Summary
Este método permite la caracterización de bacterias extendido co-cultivo con EpiAirways, principal tejido humano respiratorias epiteliales cultivadas en la interfase aire-líquido, un biológicamente relevantes
Abstract
Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi) están adaptados a los humanos bacterias Gram-negativas que pueden causar infecciones recurrentes y crónicas de la mucosa respiratoria 1, 2. Para estudiar los mecanismos por los cuales estos organismos sobreviven en el interior de los tejidos y las vías respiratorias, un modelo en el que puede tener éxito a largo plazo co-cultivo de bacterias y células humanas llevadas a cabo es necesario. Usamos primaria tejidos humanos epitelio respiratorio elevado a la interfase aire-líquido, el modelo EpiAirway (MatTek, Ashland, MA). Estos no son inmortalizados, bien diferenciados, en 3 dimensiones los tejidos que contienen uniones estrechas, las células ciliadas y no ciliadas, células caliciformes que producen mucina, y retener la capacidad de producir citocinas en respuesta a la infección.
Este biológicamente relevantes en el modelo in vitro de la vía aérea superior humano puede ser utilizado en un número de maneras, el objetivo general de este método es llevar a cabo a largo plazo co-cultivo de tejidos EpiAirway con NTHi y cuantificar células asociadas a bacterias e internalizada a través del tiempo . Además, la producción de mucina y el perfil de citoquinas de las personas infectadas co-cultivos se puede determinar. Este enfoque mejora en los métodos existentes de que los protocolos actuales que utilizan muchos sumergidos monocapa o Transwell cultivos de células humanas, que no son capaces de soportar las infecciones bacterianas durante períodos prolongados 3. Por ejemplo, si un organismo se puede replicar en los medios de comunicación por encima, esto puede resultar en niveles inaceptables de la citotoxicidad y la pérdida de las células huésped, deteniendo el experimento. El modelo EpiAirway permite la caracterización de largo plazo huésped-patógeno interacciones. Además, dado que la fuente de la EpiAirway es humano normal traqueo-bronquial células en lugar de una línea inmortalizada, cada uno es una excelente representación de la actual tejido humano del tracto respiratorio superior, tanto en estructura como en función de cuatro.
Para este método, los tejidos EpiAirway son destetados de compuestos anti-microbianos y anti-hongos durante 2 días antes de la entrega, y todos los procedimientos se realizan bajo condiciones libres de antibióticos. Esto requiere consideraciones especiales, ya que tanto las bacterias y los principales tejidos humanos se utilizan en la misma cabina de bioseguridad, y son co-cultivadas por períodos prolongados.
Protocol
1. Preparación de la cabina de bioseguridad para los tejidos EpiAirway
- El uso de una bata de laboratorio dedicado, con el pelo recogido hacia atrás y los guantes puestos, inicie el flujo laminar. Después de 5 minutos, mover ninguna herramienta en el gabinete (pipetas, puntas, tubos de centrifugación, etc) a un lado, rociar el interior de cabinas de seguridad y la faja con 70% de etanol y limpie con toallas de papel limpias. Rocíe el interior limpia de nuevo con etanol al 70% y dejar secar. Mover las herramientas para el lado limpio y repita el procedimiento de etanol.
- Use aerosoles puntas de las pipetas y pipetas barrera dedicado en el gabinete. Para utilizar envueltas individualmente Pipetas serológicas estériles, pase el extremo conectado a través del flujo laminar, se abren, y deslice la pipeta en el gabinete, descartando el exterior del embalaje.
- Las inserciones EpiAirway debe ser manejado con pinzas estériles. Lugar de 6 pulgadas de punta fina Pinzas de disección curvas en bolsas de esterilización de autosellado y autoclave. Prepare suficiente para tener por lo menos seis días por listo para su uso.
2. Desembalaje de los tejidos EpiAirway
- Rocíe la superficie de trabajo en la cabina de bioseguridad con el 70% de etanol y limpie con toallas de papel limpias. Pulverizar de nuevo y dejar secar la superficie antes de su uso. Abra el cuadro de EpiAirway y deseche la espuma de poliestireno y material de embalaje.
- El EpiAirway libre de antibióticos medio de mantenimiento, AIR-100-MM ABF (MM), es propiedad de MatTek y es enviado en el kit con los insertos. En la cabina de bioseguridad, la etiqueta seis tubos de centrífuga estéril de 50 ml con el tipo y la fecha, y aflojar las tapas. Rocíe la botella de los medios de comunicación con el 70% de etanol y abierto en el interior del gabinete. Alícuota de 25 ml de la MM en cada tubo con una nueva pipeta serológica estéril para cada tubo, apretar las tapas y almacenar a 4 ° C. Use una parte alícuota de la MM por día.
- Repita el punto 2.2 con una botella de 1 X Dulbecco buffer fosfato salino (D-PBS) con calcio y magnesio. Repita de nuevo con D-PBS sin calcio y magnesio. Guarde todas las partes alícuotas a 4 ° C.
- Las inserciones EpiAirway 100 habitaciones con aire llega a una placa de 24 pocillos a 4 ° C en los medios de comunicación que contienen sólidos de agarosa, y se debe colocar en placas de 6 pocillos para su uso. Etiqueta de cada placa con la fecha y la descripción mediante un marcador de etanol-resistentes. Coloca 1 mililitro de 4 ° C MM EpiAirway en cada pozo. Retire la placa de transporte de su embalaje, rociado con etanol al 70%, y el lugar en el gabinete de bioseguridad. Retire la cinta y abra la placa. El uso de pinzas autoclave, retire la gasa húmeda sobre los insertos EpiAirway.
- Recoger una inserción con una pinza en autoclave mediante un movimiento de torsión para ayudar a liberarlo de la agarosa, y colocar en un pocillo de una placa de 6 pocillos. Algunos de agarosa puede adherirse a la inserción, sobre todo porque la temperatura de la placa de transporte aumenta la temperatura ambiente. Use un hisopo de algodón estéril para retirar cuidadosamente la agarosa de la inserción. Evite tocar la membrana, y verificar que no queden burbujas de aire debajo de los insertos. Colocar la placa en un humidificado incubadora a 37 ° C con 5% de CO 2.
- Deje por lo menos 24 horas para que los tejidos se equilibren en la incubadora antes de empezar co-cultivos.
3. Mantenimiento de los tejidos EpiAirway
- El uso de pinzas autoclave, recoger una inserción y suavemente pipeta 200 microlitros de pre-calentado D-PBS con calcio y magnesio en el tejido y la roca de inserción. Inclinación de la inserción en un ángulo y el lugar de su punta pipeta P1000 contra el anillo de plástico que contiene la membrana en la parte inferior de la inserción. No toque los tejidos. Aspirar el D-PBS enjuague y coloque en un criovial etiquetados estéril. Las muestras pueden ser congeladas a -20 ° C y se analizó la mucina y / o la expresión de citoquinas en una fecha posterior.
- Cambiar el MM basal diariamente por aspiración y el reemplazo con un mililitro de MM fresco. Utilice una punta de pipeta nueva barrera para cada pozo. El tratamiento de los medios de comunicación se utiliza con lejía al 10% durante la noche y descarte.
4. La inoculación de tejidos EpiAirway
- Racha de un cultivo fresco de Haemophilus influenzae no tipificable (NTHi) de acciones de glicerol congelado en agar chocolate. Crecen durante la noche en un 5% humidificado incubadora de CO 2.
- Al día siguiente, volver a suspender las colonias aisladas de HiNT en pre-calentado D-PBS con el calcio y el magnesio para una DO (600 nm) de aproximadamente 0,7. Agitar vigorosamente antes de medir la densidad óptica. La relación de la densidad óptica de unidades formadoras de colonias por mililitro (UFC / ml) de HiNT es que una DO (600 nm) de 0,2 aproximadamente igual a 1,0 x 10 8 UFC / ml. Por lo tanto, un DO (600 nm) de 0.7 es de unos 3,5 x 10 8 UFC / ml. Este algoritmo debe ser validado para cada cepa HiNT antes de la inoculación.
- Los tejidos EpiAirway AIR-100 se cultivan en bandejas con una superficie de 0,6 cm 2 y una membrana de 0,4 micras. Los tejidos están compuestos de ~ 8.0 x 10 5 a ~ 1.0 x 10 6 </ Sup células>. Por lo tanto, la inoculación de 1,0 x 10 7 UFC corresponde a una multiplicidad de infección de aproximadamente 10 - 12. Para inocular, enjuague cada inserción EpiAirway como en 3.1, a continuación, añadir 28 microlitros de la suspensión bacteriana preparada en 4,2 a la superficie apical de cada inserto EpiAirway en la cabina de bioseguridad. No vacunar a los MM basal. Volver cada plato a la incubadora.
5. La cuantificación del inóculo HiNT
- Preparar un tampón fosfato salino (PBS) con gelatina al 0,1% (PBS-G), autoclave para esterilizar. Etiqueta de estéril de 1,5 ml tubos Eppendorf con las diluciones 1:10 deseado basado en el diámetro exterior (600 nm) de la alícuota del inóculo y 900 microlitros de la PBS estéril-G en cada tubo.
- Determinar el número de las placas de agar chocolate para enumerar los HiNT inoculados. Coloque estas placas en una incubadora de aire al revés con la parte inferior de la placa de descanso en la mitad de la parte superior de una hora. Esto permitirá que la placa de tanto calor a 37 ° C y la superficie se seque, lo que facilita el abandono de placas de NTHi.
- Iniciar las diluciones seriadas 1:10 de la inoculación mediante la adición de 100 microlitros de la suspensión bacteriana de 4,2 al primer tubo. Vortex cada dilución vigorosamente por 5 segundos antes de hacer la siguiente. Caída de 10 microlitros alícuotas en las placas de agar previamente calentada y la superficie seca de chocolate, con la mitad del plato para cada dilución. Cinco o seis alícuotas de 10 microlitros puede caber en la mitad de cada placa de 100 mm, sin correr juntos. Al lugar seco y al revés en un 37 ° C humidificado incubadora de CO 2 durante la noche.
- Al día siguiente, determinar las UFC / ml, contando las diluciones que tengan 15 a 30 colonias distintas en cada gota y calcular de nuevo a su actual inóculo viable de NTHi.
6. A largo plazo co-cultivo con NTHi
- Cada 24 horas, lavar los insertos como en 3.1, entonces la piscina del lavado de cada tejido que ha sido inoculados con la misma cepa de bacterias y se congelan a -20 ° C en un criovial etiquetados para su posterior análisis. Estas muestras pueden ser analizados para detectar la presencia de mucina por manchas de punto o de la expresión de citoquinas por ELISA. Por otra parte, los tejidos pueden ser cosechados para el mRNA y qPCR se puede realizar en los genes de interés. Cambiar el MM basal diaria como en 3.2. Continuará por la duración de la co-cultivo.
7. La recolección de los tejidos EpiAirway
- Prepare una solución fresca al 1% de saponina en D-PBS sin calcio y el magnesio, el filtro a esterilizar y calentar a 37 º C.
- Calentar un tubo de 50 ml de MM y otro de D-PBS sin calcio y magnesio a 37 º C.
- Preparar tubos de dilución, como en 5.1, así como un vacío estéril de 1,5 ml tubo Eppendorf por plaquita, marcado con el número de inserción y la tensión NTHi.
- El EpiAirways pueden ser cosechados, ya sea total de células asociadas a las bacterias, que incluye tanto los organismos adherentes e interiorizado, o por bacterias internalizadas solamente.
- Determinar el número de las placas de agar chocolate necesarios para colocar la placa de la célula asociada o invadido HiNT, etiqueta y seco durante una hora en una incubadora de aire como en 5.2.
- Para la cosecha total de células asociadas a las bacterias, enjuague la superficie apical de la EpiAirways tres veces con 200 microlitros de D-PBS sin calcio ni magnesio, y luego la inclinación de la inserción y enjuagar cualquier resto de MM de la membrana basal. El primer lavado se pueden congelar para su posterior análisis; descartar los lavados siguientes.
- Coloque el inserto de lavado en un fresco de 6 pocillos sin MM, y microlitros pipeta 250 de la solución estéril de 1% saponina de 7,1 en la superficie apical de cada tejido. Volver a la incubadora durante 10 minutos.
- Retirar de la incubadora, y utilizando una aguja estéril P1000 punta de la pipeta, el matorral de los tejidos de la membrana con una devolución de adelante y hacia atrás, seguido por un movimiento circular para eliminar el tejido de los bordes de la pieza. El uso de un gran calibre punta de pipeta P1000, el lugar de la suspensión en el tubo de vacío etiquetados preparados de 7,3. Añadir 250 microlitros de D-PBS sin calcio o magnesio en la superficie apical de la inserción.
- Examine la pieza utilizando un invertido de contraste de fase microscopio para determinar si hay algún resto de tejido para ser cosechado. Si es necesario, frote de nuevo con otra punta de la pipeta estéril P1000, a continuación, añadir esta suspensión al tubo de 7,8 con un gran calibre punta de pipeta P1000. Obtener un volumen total del tubo de 1 mililitro con D-PBS sin calcio ni magnesio.
- Vigorosamente el vórtice de una suspensión celular a toda velocidad durante un minuto. Utilizando una jeringa estéril de 1 equipada con una aguja de calibre 26, aspirar la suspensión dentro de la jeringa por la aguja. Poco a poco pasar la suspensión a través de la aguja 3 veces, teniendo cuidado de no crear burbujas. Agitar vigorosamente de nuevo durante un minuto.
- Con una punta de gran calibre pipeta, colocar 100 microlitros de la suspensión en el primer tubo de dilución preparada en 7.3. Agitar vigorosamente durante cinco segundos, a continuación, hacer diluciones seriadas 1:10. Placa de abandono de las diluciones que desee en las placas de agar seca en la superficie del chocolate.
- Para cosechar las bacterias internalizado sólo, lavar cada inserción 3 veces con 200 microlitros de D-PBS sin calcio ni magnesio. Conservar y congelar el primer lavado. Añadir sulfato de gentamicina para pre-calentado MM a una concentración final de 100 microgramos / ml. Prepare 1,5 ml de los medios de comunicación por plaquita para ser cosechado. Vuelva a colocar el MM basal con la MM de gentamicina que contienen, y añadir 300 microlitros de gentamicina que contienen MM en la superficie apical. Colocar la placa en la incubadora de CO 2 durante una hora.
- Retire la MM que contienen gentamicina de la superficie apical y lavar la superficie apical y la membrana basal de la inserción extensamente con pre-calentado D-PBS sin calcio y magnesio. Proceda como en 7.7-7.11.
8. Los resultados representativos:
Micrografías electrónicas de barrido de (A) del tejido y el tejido infectado EpiAirway (b) después de 5 días de co-cultivo con NTHi se muestra en la Figura 1. Largo plazo co-cultivo con NTHi no da como resultado un daño significativo a la apical tejidos, lo que subraya la utilidad del modelo de EpiAirway. Un gráfico que representa el número de bacterias internalizadas cuantificados en el tiempo dentro de los tejidos se muestra en la Figura 2. Ambos resultados son reproducibles, por lo que los tejidos EpiAirway una consistente y biológicamente relevantes en el modelo in vitro de las vías respiratorias superiores humanos para estudiar HiNT huésped-patógeno interacciones.
Figura 1. Microscopía electrónica de barrido de los tejidos EpiAirway. A. tejido de control no infectados. B. tejido tras cinco días de co-cultivo con NTHi. No hay un daño significativo a la superficie apical se observa en los tejidos infectados.
Figura 2. Número de HiNT interiorizado a través del tiempo durante EpiAirway co-cultivo. R2866 cepa se inoculó en aproximadamente 1,0 x 10 7 UFC / inserción (Día 0), entonces cosechados por bacterias internalizado en cada momento indicado. Las barras representan n = 3 repeticiones por lo menos en duplicado. Las barras de error son SD.
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Discussion
Este método permite la investigación a largo plazo de las interacciones huésped-patógeno en un fondo biológicamente relevantes de primaria tejidos humanos respiratorias en la interfase aire-líquido. Aquí hemos utilizado HiNT como el organismo de la infección, pero la interacción de cualquier bacteria que no presenta citotoxicidad inaceptable con el tiempo se puede cuantificar con este método. El modelo EpiAirway también puede ser utilizado para el estudio de los virus, las drogas o productos químicos que afectan las vías respiratorias humanas superior 5, 6, 7, 8. Hemos mantenido los tejidos infectados durante más de 40 días, y en los tejidos infectados con NTHi por lo menos 10 días. Esperamos que los tejidos infectados se podría mantener durante mucho más tiempo, si lo desea.
Las limitaciones de este método son similares a la de cualquier modelo in vitro, incluyendo la imposibilidad de reconstruir un sistema inmune competente en estos tejidos. Aunque se lava todos los días de los tejidos se llevan a cabo para imitar el aclaramiento mucociliar normal, el establecimiento de una salida natural para la mucina producida en estos tejidos podría ser más deseable 9. Además, póngase en contacto con NTHi se sabe para inducir la expresión de mucina en las células del epitelio respiratorio, lo que agrava el problema 10. Por otro lado, los lavados EpiAirway diaria se pueden guardar y analizaron las proteínas o las actividades enzimáticas de interés, añadiendo una dimensión importante para el método y el aumento de su utilidad.
Un paso clave en el exitoso desempeño de este método es la alteración mecánica de los tejidos antes de la caída de galvanoplastia, la HiNT (paso 7,10). Debido a que el EpiAirways están altamente diferenciadas y compuestas de múltiples tipos de células, los tejidos no son tan fáciles de desintegrarse como una monocapa de células, incluso después del tratamiento de saponina. Además, HiNT son muy sensibles a los compuestos que ayudan en la desagregación de los tejidos. Por lo tanto, hemos encontrado que la aprobación de la suspensión celular a través de una aguja de calibre 26 mejora en gran medida nuestra capacidad para generar cuantificación consistente y repetible de bacterias internalizadas o asociado a células.
Una vez que esta técnica se domina, sino que también pueden ser utilizados para investigar la capacidad relativa de las cepas mutantes de bacterias para sobrevivir en comparación con sus padres de tipo salvaje, lo que permite al investigador para caracterizar los efectos de mutaciones genéticas específicas.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Patrick Hayden (MatTek) útil para los debates, y Robert Smith y Perry Libby de Georgia Ciencias de la Salud de la Universidad por sus habilidades EM. Este estudio fue financiado por NIDCD conceder DC010187 de DAD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saponin | Calbiochem | 558255-25GM | 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium | Lonza Inc. | 17-513Q | |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium | Lonza Inc. | 17-515Q | |
| EpiAirway antibiotic-free tissues | MatTek Corp. | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway antibiotic-free maintenance media | MatTek Corp. | AIR-100-MM-ABF | Supplied with kit |
| 10X phosphate-buffered saline solution | EMD Millipore | 6506 | Dilute to 1X before use |
| Gelatin | JT Baker | 2124-01 | Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave |
| Difco GC Medium Base (chocolate agar) | VWR international | 90002-016 | Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C |
| BBL Hemoglobin (chocolate agar) | VWR international | 90000-662 | Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above |
| BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) | VWR international | 90000-414 | Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates |
| Dissecting forceps, fine tip, curved | VWR international | 82027-406 | |
| Self-sealing sterilization pouches | VWR international | 89140-802 | |
| Gentamicin sulfate, 10 mg/ml | Lonza Inc. | 17-519Z | Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill |
References
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