Summary
Questo metodo permette la caratterizzazione di batteri estesa co-coltura con EpiAirways, primario dei tessuti epiteliali respiratorie umane cresciute all'interfaccia aria-liquido, un biologicamente rilevanti
Abstract
Nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) sono umani adattati batteri Gram-negativi che possono causare infezioni ricorrenti e croniche della mucosa respiratoria 1, 2. Per studiare i meccanismi con cui questi organismi sopravvivono e nei tessuti delle vie respiratorie, un modello in cui il successo a lungo termine co-coltura di batteri e cellule umane possono essere eseguite è necessario. Noi uso primario tessuti umani epiteliali delle vie respiratorie sollevato in aria-liquido, il modello EpiAirway (MatTek, Ashland, MA). Questi non sono immortalati, ben differenziato, 3-dimensionale dei tessuti che contengono le giunzioni strette, le cellule ciliate e nonciliated, cellule caliciformi che producono mucina, e conservare la capacità di produrre citochine in risposta alle infezioni.
Questo biologicamente rilevanti modello in vitro delle vie aeree superiori umana può essere utilizzato in diversi modi; l'obiettivo generale di questo metodo è quello di eseguire a lungo termine co-coltura di tessuti EpiAirway con NTHi e quantificare associato alle cellule dei batteri e interiorizzato nel tempo . Inoltre, la produzione mucina e il profilo delle citochine degli infetti co-culture può essere determinato. Questo approccio migliora metodi esistenti in molti protocolli attuali che utilizzano sommersi colture monostrato o Transwell di cellule umane, che non sono in grado di supportare le infezioni batteriche per lunghi periodi 3. Per esempio, se un organismo in grado di replicare sui media sovrastante, questo può portare a livelli inaccettabili di citotossicità e la perdita di cellule ospiti, arrestando l'esperimento. Il modello EpiAirway permette la caratterizzazione di lungo termine, interazioni ospite-patogeno. Inoltre, dato che l'origine per il EpiAirway è normale umano tracheo-bronchiali cellule piuttosto che una linea immortalato, ognuno è un'eccellente rappresentazione del reale tessuto umano del tratto respiratorio superiore, sia nella struttura e nella funzione 4.
Per questo metodo, i tessuti EpiAirway sono svezzati fuori di composti anti-microbico e anti-fungini per 2 giorni prima della consegna, e tutte le procedure vengono eseguite sotto antibiotico senza condizioni. Ciò richiede considerazioni particolari, in quanto sia i batteri e primario dei tessuti umani sono usati nello stesso armadio biosicurezza, e sono co-coltura per lunghi periodi.
Protocol
1. Preparazione del cabinet biosicurezza per i tessuti EpiAirway
- Indossando un camice da laboratorio dedicato, con i capelli raccolti sulla nuca e guanti, avviare il flusso laminare. Dopo 5 minuti, spostare qualsiasi strumento nell'armadio (pipette, consigli, provette da centrifuga, ecc) da un lato, spruzzare l'interno dell'armadio biosicurezza e fascia con il 70% di etanolo e pulire con tovaglioli di carta puliti. Spruzzare l'interno pulito di nuovo con il 70% di etanolo e lasciare asciugare. Spostare gli strumenti per il lato pulito e ripetere la procedura di etanolo.
- Usa aerosol puntali barriera e pipettatori dedicato nel gabinetto. Per utilizzare singolarmente in confezioni sterili pipette sierologiche, passare l'estremità chiusa attraverso il flusso laminare, rompere e far scorrere la pipetta nel cabinet, scartando la confezione esterna.
- Gli inserti EpiAirway devono essere maneggiati con pinze sterili. Posto da 6 pollici messa a punta ricurva dissezione pinze in autosigillanti buste sterilizzazione e autoclave. Preparare basta avere almeno sei al giorno pronti per l'uso.
2. Disimballaggio dei tessuti EpiAirway
- Spruzzare la superficie di lavoro nel quadro di biosicurezza con il 70% di etanolo e pulire con tovaglioli di carta puliti. Spruzzare nuovamente e lasciare asciugare la superficie prima dell'uso. Aprire la finestra di EpiAirway ed eliminare il polistirolo e materiale di imballaggio.
- L'antibiotico-multimediale gratuito manutenzione EpiAirway, AIR-100-MM ABF (MM), è di proprietà di MatTek e viene inviato nel kit con gli inserti. Nel quadro di biosicurezza, l'etichetta sei provette sterili 50 ml con il tipo di supporto e la data, e allentare i tappi. Spruzzare la bottiglia dei media con il 70% di etanolo e aperto all'interno del cabinet. Aliquota 25 ml di MM in ogni provetta utilizzando una nuova pipetta sterile sierologici per ogni tubo, serrare i tappi, e conservare a 4 ° C. Utilizzare una nuova aliquota di MM ogni giorno.
- Ripetere 2.2 sopra utilizzando una bottiglia fresca di 1 X Dulbecco PBS (D-PBS) con calcio e magnesio. Ripetere ancora una volta con D-PBS senza calcio e magnesio. Conservare tutte le aliquote a 4 ° C.
- Gli inserti EpiAirway AIR-100 arriva a un 24-pozzetti a 4 ° C su supporti solidi contenenti agarosio, e devono essere inseriti in 6 pozzetti per l'uso. Etichettare ogni piatto con la data e la descrizione con un etanolo resistente marcatore. Mettere 1 millilitro di 4 ° C MM EpiAirway in ciascun pozzetto. Rimuovere la piastra di trasporto dalla confezione, spruzzare con il 70% di etanolo, e posto nel gabinetto di biosicurezza. Rimuovere il nastro e aprire il piatto. Utilizzando pinze in autoclave, rimuovere la garza umida sopra gli inserti EpiAirway.
- Prendete un inserto con una pinza in autoclave con un movimento rotatorio per aiutare a rilasciarlo dal agarosio, e posto in un pozzo di un 6-pozzetti. Alcuni agarosio possono aderire al inserire, in particolare per quanto la temperatura della piastra di trasporto aumenta di ambiente. Utilizzare un tampone di cotone sterile per rimuovere con attenzione l'agarosio da inserire. Evitare di toccare la membrana, e verificare che non bolle d'aria intrappolate sotto gli inserti. Porre la piastra in un umidificata a 37 ° C incubatore con 5% di CO 2.
- Attendere almeno 24 ore per i tessuti per equilibrare nell'incubatore prima di iniziare co-culture.
3. Mantenimento dei tessuti EpiAirway
- Utilizzando pinze autoclave, prendere un inserto e delicatamente pipetta 200 microlitri di pre-riscaldato D-PBS con calcio e magnesio sul tessuto e rock l'inserto. Inclinare l'inserto in un angolo e posiziona il puntale sterile P1000 contro l'anello di plastica che tiene la membrana in fondo l'inserto. Non toccare il tessuto. Aspirare il D-PBS sciacquare e posto in una provetta Microbank ™ etichetta sterile. I campioni possono essere congelati a -20 ° C e analizzati per mucina e / o espressione di citochine in un secondo momento.
- Modificare il MM basale quotidianamente da aspirazione e la sua sostituzione con 1 millilitro di MM fresca. Usare un nuovo puntale barriera per ciascun pozzetto. Trattare i supporti utilizzati con il 10% di candeggina durante la notte e scartare.
4. Inoculazione dei tessuti EpiAirway
- Streak una coltura fresca di nontypeable Haemophilus influenzae (NTHi) dal magazzino glicerolo congelato su agar cioccolato. Crescere durante la notte in un umidificata al 5% CO 2 incubatore.
- Il giorno successivo, risospendere singole colonie di NTHi in pre-riscaldato D-PBS con calcio e magnesio ad un OD (600 nm) di circa 0,7. Energicamente prima di misurare la densità ottica. La relazione tra densità ottica di unità formanti colonia per ml (CFU / ml) di NTHi è che un OD (600 nm) di 0,2 equivale a circa 1,0 x 10 8 UFC / ml. Pertanto, un OD (600 nm) dello 0,7 è di circa 3,5 x 10 8 UFC / ml. Questo algoritmo deve essere convalidato per ogni ceppo NTHi prima dell'inoculazione.
- I tessuti EpiAirway AIR-100 sono coltivate su inserti con una superficie di 0,6 cm 2 e una membrana di 0,4 micron. I tessuti sono composti di circa 8,0 x 10 5 a ~ 1,0 x 10 6 </ Sup cellule>. Pertanto, un inoculo di 1,0 x 10 7 CFU corrisponde a una molteplicità di infezione di circa 10 - 12. Per inoculare, lavare ogni inserto EpiAirway come in 3.1, quindi aggiungere 28 microlitri della sospensione batterica preparato in 4.2 alla superficie apicale di ciascun frutto EpiAirway nell'armadio biosicurezza. Non inoculare il MM basale. Ritorna ogni piatto per l'incubatrice.
5. Quantificazione dell'inoculo NTHi
- Preparare un tampone fosfato salino (PBS) soluzione con 0,1% di gelatina (PBS-G), autoclave per sterilizzare. Etichetta sterili da 1,5 ml provette Eppendorf con le diluizioni 1:10 auspicate in base alla OD (600 nm) del 900 microlitri inoculo e aliquota del PBS sterile-G in ciascuna provetta.
- Determinare il numero di piastre di agar cioccolato necessario per enumerare le NTHi inoculato. Posto queste piastre in un incubatore d'aria a testa in giù con la parte inferiore della piastra che poggia su metà della parte superiore per un'ora. Questo permetterà la piastra per entrambi caldo a 37 ° C e asciugare la superficie, facilitando l'abbandono di placcatura NTHi.
- Avviare il diluizioni seriali 1:10 del inoculo con l'aggiunta di 100 microlitri della sospensione batterica da 4,2 a primo tubo. Vortex ogni diluizione vigorosamente per 5 secondi prima di effettuare la successiva. Calo del 10 microlitri aliquote sulle piastre cioccolato pre-riscaldato e superficie secca agar, usando la metà della piastra per ogni diluizione. Cinque o sei aliquote da 10 microlitri può andare bene su una metà di ogni piatto 100 millimetri senza correre insieme. Una volta asciutta, posto a testa in giù in un umidificata 37 ° C incubatore CO 2 durante la notte.
- Il giorno seguente, determinare l'UFC / ml contando le diluizioni che hanno 15-30 colonie distinte in ogni goccia e calcolando di nuovo al vostro inoculo reale vitali di NTHi.
6. A lungo termine co-coltura con NTHi
- Ogni 24 ore, lavare gli inserti come in 3.1, poi piscina i lavaggi di ogni tessuto che è stato inoculato con lo stesso ceppo di batteri e congelare a -20 ° C in una provetta Microbank ™ etichetta per le analisi future. Questi campioni possono essere analizzati per la presenza di mucina da macchine punto o per l'espressione delle citochine da ELISA. In alternativa, i tessuti possono essere raccolti per mRNA e qPCR possono essere eseguite su geni di interesse. Modificare il MM basale quotidiano come in 3.2. Continua per tutta la durata del co-coltura.
7. La raccolta dei tessuti EpiAirway
- Preparare una soluzione fresca 1% di saponina in D-PBS senza calcio e magnesio, filtro-sterilizzare e calda a 37 ° C.
- Caldo di un tubo da 50 ml di MM ed un altro di D-PBS senza calcio e magnesio a 37 ° C.
- Preparare i tubi diluizione in 5.1, così come una vuoto sterile provetta Eppendorf da 1,5 ml per inserto, etichettata con il numero di inserimento e deformazione NTHi.
- Il EpiAirways possono essere raccolti sia per totale associato alle cellule dei batteri, che comprende sia gli organismi aderenti e interiorizzato, o per i batteri interiorizzato solo.
- Determinare il numero di piastre di agar cioccolato necessari per drop-piastra la cellula-associato o invaso NTHi, etichetta e asciugare per un'ora in un incubatore d'aria come in 5.2.
- Per raccolto totale associato alle cellule dei batteri, lavare la superficie apicale della EpiAirways tre volte con 200 microlitri di D-PBS senza calcio e magnesio, quindi inclinare l'inserto e risciacquare qualsiasi MM rimanenti dalla membrana basale. Il primo lavaggio può essere congelato per una successiva analisi, scartare i lavaggi successivi.
- Collocare l'inserto lavato in una fresca 6 pozzetti senza MM, e pipetta 250 microlitri della soluzione sterile 1% dal 7,1 saponina sulla superficie apicale di ciascun tessuto. Ritorno al incubatore per 10 minuti.
- Togliere dal termostato, e utilizzando un puntale sterile P1000, macchia i tessuti dalla membrana usando un avanti e indietro movimento, seguito da un movimento circolare per rimuovere il tessuto dai bordi dell'inserto. Utilizzando un grosso puntale sterile P1000, posto la sospensione nella provetta vuota etichetta preparata in 7.3. Aggiungere 250 microlitri di D-PBS senza calcio e magnesio sulla superficie apicale dell'inserto.
- Esaminare l'inserto con un invertito a contrasto di fase microscopio per determinare se ci sono residui di tessuto per essere raccolte. Se necessario, macchia di nuovo con un altro sterile P1000 puntale, quindi aggiungere questa sospensione per il tubo da 7,8 con un grosso calibro sterile puntale P1000. Portare il volume totale del tubo a 1 millilitro utilizzando D-PBS senza calcio e magnesio.
- Vigorosamente vortice la sospensione cellulare alla massima velocità per un minuto. Usando una siringa sterile 1 ml con ago 26 gauge, aspirare la sospensione nella siringa attraverso l'ago. Lentamente passare la sospensione attraverso l'ago 3 volte, facendo attenzione a non creare bolle. Energicamente ancora per un minuto.
- Utilizzando un grosso puntale, posto 100 microlitri della sospensione nella provetta prima diluizione preparata in 7.3. Energicamente per cinque secondi, quindi effettuare diluizioni seriali 1:10. Drop-piastra le diluizioni desiderato sulle piastre cioccolato superficie secca agar.
- Per raccogliere i batteri interiorizzato solo, lavare ogni inserire 3 volte con 200 microlitri di D-PBS senza calcio e magnesio. Conservare e congelare il primo lavaggio. Aggiungere solfato di gentamicina per MM pre-riscaldato a una concentrazione finale di 100 microgrammi / ml. Preparare 1,5 ml di supporti per inserto per essere raccolte. Sostituire la MM basale con la gentamicina contenenti MM, e aggiungere 300 microlitri di gentamicina contenenti MM sulla superficie apicale. Posizionare la piastra posteriore in CO 2 incubatore per un'ora.
- Rimuovere la gentamicina contenenti mm dalla superficie apicale e lavare la superficie apicale e la membrana basale dell'inserto ampiamente pre-riscaldato D-PBS senza calcio e magnesio. Procedere come a 7,7-7,11.
8. Rappresentante dei risultati:
Scansione microscopio elettronico di (A.) EpiAirway tessuto infetto e (B) tessuto dopo 5 giorni di co-coltura con NTHi sono mostrati in Figura 1. Lungo termine co-coltura con NTHi non comporta danni significativi al apicale tessuti, sottolineando l'utilità del modello EpiAirway. Un grafico che rappresenta il numero di batteri internalizzati quantificato nel corso del tempo all'interno di tessuti è illustrato nella figura 2. Entrambi i risultati sono abbastanza riproducibili, rendendo i tessuti EpiAirway un coerente e biologicamente rilevanti modello in vitro delle vie aeree superiori umana in cui studiare NTHi ospite-patogeno interazioni.
Figura 1. Microscopia elettronica a scansione dei tessuti EpiAirway. A. tessuto di controllo non infetti. Tessuto B. dopo cinque giorni di co-coltura con NTHi. Nessun danno significativo alla superficie apicale si osserva nei tessuti infetti.
Figura 2. Numero di NTHi interiorizzato nel tempo durante EpiAirway co-coltura. R2866 ceppo è stato inoculato a circa 1,0 x 10 7 CFU / inserimento (giorno 0), poi raccolte per i batteri interiorizzata in ogni punto all'ora indicata. Barre rappresentano n = 3 repliche in almeno doppio. Barre di errore sono SD.
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Discussion
Questo metodo permette l'indagine di lungo termine, interazioni ospite-patogeno in un ambiente biologicamente rilevanti di primaria tessuti umani respiratorio all'interfaccia aria-liquido interfaccia. Qui abbiamo usato NTHi come l'organismo infettante, ma l'interazione di qualsiasi batterio che non introduce citotossicità inaccettabile nel corso del tempo può essere quantificata con questo metodo. Il modello EpiAirway può essere utilizzato anche per lo studio dei virus, le droghe, o sostanze chimiche che influiscono le vie aeree dell'uomo superiore 5, 6, 7, 8. Abbiamo mantenuto i tessuti infetti per più di 40 giorni, e nei tessuti infetti con NTHi per almeno 10 giorni. Ci aspettiamo che i tessuti infetti potrebbero essere mantenuta per molto più a lungo, se lo si desidera.
I limiti di questo metodo è simile a quella di qualsiasi modello in vitro, tra cui l'impossibilità di ricostituire un sistema immunitario competente in questi tessuti. Anche se lava ogni giorno dei tessuti vengono eseguiti per imitare normale clearance mucociliare, che istituisce un naturale sbocco per la mucina prodotto in questi tessuti sarebbe più auspicabile 9. Inoltre, il contatto con NTHi è nota per indurre l'espressione mucina nelle cellule epiteliali delle vie respiratorie, esacerbando il problema 10. D'altra parte, la lava EpiAirway quotidiana può essere salvati e analizzati per proteine o attività enzimatiche di interesse, aggiungendo una dimensione importante per il metodo e aumentando la sua utilità.
Un passo chiave per le prestazioni di successo di questo metodo è la rottura meccanica dei tessuti prima del drop-placcatura il NTHi (punto 7.10). Poiché il EpiAirways sono altamente differenziate e composto da più tipi di cellule, i tessuti non sono così facili a disintegrarsi come un monostrato cellulare, anche dopo il trattamento saponina. Inoltre, NTHi sono notoriamente sensibili ai composti che aiutano nella disgregazione dei tessuti. Pertanto, abbiamo trovato che il superamento della sospensione cellulare attraverso un ago 26 gauge migliora notevolmente la nostra capacità di generare quantificazione coerenti e ripetibili di batteri interiorizzato o associato alle cellule.
Una volta che questa tecnica è padroneggiata, può anche essere utilizzata per determinare la capacità relativa di mutanti ceppi batterici di sopravvivere rispetto ai wild-type genitori, permettendo al ricercatore di caratterizzare gli effetti di specifiche mutazioni genetiche.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Patrick Hayden (MatTek) per le discussioni utili, e Robert Smith e Libby Perry della Georgia Health Sciences University per le loro abilità EM. Questo studio è stato finanziato dalla dell'NIDCD concedere DC010187 a DAD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saponin | Calbiochem | 558255-25GM | 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium | Lonza Inc. | 17-513Q | |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium | Lonza Inc. | 17-515Q | |
| EpiAirway antibiotic-free tissues | MatTek Corp. | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway antibiotic-free maintenance media | MatTek Corp. | AIR-100-MM-ABF | Supplied with kit |
| 10X phosphate-buffered saline solution | EMD Millipore | 6506 | Dilute to 1X before use |
| Gelatin | JT Baker | 2124-01 | Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave |
| Difco GC Medium Base (chocolate agar) | VWR international | 90002-016 | Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C |
| BBL Hemoglobin (chocolate agar) | VWR international | 90000-662 | Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above |
| BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) | VWR international | 90000-414 | Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates |
| Dissecting forceps, fine tip, curved | VWR international | 82027-406 | |
| Self-sealing sterilization pouches | VWR international | 89140-802 | |
| Gentamicin sulfate, 10 mg/ml | Lonza Inc. | 17-519Z | Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill |
References
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