.0 × 10 6 </ SUP>细胞。因此，接种1.0 × 10 7 CFU对应的多重感染了大约10 - 12。接种，冲洗每3.1 EpiAirway插入，然后加入28微升4.2准备在生物安全柜中的每个EpiAirway插入根尖表面的细菌悬液。不要接种基底MM。返回每块板的孵化器。
5。量化NTHI接种
- 0.1％的明胶（PBS - G），高压灭菌消毒，准备一个磷酸盐缓冲液（PBS）的解决方案。标签无菌的1.5 ml Eppendorf管所需1:10稀释成每管接种和分装900微升无菌PBS - G OD（600 nm）的基础。
- 确定枚举接种NTHI巧克力琼脂板的数量。这些板块上下颠倒放置在空气孵化器与上半盘一小时休息的底部。这将使板块既温暖至37 ° C，表面干燥，促进NTHI下降电镀。
- 开始串行1:10稀释的菌悬液加入100微升4.2管头的接种。涡每个稀释大力前5秒，使未来。下降到预热和表面干燥的巧克力琼脂平板10微升等份，每个稀释度板的一半的使用。可容纳五至六个10微升等分之一，每100毫米的钢板的一半，而无需运行起来。当干燥，倒挂在加湿37 ° C的CO 2培养箱中过夜。
- 第二天，确定CFU / ml的计数稀释，每下降15-30独特的殖民地和计算您的实际可行的NTHI接种。
6。长期合作的文化与NTHI
- 每隔24小时，洗净的插入，然后在3.1池已接种一脉相承的细菌和冻结在-20 ° C在一个标记的离心管，供日后分析每个组织的洗涤。这些样本可检测粘蛋白斑点杂交或用ELISA细胞因子的表达。此外，组织可以为mRNA的收获，并可以就感兴趣的基因进行定量PCR。更改基底MM每天在3.2。继续进行共培养时间。
7。收获EpiAirway组织
- 准备一个新鲜的1％皂素的解决方案，在没有钙和镁的D - PBS，过滤消毒和温暖至37 ° C。
- 没有钙和镁的温暖的MM和另一个D - PBS管50毫升至37 ° C。
- 准备在5.1稀释管，以及一个空的无菌的1.5 ml Eppendorf管中，每插入，与插入的数目和NTHI应变标记。
- 可收获的EpiAirways任总细胞相关的细菌，其中包括壁和内化的生物体，或只有内在的细菌。
- 巧克力琼脂平板上确定的数量，需要下拉板细胞相关或入侵NTHI，标签和一小时，在空气干燥的孵化器为5.2。
- 收获总细胞相关的细菌，200微升的D - PBS无钙或镁的EpiAirways根尖表面冲洗三次，然后插入倾斜和任何剩余的MM从基底膜冲洗。先洗可以冻结，为以后的分析;丢弃以下的清洗。
- 从7.1到每个组织的根尖表面，放置在一个新的6孔没有MM平板洗插入，和吸液管250微升无菌的1％皂素的解决方案。孵化器10分钟。
- 从孵化器中取出，并使用无菌P1000的枪头，磨砂膜的组织，使用一回的往复运动，圆周运动，删除插入的边缘组织。使用大口径的无菌P1000的枪头，放入7.3编写的空标记管悬挂。插入到根尖表面无钙或镁中加入250微升的D - PBS。
- 检查插入一个倒置相差显微镜，以确定是否有任何剩余的组织收割。如果需要的话，再次与P1000的另一个无菌枪头擦洗，然后添加7.8管悬挂使用大口径的无菌P1000的枪头。管1毫升使用的D - PBS无钙或镁的总量。
- 大力旋涡细胞悬液，在一分钟的最高时速。使用无菌装上了26号针头的1 ml注射器，通过针头注射器吸进暂停。慢慢穿过针3次暂停，注意不要创建气泡。涡大力为一分钟再次。
- 进入第7编写的稀释管大口径枪头，100微升的暂停使用。3。涡大力五秒钟，然后使串行1:10稀释。落板的上表面干燥的巧克力琼脂平板所需的稀释。
- 收获内在的细菌，洗3次，用200微升的D - PBS无钙或镁每个插入。保留和冻结先洗。硫酸庆大霉素的终浓度为100微克/ ml预热的MM。准备1.5毫升收割每次插入媒体。替换与含有庆大霉素的MM基础毫米，300微升含有庆大霉素的MM添加到根尖表面。将板回一小时到的CO 2培养箱。
- 删除从根尖表面含有庆大霉素的MM和洗根尖表面和基底膜广泛预热的D - PBS无钙和镁的插入。继续在7.7-7.11。
8。代表性的成果：
扫描电子显微镜（A）的未受感染的EpiAirway组织和（二）组织的为期5天的文化合作与NTHI后如图1所示。，不造成重大损害的心尖的长期文化合作与NTHI组织，强调了实用的EpiAirway模型。描绘以上的时间内组织量化的内在细菌的数量是一个图 ，如图2所示，结果是相当重现，EpiAirway 组织一致和生物体外培养的人体上呼吸道模型相关研究NTHI宿主-病原体相互作用。
图1。EpiAirway组织扫描电子显微镜。 A.未感染控制组织。 B.组织后，共培养5天，与NTHI。在受感染的组织观察根尖表面无重大损害。
图2 NTHI内在随着时间的推移，在EpiAirway合作文化。 R2866菌株接种在约1.0 × 10 7 CFU /插入（0天），然后在每一个指定的时间点的内在细菌收获。条代表N = 3至少在重复复制。误差棒的SD。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这种方法允许的长期宿主 - 病原体相互作用的首要人权组织在气 - 液界面的呼吸生物学相关背景调查。在这里，我们使用了感染的有机体NTHI，但用这种方法可以量化的任何细菌的相互作用，不引入不可接受的细胞毒作用随着时间的推移。 EpiAirway模式也可以被用于研究病毒，药物或化学物质，影响人类的上呼吸道5 6 7 8。我们一直保持着超过40天，与NTHI感染的组织至少10天未感染的组织。我们预计，如果需要的话，受感染的组织可以显着延长维持。
这种方法的局限性是类似于任何体外模型，其中包括一个主管在这些组织中的免疫系统无法重建。虽然组织的日常清洗，以模仿正常的粘液纤毛清除功能，建立在这些组织生产的粘蛋白的一个自然的出口将更为可取9。此外，接触NTHI被称为诱导人呼吸道上皮细胞的粘蛋白的表达，加剧了问题 10 。另一方面，每天EpiAirway洗可以保存和检测的蛋白质或酶的利益活动，增加了一个重要的维度的方法，并增加其实用性。
在这种方法的成功性能的一个关键步骤是组织机械破碎下降，电镀NTHI（步长7.10）。 EpiAirways是由于高度分化和多种类型的细胞组成，组织不容易瓦解作为细胞单层后，即使皂素治疗。此外，NTHI是出了名的敏感的化合物，在分类组织的援助。因此，我们已经发现，通过了26号针头的细胞悬液，大大提高了我们的的能力产生一致且可重复的内在或细胞相关的细菌的定量。
一旦掌握这项技术，它也可以被用来调查突变的菌株的相对生存的能力相比，其野生型的父母，让研究者刻画特定的基因突变的影响。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们想感谢帕特里克海登（MatTek），有益的讨论和利比的佐治亚州健康科学大学为他们的EM技能的罗伯特史密斯和佩里。这项研究是由NIDCD授予DC010187到DAD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saponin | Calbiochem | 558255-25GM | 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium | Lonza Inc. | 17-513Q | |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium | Lonza Inc. | 17-515Q | |
| EpiAirway antibiotic-free tissues | MatTek Corp. | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway antibiotic-free maintenance media | MatTek Corp. | AIR-100-MM-ABF | Supplied with kit |
| 10X phosphate-buffered saline solution | EMD Millipore | 6506 | Dilute to 1X before use |
| Gelatin | JT Baker | 2124-01 | Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave |
| Difco GC Medium Base (chocolate agar) | VWR international | 90002-016 | Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C |
| BBL Hemoglobin (chocolate agar) | VWR international | 90000-662 | Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above |
| BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) | VWR international | 90000-414 | Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates |
| Dissecting forceps, fine tip, curved | VWR international | 82027-406 | |
| Self-sealing sterilization pouches | VWR international | 89140-802 | |
| Gentamicin sulfate, 10 mg/ml | Lonza Inc. | 17-519Z | Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill |
References
- Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
- Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children. Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).
- Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells. Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).
- Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies. J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).
- Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium. Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).
- Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components. Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).
- Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin. Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).
- Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicology. 244, 66-76 (2008).
- Fahy, J. V., Dickey, M. D. Airway mucus function and dysfunction. N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).
- Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -D. Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi. 359, 691-696 (2007).
