Summary
このメソッドは、EpiAirways、気液界面で成長させた初代ヒト呼吸器上皮組織、生物学的に関連するとの共培養の拡張細菌の特性評価を可能に
Abstract
2、分類不可能なインフルエンザ菌 （NTHi）は呼吸器粘膜1の再発や慢性感染症を引き起こす可能性が人間に適応したグラム陰性細菌である。これらの生物が呼吸組織上および内部に生存するメカニズムを研究するために、細菌やヒトの細胞の成功を長期的な共培養を行うことができるモデルが必要となります。我々は、気液界面、EpiAirwayモデル（マテック、アッシュランド、マサチューセッツ州）に上げ、一次ヒト呼吸器上皮組織を使用してください。これらは、タイトジャンクション、繊毛とnonciliated細胞、ムチンを産生、および感染症に反応してサイトカインを産生する能力を保持する杯細胞を含む非不死化、高分化型、3次元の組織です。
人間の上気道の in vitroモデルで 、この生物学的に関連は多くの方法で使用することができ、この方法の全体的な目標は、時間をかけてNTHiと定量細胞に関連すると内面化細菌とEpiAirway組織の長期的な共培養を行うことです。 。同様に、共培養感染のムチン産生とサイトカインプロファイルを決定することができます。このアプローチは、多くの現在のプロトコルで、既存の方法を改良したものを長時間3を介して細菌感染をサポートすることができるではないヒト細胞の水中単層またはトランスウェル培養を、使用してください。生物が覆っている媒体に複製することができるたとえば、、これは実験を逮捕、細胞毒性と宿主細胞の損失の許容できないレベルになることがあります。 EpiAirwayモデルは長期的な宿主 - 病原体相互作用の特性評価が可能になります。さらに、EpiAirwayのソースではなく不死のラインよりも、正常なヒト気管気管支細胞であるため、それぞれの構造でと機能4の両方に実際の人間の上気道組織の優れた表現です。
この方法の場合は、EpiAirway組織は、配信前に2日間の抗微生物及び抗真菌化合物の離乳オフ、およびすべてのプロシージャは抗生物質フリーの条件下で行われています。細菌および初代ヒト組織の両方が同一の生物学的安全キャビネット内で使用されている、と長時間共培養しているので、これは、特別な考慮が必要となる。
Protocol
1。 EpiAirway組織のために生物学的安全キャビネットの準備
- にバックと手袋縛ら毛で、専用の白衣を着て、層流を開始します。 5分後、片側に（ピペット、チップ、遠心チューブなど）キャビネット内の任意のツールを移動、70％エタノールで生物学的安全キャビネットの内部とサッシをスプレーし、きれいなペーパータオルで拭いてください。 70％エタノールでもう一度洗浄インテリアをスプレーし、乾燥するために残す。クリーン側にツールを移動し、エタノールの手順を繰り返します。
- キャビネット内のエアロゾルのバリアピペットチップと専用のピペッターを使用してください。個別に包装された滅菌血清学的ピペットを使用するには、廃棄包装の外側を、層流を介して接続されての最後を渡すオープン分割し、キャビネット内にピペットをスライドさせます。
- EpiAirwayインサートは、滅菌ピンセットで処理する必要があります。場所6インチ精密チップ湾曲した自己シール滅菌袋とオートクレーブに鉗子を解剖。使用可能な状態に少なくとも6一日持つのに十分な準備をします。
2。 EpiAirway組織の開梱
- 70％エタノールでバイオセーフティキャビネット内の作業面をスプレーし、きれいなペーパータオルで拭いてください。再びスプレーし、表面が使用前に乾燥させます。 EpiAirwayボックスを開き、発泡スチロールや梱包材を破棄する。
- EpiAirway抗生物質フリーの保守メディア、AIR - 100 - MM ABF（MM）は、マテック独自のものですとインサート付きキットで送信されます。バイオセーフティキャビネット内で、ラベルメディアのタイプと日付で6滅菌50 mlの遠心チューブ、およびキャップを緩めます。 70％エタノールでメディアのボトルをスプレーし、キャビネット内部に開きます。各チューブに新しい滅菌血清ピペットを用いて各チューブに分注しMM 25mlのは、4℃でキャップ、および店舗を締めます毎日MMの新鮮なアリコートを使用してください。
- カルシウムとマグネシウムと1の新鮮なボトルXダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（D - PBS）を使用して、上記2.2を繰り返します。カルシウムとマグネシウムを含まないD - PBSを用いて再び繰り返す。 4ですべてのアリコート℃にて保存してください。
- EpiAirwayインサートAIR - 100℃の固体培地含有アガロースの上で4℃、24ウェルプレートに到着、および使用のための6ウェルプレートに配置する必要があります。エタノール耐性マーカーを使用して、日付と説明をそれぞれのプレートにラベルを付けます。各ウェルに4℃EpiAirwayのMMの代わりに1ミリリットル。その包装、70％エタノールでスプレー、およびバイオセーフティキャビネット内の場所から輸送プレートを取り外します。テープを外し、プレートを開きます。オートクレーブ鉗子を使用して、EpiAirwayインサート上の湿ったガーゼを取り除く。
- 6ウェルプレートのウェルにアガロースからそれを解放を支援するためにねじる運動を用いてオートクレーブピンセットで挿入、および場所をピックアップ。いくつかのアガロースは、トランスポートプレートの温度が周囲に増加し、特にとして、インサートに付着する場合があります。注意深くインサートからアガロースを削除するには、滅菌綿棒を使用してください。メンブレンに触れないようにしてください、と空気の泡が挿入下にトラップされていないことを確認してください。 5％CO 2で加湿37℃のインキュベーター内にプレートを置きます。
- 共培養を開始する前に、インキュベーターで平衡化する組織のための少なくとも24時間を許可する。
3。 EpiAirway組織のメンテナンス
- オートクレーブ鉗子を使用して、挿入をピックアップし、優しく組織にカルシウムとマグネシウムを予め温めておいたD - PBSを200マイクロリットルをピペッティングし、挿入を揺らし。角度で挿入を傾けて、挿入物の下部にある膜を保持するプラスチック製のリングと照らし合わせて滅菌P1000のピペットチップを置きます。組織には手を触れないでください。 D - PBSで洗浄し、標識滅菌クライオバイアルに配置吸引除去する。サンプルは-20℃で凍結し、後日ムチンおよび/またはサイトカイン発現についてアッセイされ得る。
- 吸引し、新鮮なMMの1ミリリットルで置き換えることにより、毎日の基礎MMを変更します。各ウェルの新たな障壁のピペットチップを使用してください。一晩10％の漂白剤と使用されているメディアを扱い、廃棄する。
4。 EpiAirway組織の接種
- チョコレート寒天培地上に凍結グリセロールストックから分類不可能なインフルエンザ菌 （NTHi）の新鮮な培養からストリーク。加湿した5％CO 2インキュベーターで一晩成長する。
- 翌日、約0.7のOD（600 nm）のカルシウムとマグネシウムで予め温めておいたD - PBSでNTHiの単一コロニーを懸濁します。積極的に前に光学密度を測定する渦。 NTHiのmlあたり光学密度の関係は、コロニー形成するユニット（CFU / ml）を0.2のODは、（600 nm）を約1.0 × 10 8 CFU / mlを等しいということです。したがって、0.7のOD（600 nm）は約3.5 × 10 8 CFU / mlである。このアルゴリズムは、接種する前に、各NTHi株に対して検証する必要があります。
- EpiAirway組織は、AIR - 100は0.6 cm 2および0.4ミクロンの膜の表面積とインサート上で成長されています。組織は、〜1.0 × 10 6〜8.0 × 10 5で構成されている</>のセルのSup。 12 -このため、1.0 × 10 7 CFUの接種は、約10の感染の多重度に対応しています。接種するために、3.1のように各EpiAirwayインサートを洗い流した後、バイオセーフティキャビネット内の各EpiAirwayインサートの先端面に4.2で調製した細菌懸濁液28マイクロリットルを追加。基礎MMを接種しないでください。インキュベーターに各プレートを返します。
5。 NTHi接種の定量化
- 消毒に0.1％ゼラチン（PBS - G）、オートクレーブでリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液を調製します。各チューブに滅菌PBS - Gの接種、アリコート900マイクロリットルのOD（600nmで）に基づいて、目的の1:10希釈液とラベル滅菌済み1.5 mLエッペンドルフチューブ。
- 接種NTHiを列挙するために必要なチョコレート寒天プレートの数を決定します。一時間のために上半分で休んでプレートの底に逆さまに空気のインキュベーター内でこれらのプレートを置きます。これは、NTHiのドロップメッキを容易に、37〜暖かい両方にプレート℃、表面が乾燥することができます。
- 4.2から最初の試験管に細菌懸濁液100マイクロリットルを添加することにより接種のシリアル1:10希釈を開始します。前に次を作る〜5秒間激しくボルテックス各希釈を。各希釈液の半分プレートを使用して、予め温めておいたと表面乾燥チョコレート寒天プレート上に10マイクロリットルのアリコートをドロップします。 5〜6個の10マイクロリットルのアリコートは、一緒に実行せずに各100mmプレートの半分に収まることができます。ときは加湿37の上下を逆に乾燥し、場所℃でCO 2インキュベーターで一晩。
- 翌日、各ドロップ15〜30の別個の植民地を持っている希釈液をカウントし、NTHiの実際の実行可能な接種に戻って計算することによって、CFU / mlを決定する。
6。 NTHiとの長期共培養
- 24時間ごとに、3.1のようにインサートを洗う、その後は-20細菌や凍結の同じ系統·今後の分析のための標識クライオバイアルにCを接種されている各組織の洗浄液をプール。これらのサンプルは、ドットブロットまたはELISA法によるサイトカインの発現のためのムチンの存在を検定することができる。また、mRNAおよび定量PCRのために伐採することができる組織は、目的の遺伝子に行うことができます。 3.2のように毎日の基礎MMを変更します。共培養の期間中継続する。
7。 EpiAirway組織の収穫
- カルシウムとマグネシウムを含まないD - PBSでサポニンの新鮮な1％の溶液を調製、ろ過滅菌し、37℃に温めて
- 37℃にカルシウムとマグネシウムなしで、MMとD - PBSの別の50 mlチューブを温める
- 5.1のように希釈チューブを準備するだけでなく、インサート番号とNTHi株で標識インサートごとに空の滅菌済み1.5 mLエッペンドルフチューブ、。
- EpiAirwaysが付着し、内面化の両方の生物を含むトータル細胞関連細菌、いずれかの、または唯一の内部化細菌のために収穫することができる。
- ドロッププレート細胞関連または5.2のように空気インキュベーターで一時間NTHi、ラベルや乾燥を侵略するために必要なチョコレート寒天プレートの数を決定します。
- 総細胞関連細菌を回収するために、カルシウムやマグネシウムを含まないD - PBSの200マイクロリットルで三回EpiAirwaysの頂端表面を洗い流した後、インサートを傾けて、基底膜から残りのMMをすすぐ。最初の洗浄は、後で分析するために凍結することができます。以下の洗浄を捨てる。
- 新鮮な6ウェルMMなしプレート、および各組織の頂端表面上に7.1から滅菌1％サポニン溶液のピペット250マイクロリットルで洗浄したインサートを配置。 10分間インキュベーターに戻す。
- インキュベーターから削除、および滅菌P1000ピペットチップを使用して、使用して往復運動、インサートの端から組織を除去するために円を描くように続いて膜から組織をスクラブ。大口径の滅菌P1000のピペットチップを使用して、7.3で作成した空のラベルが付いたチューブにサスペンションを配置。インサートの頂端表面上にカルシウムやマグネシウムを含まないD - PBS 250マイクロリットルを追加。
- 収穫する、残りの組織があるかどうかを判断する倒立位相差顕微鏡を用いてインサートを調べる。必要に応じて、大口径の滅菌P1000のピペットチップを使用して7.8からチューブに、この懸濁液を追加し、別の滅菌P1000ピペットの先端で再びスクラブ。カルシウムやマグネシウムを含まないD - PBSを用いて1ミリリットルにチューブの合計量をもたらす。
- 1分間トップスピードで激しくボルテックス細胞懸濁液。 26ゲージの針を備えた滅菌1 mlシリンジを使用して、針を通して注射器に、懸濁液を吸引除去する。ゆっくりと泡を作成しないように注意しながら、針を3回通過サスペンションを渡します。精力的に再び1分間ボルテックス。
- 7で調製した最初の希釈チューブに大口径のピペットチップ、場所懸濁液100マイクロリットルを使用する。3。 5秒間激しくボルテックスして、シリアル1:10希釈を行います。ドロッププレート表面乾燥チョコレート寒天プレート上に所望の希釈液。
- のみ内部化された細菌を回収するために、カルシウムまたはマグネシウムなしで、D - PBSを200マイクロリットルを各インサートを3回洗浄。最初の洗浄を保持して凍結する。 100マイクログラム/ mlの最終濃度に予め温めておいたMMに硫酸ゲンタマイシンを追加。収穫されるインサートごとにメディアの1.5 mlを調製。ゲンタマイシン含有MMと基底MMを交換し、頂端表面にゲンタマイシン含有MMの300マイクロリットルを追加。一時間に戻って、CO 2インキュベーターにプレートを置きます。
- 頂端表面からゲンタマイシン含有MMを削除して、カルシウムとマグネシウムなしで予め温めておいたD - PBSでインサートの先端面と基底膜を洗浄。 7.7から7.11のように進んでください。
8。代表的な結果：
NTHiによる5日間共培養した後、（A.）感染していないEpiAirway組織と（B.）組織の走査電子顕微鏡写真を図1に示されています。NTHiによる長期共培養は根尖に重大な損傷が発生しない組織、EpiAirwayモデルの有用性を強調。組織内部の時間の経過とともに定量化内部化された細菌の数を示すグラフを図2に示されています。両方の結果は非常に再現性がある、NTHi宿主-病原体を研究するための人間の上気道のin vitroモデルにおける EpiAirway組織に一貫性と生物学的に関連すること相互作用。
図1。EpiAirway組織の走査型電子顕微鏡。 A.非感染制御の組織。 NTHiと共培養の五日後にB.組織。頂端表面に有意な損傷は、感染した組織で観察されていません。
図2。NTHiの数はEpiAirwayの共培養中に経時的に内面化。株をR2866は、各指定された時点で内部化された細菌のために伐採約1.0 × 10 7 CFU /インサート（0日）、で接種した。バーは、n = 3が、少なくとも二重に複製表します。エラーバーはSDです。
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Discussion
このメソッドは、空気 - 液体界面における原発性ヒト呼吸器組織の生物学的に関連する背景に長期的な宿主 - 病原体相互作用の調査が可能になります。ここでは、感染微生物としてNTHiを使用しましたが、時間をかけて許容細胞毒性を導入しない任意の細菌の相互作用は、この方法で定量することができる。 EpiAirwayモデルはまた、ウイルス、薬物、または化学物質に影響を与える人間の上気道5の研究に用いることができる、6、7、8。我々は、少なくとも10日間NTHiに感染して40日以上、および組織のための感染していない組織を維持している。我々は、必要に応じて感染組織が、大幅に長く維持される可能性があると考えて。
この方法の制限は、再構築することができないこれらの組織で有能な免疫システムを含め、in vitroモデル内の任意のそれに似ています。組織の毎日の洗浄は、これらの組織で生産されたムチンのための自然なアウトレットが9以上が望ましいの確立、正常な粘膜線毛クリアランスを模倣するために行われていますが。さらに、NTHiとの接触は問題10を悪化させ、人間の呼吸器上皮細胞におけるムチンの発現を誘導することが知られている。一方、毎日EpiAirwayの洗浄は、法に重要な次元を追加し、その有用性を高める、目的のタンパク質や酵素活性のために保存して検定することができる。
このメソッドが正常に性能の1つの重要なステップは、前の組織の機械的破砕にドロップメッキNTHi（ステップ7.10）である。 EpiAirwaysは高度に差別化し、複数の細胞型から構成されているため、組織はさらにサポニン処理後、細胞単層として崩壊するほど簡単ではありません。さらに、NTHiは組織の分解の援助その化合物に悪名高いと小文字が区別されます。したがって、我々は、26ゲージの針を細胞懸濁液を渡すと大幅に内部化または細胞関連細菌の一貫性と再現性定量化を生成するために我々の能力を向上させることを発見した。
このテクニックをマスターしたら、それはまた、調査員が特定の遺伝的変異の影響を特徴づけることができます、彼らの野生型の親に比べて生き残るために変異菌株の相対的な能力を調査するために利用することができます。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
我々は彼らのEMのスキルのために有用な議論のためのパトリックヘイデン（マテック）、そしてロバートスミスとジョージア健康科学大学のリビーペリーに感謝の意を表します。この研究は、DADにNIDCD助成金DC010187によって賄われていた
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saponin | Calbiochem | 558255-25GM | 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium | Lonza Inc. | 17-513Q | |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium | Lonza Inc. | 17-515Q | |
| EpiAirway antibiotic-free tissues | MatTek Corp. | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway antibiotic-free maintenance media | MatTek Corp. | AIR-100-MM-ABF | Supplied with kit |
| 10X phosphate-buffered saline solution | EMD Millipore | 6506 | Dilute to 1X before use |
| Gelatin | JT Baker | 2124-01 | Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave |
| Difco GC Medium Base (chocolate agar) | VWR international | 90002-016 | Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C |
| BBL Hemoglobin (chocolate agar) | VWR international | 90000-662 | Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above |
| BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) | VWR international | 90000-414 | Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates |
| Dissecting forceps, fine tip, curved | VWR international | 82027-406 | |
| Self-sealing sterilization pouches | VWR international | 89140-802 | |
| Gentamicin sulfate, 10 mg/ml | Lonza Inc. | 17-519Z | Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill |
References
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