Summary
Deze methode maakt het mogelijk karakterisering van bacteriële uitgebreide co-cultuur met EpiAirways, primaire menselijke luchtwegen epitheelweefsel geteeld op de lucht-vloeistof interface, een biologisch relevante
Abstract
Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) zijn mens-aangepast Gram-negatieve bacteriën die kunnen leiden tot recidiverende en chronische infecties van de luchtwegen mucosa 1, 2. Om de mechanismen die deze organismen overleven op en in de luchtwegen weefsels, een model waarin succesvolle lange-termijn co-cultuur van bacteriën en menselijke cellen kan worden uitgevoerd is vereist studie. We maken gebruik van primaire menselijke luchtwegen epitheelweefsels verhoogd tot de lucht-water grensvlak, de EpiAirway model (MatTek, Ashland, MA). Dit zijn niet-vereeuwigd, goed gedifferentieerde, 3-dimensionale weefsels die tight junctions, trilharen en nonciliated cellen, cellen die beker mucine produceren, en behouden de mogelijkheid om cytokines te produceren in reactie op de infectie in te dammen.
This biologisch relevante in vitro model van het menselijk bovenste luchtwegen kan worden gebruikt in een aantal manieren, de algemene doelstelling van deze methode is op lange termijn co-cultuur van EpiAirway weefsels met NTHi en kwantificeren cel-geassocieerd en geïnternaliseerde bacteriën uit te voeren in de tijd . Ook kunnen mucine de productie en het cytokine profiel van de geïnfecteerde co-culturen worden bepaald. Deze aanpak verbetert de bestaande methoden in dat veel van de huidige protocollen gebruiken ondergedompeld monolayer of Transwell culturen van menselijke cellen, die niet geschikt zijn voor bacteriële infecties gedurende langere perioden 3. Bijvoorbeeld, als een organisme kan repliceren in de bovenliggende media, kan dit leiden tot onaanvaardbare niveaus van de cytotoxiciteit en verlies van gastheercellen, de arrestatie van de experiment. Het EpiAirway model maakt het mogelijk de karakterisering van de lange termijn gastheer-pathogeen interacties. Verder, omdat de bron voor de EpiAirway is normaal menselijk tracheobronchiale cellen in plaats van een onsterfelijk lijn, elk is een uitstekende weergave van de werkelijke menselijke bovenste luchtwegen weefsel, zowel in structuur en in functie 4.
Voor deze methode, de EpiAirway weefsels zijn gespeend van anti-microbiële en anti-schimmel verbindingen voor twee dagen voorafgaand aan de levering, en alle procedures worden uitgevoerd onder antibiotica-vrije omstandigheden. Dit vereist speciale overwegingen, omdat zowel bacteriën en primaire menselijke weefsels worden gebruikt in dezelfde bioveiligheid kast, en zijn co-gekweekt voor langere perioden.
Protocol
1. De voorbereiding van de bioveiligheid kabinet voor de EpiAirway weefsels
- Het dragen van een dedicated laboratoriumjas, met haar rug gebonden en handschoenen aan, start de laminaire stroming. Na 5 minuten, geen gereedschap bewegen in de kast (pipetten, tips, centrifugebuizen, etc.) naar een kant, spuit de bioveiligheid kast interieur en sjerp met 70% ethanol en veeg af met een schone papieren handdoeken. Weer Spray de gereinigde interieur met 70% ethanol en laat het drogen. Verplaats de tools om de schone kant en herhaal de ethanol procedure.
- Gebruik spuitbussen barrière pipetpunten en toegewijde pipetten in de kast. Voor het gebruik van individueel verpakte steriele serologische pipetten, langs de aangesloten einde door de laminaire stroming, breken open, en schuif de pipet in de kast, waarbij de verpakking buiten.
- De EpiAirway inserts moet worden behandeld met een steriele pincet. Plaats 6-inch fijn-tip gebogen ontleden tang in zelfsluitende sterilisatieverpakkingen en autoclaaf. Bereid genoeg om ten minste zes per dag klaar voor gebruik.
2. Uitpakken van de EpiAirway weefsels
- Spray het werkblad in de bioveiligheid kast met 70% ethanol en veeg af met een schone papieren handdoeken. Spray weer en laat het oppervlak drogen voor gebruik. Open de EpiAirway doos en gooi de piepschuim en verpakkingsmateriaal.
- De EpiAirway antibiotica-vrij onderhoud media, AIR-100-MM ABF (MM), is eigendom van MatTek en wordt verstuurd in de kit met de inserts. In de bioveiligheid kabinet, het etiket zes steriele 50 ml centrifugebuizen met de media aard en datum, en draai de doppen. Spray de media fles met 70% ethanol en open in de kast. Aliquot 25 ml van MM in elke buis met behulp van een nieuwe steriele serologische pipet voor elke buis, draai de doppen, en bewaar bij 4 ° C. Gebruik een verse hoeveelheid van MM per dag.
- Herhaal 2,2 boven het gebruik van een verse fles 1 X Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (D-PBS) met calcium en magnesium. Herhaal nogmaals met behulp van D-PBS zonder calcium en magnesium. Bewaar alle monsters bij 4 ° C.
- De EpiAirway inserts AIR-100 komen in een 24-well plaat staan bij 4 ° C op vaste media-bevattende agarose, en moet geplaatst worden in 6-well platen voor gebruik. Label elke plaat met de datum en de beschrijving met behulp van een ethanol-resistente marker. Plaats een milliliter van 4 ° C EpiAirway MM in elk putje. Verwijder het transport plaat uit de verpakking, spray met 70% ethanol, en plaats in de bioveiligheid kast. Verwijder de tape en open de plaat. Met behulp van geautoclaveerd tang, verwijder de natte gaasje op de EpiAirway inserts.
- Pick-up een insert met geautoclaveerd pincet met een draaiende beweging om te helpen bij het vrijgeven van het uit de agarose, en plaats in een put van een 6-wells plaat. Sommige agarose kunnen houden aan de voegen, vooral omdat de temperatuur van het transport plaat toe aan het omgevingslicht. Gebruik een steriel wattenstaafje om zorgvuldig de agarose uit de voegen. Vermijd het aanraken van het membraan, en controleer dat er geen luchtbellen gevangen zitten onder de inserts. Plaats de plaat in een vochtige 37 ° C incubator met 5% CO 2.
- Laat minstens 24 uur voor de weefsels in de incubator equilibreren vóór het begin van co-culturen.
3. Onderhoud van EpiAirway weefsels
- Met behulp van geautoclaveerd tang, pick-up een insert en voorzichtig 200 microliter van de voorverwarmde D-PBS pipet met calcium en magnesium op het weefsel en rock van de in te voegen. Kantel de insert in een hoek en plaats uw steriele P1000 pipetpunt tegen de plastic ring, dat het membraan aan de onderkant van de insert bevat. Raak het weefsel. Zuig het D-PBS spoelen en te plaatsen in een gelabelde steriele cryovial. Monsters kunnen worden ingevroren bij -20 ° C en getest op mucine-en / of cytokine-expressie op een later tijdstip.
- Wijzig de basale MM dagelijks door opzuigen en het vervangen met 1 milliliter van verse MM. Gebruik een nieuwe barrière pipettip voor elk putje. 'S nachts Behandel de gebruikte media met 10% bleekmiddel en gooi deze weg.
4. Enten van EpiAirway weefsels
- Streak uit een verse cultuur van nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) van bevroren glycerol voorraad op chocolade-agar. Grow 's nachts in een bevochtigde 5% CO 2 incubator.
- De volgende dag, resuspendeer enkele kolonies van NTHi in voorverwarmde D-PBS met calcium en magnesium aan een OD (600 nm) van ongeveer 0,7. Vortex krachtig voorafgaand aan het meten van de optische dichtheid. De relatie van de optische dichtheid aan kolonievormende eenheden per ml (CFU / ml) van NTHi is dat een OD (600 nm) van 0,2 ongeveer 1,0 x 10 8 CFU / ml is gelijk. Daarom is een OD (600 nm) van 0,7 is ongeveer 3,5 x 10 8 CFU / ml. Dit algoritme dient te worden gevalideerd voor elke NTHi stam voorafgaand aan de inenting.
- De EpiAirway weefsels AIR-100 worden gekweekt op wisselplaten met een oppervlakte van 0,6 cm 2 en een 0,4 micron membraan. De weefsels zijn samengesteld uit ~ 8,0 x 10 ~ 5 tot 1,0 x 10 6 </ Sup> cellen. Daarom is een inenting van 1,0 x 10 7 CFU komt overeen met een multipliciteit van infectie van ongeveer 10 - 12. Te inoculeren, elk EpiAirway invoegen als in 3.1 spoelen, voeg dan 28 microliter van de bacteriële suspensie bereid in 4.2 aan de apicale oppervlak van elk EpiAirway insert in de bioveiligheid kast. Niet inoculeren de basale MM. Keer terug elke plaat naar de incubator.
5. Kwantificering van de NTHi inoculum
- Bereid een fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)-oplossing met 0,1% gelatine (PBS-G), autoclaaf te steriliseren. Label steriele 1,5 ml Eppendorf buisjes met de gewenste 01:10 verdunningen op basis van de OD (600 nm) van het inoculum en de hoeveelheid 900 microliter van de steriele PBS-G in elke buis.
- Bepaal het aantal van de chocolade agar platen nodig is om de geënte NTHi opsommen. Plaats deze platen in een lucht-incubator op zijn kop met de onderkant van de plaat rust op de helft van de top voor een uur. Hierdoor kan de plaat zowel warm tot 37 ° C en de oppervlakte te drogen, het vergemakkelijken van de drop-beplating van NTHi.
- Start de seriële 1:10 verdunningen van het inoculum door het toevoegen van 100 microliter van de bacteriële suspensie van 4,2 op de eerste buis. Vortex iedere verdunning krachtig gedurende 5 seconden voorafgaand aan het maken van de volgende. Drop 10 microliter aliquots op de voorverwarmde en oppervlakte-gedroogde chocolade agar platen, met behulp van de helft van de plaat voor elke verdunning. Vijf tot zes 10 microliter aliquots kunnen passen op een helft van elk 100 mm plaat zonder stromend samen. Bij het droog is, plaats ondersteboven in een vochtige 37 ° C CO 2 incubator 's nachts.
- De volgende dag, bepalen de CFU / ml door het tellen van de verdunningen die 15 tot 30 verschillende kolonies in elke druppel te hebben en het berekenen van terug naar je werkelijke levensvatbare inoculum van NTHi.
6. Op lange termijn co-cultuur met NTHi
- Elke 24 uur, was de inserts als in 3.1, dan is het zwembad van het wassen van elk weefsel dat is ingeënt met dezelfde stam van bacteriën en invriezen bij -20 ° C in een gelabeld cryovial voor toekomstige analyse. Deze monsters kunnen worden getest op de aanwezigheid van mucine by dot vlekken of voor de expressie van cytokines door ELISA. Als alternatief kunnen weefsels worden geoogst voor mRNA en qPCR kan worden uitgevoerd op genen van belang zijn. Wijzig de basale MM dagelijks als in 3.2. Blijven voor de duur van de co-cultuur.
7. Oogsten van EpiAirway weefsels
- Bereid een vers 1% oplossing van saponine in D-PBS zonder calcium en magnesium, filter-steriliseren en warm tot 37 ° C.
- Warm een 50 ml buis van MM en een andere van D-PBS zonder calcium en magnesium tot 37 ° C.
- Bereid verdunning buizen als in 5.1, evenals een lege steriele 1,5 ml eppendorfbuisje per insert, voorzien van het nummer en NTHi stam.
- De EpiAirways geoogst kan worden voor hetzij de totale cel-geassocieerde bacteriën, waaronder zowel de aanhanger en geïnternaliseerde organismen, of voor geïnternaliseerde bacteriën.
- Bepaal het aantal van de chocolade agar platen die nodig is om drop-bord van de cel-geassocieerde of binnengevallen NTHi, label en droog gedurende een uur in een incubator lucht als in 5.2.
- Om de oogst totaal cel-geassocieerde bacteriën, spoel de apicale oppervlak van de EpiAirways drie maal met 200 microliter van D-PBS zonder calcium of magnesium, dan kantel de voegen en spoel de resterende mm van de basale membraan. De eerste wasbeurt kan worden ingevroren voor latere analyse, gooi de volgende wasbeurten.
- Leg de gewassen te voegen in een nieuwe 6-well plaat zonder MM, en pipet 250 microliter van de steriele 1% saponine-oplossing van 7,1 op de apicale oppervlak van elk weefsel. Keer terug naar de incubator voor 10 minuten.
- Haal ze uit de couveuse, en het gebruik van een steriele P1000 pipettip, scrub de weefsels van het membraan met behulp van een heen-en-weer gaande beweging, gevolgd door een draaiende beweging om het weefsel te verwijderen uit de randen van het in te voegen. Met behulp van een grote boring steriele P1000 pipetpunt, plaats de suspensie in de lege gemerkte buis opgesteld in 7.3. Voeg 250 microliter van D-PBS zonder calcium of magnesium op het apicale oppervlak van de voegen.
- Onderzoeken of het invoegen met behulp van een omgekeerde fase-contrast microscoop om te bepalen of er eventuele resterende weefsel om geoogst te worden. Indien nodig, opnieuw schrobben met een andere steriele P1000 pipetpunt, voeg dan deze opschorting aan de buis van 7,8 met behulp van een grote boring steriele P1000 pipetpunt. Breng het totale volume van de buis om een milliliter met behulp van D-PBS zonder calcium of magnesium.
- Krachtig vortex de celsuspensie op topsnelheid gedurende een minuut. Met behulp van een steriele 1 ml injectiespuit voorzien van een 26 gauge naald aspiratie de suspensie in de spuit door de naald. Langzaam gaan de suspensie door de naald 3 keer, waarbij zorg niet om luchtbellen te creëren. Vortex krachtig nogmaals gedurende een minuut.
- Met behulp van een grote boring pipetpunt, plaats 100 microliter van de suspensie in de eerste verdunning buis opgesteld in 7.3. Vortex krachtig gedurende vijf seconden, maak dan seriële 1:10 verdunningen. Drop-plaat de gewenste verdunningen op het oppervlak-gedroogde chocolade agar platen.
- Om de oogst geïnternaliseerde bacteriën, wassen elke insert 3 keer met 200 microliter van D-PBS zonder calcium of magnesium. Behouden en bevriezing van de eerste wasbeurt. Voeg gentamicinesulfaat aan voorverwarmde MM tot een uiteindelijke concentratie van 100 microgram / ml. Bereid 1,5 ml van de media per insert om geoogst te worden. Vervang de basale MM met de gentamicine-bevattende MM, en voeg 300 microliter van gentamicine-bevattende MM op het apicale oppervlak. Plaats de plaat terug in de CO 2 incubator gedurende een uur.
- Verwijder de gentamicine-bevattende MM uit het apicale oppervlak en was de apicale oppervlak en de basale membraan van de insert uitgebreid met voorverwarmd D-PBS zonder calcium en magnesium. Ga te werk zoals in 7.7-7.11.
8. Representatieve resultaten:
Scanning electronenmicroscoop van (A.) niet-geïnfecteerde EpiAirway weefsel en (B.) weefsel na een 5-daagse co-cultuur met NTHi zijn weergegeven in figuur 1. Op lange termijn co-cultuur met NTHi niet leidt tot aanzienlijke schade aan de apicale weefsels, het benadrukken van het nut van de EpiAirway model. Een grafiek die het aantal van de geïnternaliseerde bacteriën gekwantificeerd loop van de tijd binnen weefsels is weergegeven in figuur 2. Beide resultaten zijn vrij reproduceerbaar, waardoor de EpiAirway weefsels een consistente en biologisch relevante in vitro model van het menselijk bovenste luchtwegen in te studeren NTHi gastheer en ziekteverwekker interacties.
Figuur 1. Scanning elektronenmicroscopie van EpiAirway weefsels. A. niet-geïnfecteerde controle weefsel. B. Tissue na vijf dagen van co-cultuur met NTHi. Er geen significante schade aan de apicale oppervlak is waargenomen in het geïnfecteerde weefsels.
Figuur 2. Aantal NTHi geïnternaliseerde loop van de tijd tijdens de EpiAirway co-cultuur. Stam R2866 werd geïnoculeerd op ongeveer 1,0 x 10 7 CFU / insert (Dag 0), vervolgens geoogst voor geïnternaliseerde bacteriën op elk aangegeven tijdstip. Staven geven n = 3 repliceert in ten minste tweevoud. Error bars zijn SD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze methode maakt het mogelijk het onderzoek naar de lange termijn gastheer-pathogeen interacties in een biologisch relevante achtergrond van de primaire menselijke luchtwegen weefsels aan het lucht-vloeistof interface. Hier hebben we gebruikt NTHi als het infecterende organisme, maar de interactie van een bacterie die onaanvaardbare cytotoxiciteit niet te introduceren na verloop van tijd kunnen worden gekwantificeerd met deze methode. De EpiAirway model kan ook gebruikt worden voor de studie van virussen, drugs of chemische stoffen die invloed hebben op de menselijke bovenste luchtwegen 5, 6, 7, 8. We hebben gehandhaafd geïnfecteerde weefsels voor meer dan 40 dagen, en weefsels die besmet zijn met NTHi gedurende minstens 10 dagen. We verwachten dat geïnfecteerd weefsel kon worden gehandhaafd voor aanzienlijk langer, indien gewenst.
De beperkingen van deze methode zijn vergelijkbaar met die van een in vitro model, inclusief het onvermogen om reconstrueren een bevoegde immuunsysteem in deze weefsels. Hoewel het dagelijks wassen van de weefsels worden uitgevoerd naar de normale mucociliaire klaring na te bootsen, tot oprichting van een natuurlijke uitlaatklep voor de mucine geproduceerd in deze weefsels zou zijn wenselijk 9. Verder contact met de NTHi is bekend dat het mucine expressie te induceren in humane respiratoire epitheelcellen, verergeren het probleem 10. Aan de andere kant kan de dagelijkse EpiAirway wast worden opgeslagen en getest voor eiwitten of enzymatische activiteiten van belang, het toevoegen van een belangrijke dimensie toe aan de methode en het vergroten van het nut ervan.
Een belangrijke stap in de succesvolle uitvoering van deze methode is de mechanische verstoring van de weefsels voorafgaand aan de drop-plating de NTHi (stap 7,10). Omdat de EpiAirways zijn zeer gedifferentieerd en bestaat uit meerdere celtypen, de weefsels zijn niet zo makkelijk uit elkaar te vallen als een cel monolayer, zelfs na saponine behandeling. Daarnaast NTHi zijn notoir gevoelig voor stoffen die helpen bij het uiteenvallen van weefsels. Daarom hebben we gevonden dat het passeren van de celsuspensie door middel van een 26 gauge naald enorm ons vermogen om consistente en herhaalbare kwantificering van de geïnternaliseerde of cel-geassocieerde bacteriën te genereren verbetert.
Zodra deze techniek wordt beheerst, kan het ook worden gebruikt om de relatieve vermogen van mutante bacteriestammen om te overleven in vergelijking met hun wild-type ouders te onderzoeken, zodat de onderzoeker om de effecten van specifieke genetische mutaties te karakteriseren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen Patrick Hayden (MatTek) bedanken voor nuttige discussies, en Robert Smith en Libby Perry van Georgië Health Sciences University voor hun EM vaardigheden. Deze studie werd gefinancierd door het NIDCD, toont verlenen DC010187 naar DAD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saponin | Calbiochem | 558255-25GM | 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium | Lonza Inc. | 17-513Q | |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium | Lonza Inc. | 17-515Q | |
| EpiAirway antibiotic-free tissues | MatTek Corp. | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway antibiotic-free maintenance media | MatTek Corp. | AIR-100-MM-ABF | Supplied with kit |
| 10X phosphate-buffered saline solution | EMD Millipore | 6506 | Dilute to 1X before use |
| Gelatin | JT Baker | 2124-01 | Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave |
| Difco GC Medium Base (chocolate agar) | VWR international | 90002-016 | Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C |
| BBL Hemoglobin (chocolate agar) | VWR international | 90000-662 | Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above |
| BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) | VWR international | 90000-414 | Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates |
| Dissecting forceps, fine tip, curved | VWR international | 82027-406 | |
| Self-sealing sterilization pouches | VWR international | 89140-802 | |
| Gentamicin sulfate, 10 mg/ml | Lonza Inc. | 17-519Z | Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill |
References
- Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
- Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children. Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).
- Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells. Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).
- Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies. J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).
- Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium. Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).
- Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components. Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).
- Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin. Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).
- Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicology. 244, 66-76 (2008).
- Fahy, J. V., Dickey, M. D. Airway mucus function and dysfunction. N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).
- Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -D. Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi. 359, 691-696 (2007).
