Summary
Bu yöntem EpiAirways, hava-sıvı arayüzü yetişen birincil insan solunum yolu epitel doku, biyolojik ilgili ko-kültür uzun bakteriyel karakterizasyonu
Abstract
2; Tiplendirilemeyen Haemophilus influenzae (NTHi), tekrarlayan ve kronik solunum mukoza 1 enfeksiyonlara yol açabilir insan adapte Gram-negatif bakteriler . Bu organizmalar solunum dokularda ve iç hayatta hangi mekanizmaları, bakteri ve insan hücreleri başarılı bir şekilde uzun vadeli işbirliği kültürü yapılabilir hangi modelin incelenmesi. Biz hava-sıvı arayüzü yükseltilmiş birincil insan solunum yolu epitel dokuların kullanımı, EpiAirway modeli (Mattek, Ashland, MA). Bu sıkı kavşaklar, siliyalı ve nonciliated hücreleri, müsin üreten ve enfeksiyona karşı sitokin üretme yeteneğini muhafaza goblet hücreleri içeren olmayan ölümsüzleştirdi, iyi diferansiye, 3-boyutlu dokular.
Bu biyolojik olarak insan üst solunum yolu in vitro model ilgili bir dizi şekillerde kullanılabilir; zamanla bu yöntem genel hedefi, NTHi ve Asitli EpiAirway dokuların uzun vadeli işbirliği kültürü hücre ilişkili ve içselleştirilmiş bakteriler gerçekleştirmek için . Yanı sıra, enfekte ko-kültür müsin üretimi ve sitokin profili tespit edilebilir. Bu yaklaşım, pek çok mevcut protokoller mevcut yöntemleri geliştirir uzun süre 3 üzerinde bakteriyel enfeksiyonlar destekleme yeteneğine sahip değildir, insan hücrelerinin batık tek tabaka veya transwell kültürleri, kullanın . Örneğin, eğer bir organizmanın üstteki medya çoğaltmak, bu deney tutuklamak, sitotoksisite ve ev sahibi hücrelerin kaybı kabul edilemez düzeyde neden olabilir. EpiAirway modeli uzun vadeli konak-patojen etkileşimi karakterizasyonu sağlar. EpiAirway için kaynak ölümsüzleştirilen çizgisinden daha çok bir normal insan trakea-bronş hücreleri beri Ayrıca, her gerçek insan üst solunum yolu doku yapısı ve fonksiyonu 4 hem de mükemmel bir temsil,.
Bu yöntem için, EpiAirway dokular teslimattan 2 gün önce anti-mikrobiyal ve anti-mantar bileşiklerin sütten ve tüm işlemler antibiyotik koşullar altında yapılmaktadır. Bu her iki bakteri ve birincil insan dokuları aynı Biyogüvenlik kabini olduğundan, özel durumlar gerektirmektedir ve uzun süre ko-kültür vardır.
Protocol
1. Biyogüvenlik kabini EpiAirway dokular için hazırlanması
- Geri ve eldiven bağlı saç, özel bir laboratuvar önlüğü giymek, laminer akış başlar. 5 dakika sonra, kabine (Pipet, ipuçları, santrifüj tüpleri, vb) herhangi bir alet taşımak bir yana, sprey,% 70 etanol ve temiz bir kağıt havlu ile silin ile biyogüvenlik kabini iç ve kanat. % 70 etanol ile tekrar temizlenir iç Sprey ve kurumaya bırakın. Temiz tarafında araçları hareket ettirin ve etanol prosedürü tekrarlayın.
- Kabine aerosol bariyer pipet uçları ve adanmış Pipet kullanın. Ayrı ayrı sarılmış steril serolojik pipetler kullanmak için, ambalaj dışında atarak, laminer akış ile takılı sonuna geçmesi açık ara ve kabin içine pipet kaydırın.
- EpiAirway ekler steril forseps ile ele alınması gerekir. Yeri 6-inç ince ucu kavisli kendinden sızdırmaz sterilizasyon keseleri ve otoklav içine forseps diseksiyon. En az altı günlük kullanım için hazır olması için yeterli hazırlayın.
2. EpiAirway dokuların Unpacking
- % 70 etanol ile biyogüvenlik kabini çalışma yüzeyine püskürtün ve temiz bir kağıt havlu ile silin. Tekrar Sprey ve yüzey kullanmadan önce kurumasını bekleyin. EpiAirway kutusunu açın ve strafor ve ambalaj malzemesi atmak.
- EpiAirway antibiyotik ücretsiz bakım medya, HAVA-100-AA ABF (MM), Mattek sahipli ve ekler ile kit olarak gönderilir. Biyogüvenlik kabini, ortam türü ve tarihi ile etiket altı steril 50 ml santrifüj tüplerine ve kapakları gevşetin. % 70 etanol ile medya şişe Sprey ve kabin içinde açık. 4 ° C'de kısım her tüp için yeni bir steril serolojik pipet kullanarak her bir tüp içine 25 ml MM, kapaklar, ve mağaza sıkın. MM her gün taze bir kısım kullanın.
- 2.2 1 X Dulbecco'nun taze bir şişe fosfat, kalsiyum ve magnezyum ile tamponlu salin (D-PBS) kullanarak yukarıdaki tekrarlayın. Kalsiyum ve magnezyum olmadan D-PBS kullanarak tekrar tekrarlayın. 4 alikotları Mağaza ° C.
- EpiAirway ekler HAVA-100 ° C katı medya içeren agaroz 4, 24 plaka gelmesi ve 6-iyi kullanmak için tabak içine yerleştirilmesi gerekir. Etanol-dayanıklı bir kalem kullanarak tarih ve açıklama ile her plaka etiketleyin. Her kuyuya 4 ° C EpiAirway MM Yeri 1 mililitre. Ulaşım, ambalaj,% 70 etanol ile sprey, ve biyogüvenlik kabini yer plaka çıkarın. Bandını çıkarın ve plakasını açın. Otoklavlanmış forseps kullanarak, EpiAirway ekler Nemli gazlı bez üzerine çıkarın.
- 6 plaka bir kuyuya bir agaroz serbest yardım etmek için bir kıvırma hareketi ile otoklava forseps ile insert, yer ve Pick up. Bazı agaroz ortam için taşıma plakası sıcaklığı artar, özellikle de eklemek uygun olabilir. Steril bir pamuklu çubukla dikkatlice yerleştirin agaroz kaldırmak için kullanın. Membran dokunmaktan kaçının ve ekler altında sıkışmış hava kabarcıkları olup olmadığını kontrol edin. Plaka% 5 CO 2 ile nemlendirilmiş bir 37 ° C inkübatör içine yerleştirin.
- Ortak kültürler başlamadan önce inkübatör dengeye dokular için en az 24 saat bekleyin.
3. EpiAirway dokuların bakımı
- Otoklavlanmış forseps kullanarak, bir ekleme pick up ve doku üzerine hafifçe kalsiyum ve magnezyum ile, önceden ısıtılmış D-PBS 200 mikrolitre pipet ve ekleme rock. Tilt bir açıyla yerleştirin ve insert altındaki membran tutan plastik halka karşı steril P1000 pipet yerleştirmek. Doku dokunmayın. D-PBS durulama ve etiketli bir steril cryovial yerleştirmek aspire edin. Numuneler -20 ° C'de dondurulmuş ve sonraki bir tarihte, müsin ve / veya sitokin ifade için test edilebilir.
- Aspire ve taze MM 1 mililitre ile değiştirerek günlük bazal MM değiştirin. Her bir kuyu için yeni bir bariyer pipet kullanın. Bir gecede% 10 çamaşır suyu ile kullanılan medya davranın ve atın.
4. Aşılama, EpiAirway dokuların
- Çikolata agara, dondurulmuş gliserol stok tiplendirilemeyen Haemophilus influenzae (NTHi) taze bir kültür dışarı Streak . Nemlendirilmiş bir% 5 CO2 inkübatör geceleme büyütün.
- Ertesi gün, kalsiyum ve magnezyum ile yaklaşık 0,7 OD (600 nm) önceden ısıtılmış D-PBS NTHi tek koloniler tekrar süspansiyon haline getirin. Optik yoğunluk ölçüm şiddetle önce Vortex. Optik yoğunluk ilişkisi koloni oluşturan NTHi ml (CFU / ml) başına birimleri 0.2 'lik bir OD (600 nm) yaklaşık 1.0 x 10 8 CFU / ml eşittir. Bu nedenle, bir OD 0.7 (600 nm) yaklaşık 3.5 x 10 8 CFU / ml. Bu algoritma, aşılama için önce her NTHi suşu için valide edilmelidir.
- EpiAirway dokuların HAVA-100, 0.6 cm 2 ve 0,4 mikron membran yüzey alanına sahip ekler yetiştirilmektedir . ~ 8.0 x 10 5 ~ 1.0 x 10 6 dokularda oluşan </> Hücreleri destek. 12 - Bu nedenle, 1.0 x 10 7 CFU bir aşılama yaklaşık 10 enfeksiyon çokluğu karşılık gelir. Aşılamak için, 3.1 'deki gibi her EpiAirway eklemek yıkayın, daha sonra bakteriyel süspansiyon biyogüvenlik kabini içinde her EpiAirway eklemek apikal yüzeye 4.2 hazırlanan 28 mikrolitre ekleyin. Bazal MM aşılamak etmeyin. Inkübatör her plaka dönün.
5. NTHi inokulum Kantitasyonu
- Sterilize etmek için% 0,1 jelatin (PBS-G), otoklav ile fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi hazırlayın. Her tüpe steril PBS-G ve inokulum kısım 900 mikrolitre OD (600 nm) dayalı istenilen 01:10 dilüsyonları Etiket steril 1,5 ml Eppendorf tüpleri.
- Çikolata agar plaklarına inoküle NTHi numaralandırmak için gerekli sayısını belirler. , Bir saat boyunca üst yarısında dinlenme plakanın alt baş aşağı bir hava inkübatör bu levhaların yerleştirin. Bu plaka 37 sıcak ° C ve NTHi açılan kaplama kolaylaştırılması, kuru yüzey. Sağlayacaktır
- 4.2 'den ilk tüp bakteriyel süspansiyon 100 mikrolitre ekleyerek inokulum seri 01:10 dilüsyonları başlayın. Vorteks her seyreltme 5 saniye boyunca güçlü bir şekilde bir sonraki önce yapmak için. Her bir seyreltme için yarım tabak kullanarak, önceden ısıtılmış ve yüzey kurutulmuş çikolata agar plakları üzerine 10 mikrolitrelik alikotları bırakın. Beş altı 10 mikrolitrelik alikotları birlikte çalışan her 100 mm plaka bir yarım sığabilir. , Baş aşağı 37 nemlendirilmiş bir kuru yer ° C CO 2 inkübatör geceleme .
- Ertesi gün, her açılan 15-30 farklı koloniler dilüsyonları sayma ve NTHi gerçek canlı inokulum geri hesaplanırken CFU / ml belirlemek.
6. NTHi ile uzun vadeli işbirliği-kültür
- -20 Bakteri ve dondurma aynı gerginlik ° C gelecek analizi için etiketli cryovial inoküle her doku yıkamalar havuzu, sonra 3.1 'deki gibi, her 24 saatte bir, ekler yıkayın. Bu örnekler nokta leke müsin varlığı veya ELISA ile sitokinlerin ifadesi için çalışılmalıdır. Alternatif olarak, dokularda mRNA için hasat edilebilir ve qPCR ilgi genlerin yapılabilir. 3.2 'deki gibi günlük bazal MM değiştirin. Co-kültür boyunca devam edin.
7. EpiAirway dokuların hasadı
- Kalsiyum ve magnezyum olmadan D-PBS saponin taze% 1 solüsyon hazırlayın, filtre sterilize ve 37 ° C sıcak
- 37 ° C, kalsiyum ve magnezyum olmadan, MM ve D-PBS başka bir 50 ml tüp Sıcak
- 5.1 'sulandırma tüpleri hazırlayın yanı sıra eklemek sayısı ve NTHi gerilme ile etiketlenmiş eklemek başına bir boş steril 1,5 ml Eppendorf tüp,.
- EpiAirways yapışık ve içselleştirilmiş organizmalar, ya da sadece içselleştirilmiş bakteriler için iki içeren, toplam hücre ilişkili bakteri ya da hasat edilebilir.
- , Damla plakalı hücre ilişkili veya 5.2 gibi bir hava inkübatör etiket ve bir saat süreyle kuru NTHi işgal gerekli çikolata agar plaklarına sayısını belirler.
- Toplam hücre ilişkili bakteriler hasat için, kalsiyum veya magnezyum olmadan 200 mikrolitre D-PBS ile üç kez EpiAirways apikal yüzey durulama, daha sonra ekleme eğilme ve bazal membran kalan MM durulayın. Ilk yıkamada daha sonra analiz için dondurulmuş olabilir; aşağıdaki yıkar iptal.
- 7.1 'den% 1 steril saponin çözüm yıkanmış MM olmadan yeni bir 6-plaka, insert, ve pipetle 250 mikrolitre her doku apikal yüzeye yerleştirin. 10 dakika boyunca inkübatör dön.
- Inkübatör çıkar ve P1000 steril bir pipet kullanarak, geri ve ileri hareket, insert kenarlarından doku kaldırmak için dairesel bir hareket takip membran dokuların fırçalayın. Büyük bir delik steril P1000 pipet kullanarak, 7.3 'de hazırlanan boş etiketli tüpe süspansiyon yerleştirin. Eklemek apikal yüzeye kalsiyum veya magnezyum olmadan D-PBS 250 mikrolitre ekleyin.
- Kalan herhangi bir doku hasat edilebilir olup olmadığını belirlemek için ters bir faz-kontrast mikroskop kullanarak eklemek inceleyin. Gerekirse, başka bir steril P1000 pipet ile tekrar fırçalayın, sonra büyük bir delik steril P1000 pipet kullanarak tüp 7.8 süspansiyon ekleyin. 1 mililitre kalsiyum veya magnezyum olmadan D-PBS kullanarak tüp toplam hacmi getirin.
- En yüksek hızda bir dakika boyunca şiddetle vorteks hücre süspansiyonu. 26 gauge iğne ile donatılmış, 1 ml steril bir şırınga, iğne süspansiyon ile enjektöre aspire. Yavaş yavaş süspansiyon özen baloncuklar oluşturmak için değil, iğne 3 kez geçmektedir. Bir dakika boyunca kuvvetlice tekrar karıştırın.
- 7 hazırlanan ilk sulandırma tüpü içine geniş çaplı bir pipet, yer süspansiyon 100 mikrolitre kullanma.3. Vortex şiddetle beş saniye sonra seri 01:10 dilüsyonları. Drop-plaka yüzey kuru çikolata agar plakları üzerine istenilen dilüsyonları.
- Içselleştirilmiş bakteri sadece hasat için, kalsiyum veya magnezyum olmadan D-PBS 200 mikrolitre her ekleme 3 kere yıkayın. Ilk yıkamada saklayın ve dondurma. Önceden ısıtılmış MM nihai konsantrasyonu 100 mikrogram / ml gentamisin sülfat ekleyin. 1.5 ml eklemek için hasat edilebilir başına medya hazırlayın. Gentamisin içeren MM ile bazal MM değiştirin ve apikal yüzeye gentamisin içeren MM 300 mikrolitre ekleyin. Bir saat geri plaka CO 2 kuvöz içine yerleştirin.
- Apikal yüzey gentamisin içeren MM çıkarın ve apikal yüzey ve yaygın olarak kalsiyum ve magnezyum olmadan önceden ısıtılmış D-PBS ile ekleme bazal membran yıkayın. 7,7-7,11 içinde gibi devam edin.
8. Temsilcisi sonuçları:
NTHi ile 5 günlük bir ko-kültür (A) bulaşmamış EpiAirway doku ve (B) doku elektron mikrograflar sonra Tarama Şekil 1'de gösterildiği NTHi ile uzun vadeli işbirliği-kültür apikal önemli bir hasara yol açmaz . dokular, EpiAirway modeli yardımcı programı vurgulayan. Dokular içinde zamanla sayısal içselleştirilmiş bakteri sayısını gösteren bir grafik Şekil 2'de gösterildiği gibi, her ikisi de oldukça tekrarlanabilir sonuçlar, EpiAirway dokular ve tutarlı bir insan üst solunum yolu in vitro model biyolojik ilgili çalışma NTHi konak- patojen etkileşimleri.
Şekil 1 EpiAirway dokuların elektron mikroskobu Tarama. A. bulaşmamış kontrolü doku. NTHi eş-kültür beş gün sonra B. Doku. Apikal yüzey enfekte dokularda önemli bir hasar yok görülmektedir.
Şekil 2 NTHi sayısı EpiAirway ko-kültür sırasında zamanla içselleştirilmiş. Gerilme R2866 sonra her Belirtilen bir zaman noktasında içselleştirilmiş bakteriler hasat yaklaşık 1.0 x 10 7 CFU / ekleme (Gün 0) ekildi. Barlar = 3, en az iki nüsha halinde çoğaltır n temsil eder. Hata çubukları, SD.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntem, hava-sıvı arayüzü birincil insan solunum dokuların biyolojik ilgili bir arka planda uzun vadeli konak-patojen etkileşimleri soruşturma sağlar. Burada bulaşmasını organizma olarak NTHi kullanılan, ancak herhangi bir bakterinin zamanla kabul edilemez sitotoksisite tanıtmak gelmez bu yöntem ile etkileşimi sayılabilir olabilir. EpiAirway model aynı zamanda, virüsler, ilaçlar, ya da kimyasalların bu etkiyi insan üst solunum yolu 5 çalışma için kullanılan, 6, 7, 8 . Biz, en az 10 gün NTHi ile enfekte en fazla 40 gün ve dokuların enfekte olmamış dokuların korumuştur. Biz enfekte dokularda, istenirse, önemli ölçüde daha uzun süre muhafaza edilebilir olduğunu bekliyoruz.
Bu yöntemin sınırlamaları sulandırmak yetersizlik, bu dokuların bir yetkili bağışıklık sistemi de dahil olmak üzere in vitro model herhangi bir benzer. Mukosiliyer klirensi normal dokuların günlük yıkar, bu dokularda üretilen müsin için doğal bir çıkış kurulması, taklit etmek için yapılır rağmen 9 daha cazip olurdu . Ayrıca, sorun 10 hızlandırarak, NTHi müsin ifade insan solunum yolu epitel hücreleri tetiklediği bilinmektedir başvurun. Öte yandan, günlük EpiAirway yıkar kaydedilir ve yöntem için önemli bir boyut ekleyerek ve yararlılığını artırarak, protein veya ilgi enzimatik faaliyetleri için test.
Bu yöntemin başarılı bir performans kilit bir adım damla kaplama önce dokuların mekanik bozulma NTHi (adım 7.10). EpiAirways birbirinden çok farklı ve birden fazla hücre tipleri oluşur, dokularda saponin tedaviden sonra bile, bir hücre tek tabaka olarak parçalanır kadar kolay değildir. Buna ek olarak, NTHi herkesin bildiği gibi dokuların ayrıştırılmasına yönelik çabalara yardım bu bileşiklere duyarlıdır. Bu nedenle, 26 gauge iğne ile hücre süspansiyonu geçen içselleştirilmiş veya hücre ile ilişkili bakteri tutarlı ve tekrarlanabilir kantifikasyon oluşturmak için yeteneğimizi büyük ölçüde artırır bulduk.
Sonra bu tekniği hakim, aynı zamanda araştırmacı, belirli genetik mutasyonların etkilerini karakterize etmek için izin, yabani tip ebeveynlere kıyasla hayatta kalmak için mutant bakteri suşlarının bağıl yeteneğini araştırmak için kullanılan olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz yararlı tartışmalar için teşekkür Patrick Hayden (Mattek) ve Robert Smith ve EM becerileri Gürcistan Sağlık Bilimleri Üniversitesi Libby Perry. Bu çalışmada DAD NIDCD hibe DC010187 tarafından finanse edildi
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saponin | Calbiochem | 558255-25GM | 1% in D-PBS without calcium or magnesium, filter sterilize |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline with calcium and magnesium | Lonza Inc. | 17-513Q | |
| 1 X Dulbecco’s phosphate-buffered saline without calcium or magnesium | Lonza Inc. | 17-515Q | |
| EpiAirway antibiotic-free tissues | MatTek Corp. | AIR-100-ABF | |
| EpiAirway antibiotic-free maintenance media | MatTek Corp. | AIR-100-MM-ABF | Supplied with kit |
| 10X phosphate-buffered saline solution | EMD Millipore | 6506 | Dilute to 1X before use |
| Gelatin | JT Baker | 2124-01 | Add to a final concentration of 0.1% in 1 X PBS and autoclave |
| Difco GC Medium Base (chocolate agar) | VWR international | 90002-016 | Autoclave 36 g in 500 ml ddH2O and cool to 60°C |
| BBL Hemoglobin (chocolate agar) | VWR international | 90000-662 | Autoclave 10 g in 500 ml ddH2O, cool to 60°C and mix with the GC medium base above |
| BD BBL IsoVitaleX enrichment (chocolate agar) | VWR international | 90000-414 | Cool the mixture of GC medium base and hemoglobin to 55°C and add 10 ml of rehydrated IsoVitaleX, pour chocolate agar plates |
| Dissecting forceps, fine tip, curved | VWR international | 82027-406 | |
| Self-sealing sterilization pouches | VWR international | 89140-802 | |
| Gentamicin sulfate, 10 mg/ml | Lonza Inc. | 17-519Z | Add 10 microliters/ml to EpiAirway MM for the gentamicin kill |
References
- Murphy, T. F., Apicella, M. A. Nontypeable Haemophilus influenzae: a review of clinical aspects, surface antigens, and the human immune response to infection. Rev. Infect. Dis. 9, 1-15 (1987).
- Murphy, T. F., Faden, H., Bakaletz, L. O., Kyd, J. M., Forsgren, A., Campos, J., Virji, M., Pelton, S. I. Nontypeable Haemophilus influenzae as a pathogen in children. Ped. Infect. Dis. J. 28, 43-48 (2009).
- Hotomi, M., Arai, J., Billal, D. S., Takei, S., KIkeda, Y., Ogami, M., Kono, M., Beder, L. B., Toya, K., Kimura, M., Yamanaka, N. Nontypeable Haemophilus influenzae isolated from intractable acute otitis media internalized into cultured human epithelial cells. Auris Nasus Larynx. 37, 137-144 (2010).
- Chemuturi, N. V., Hayden, P., Kalausner, M., Donovan, M. D. Comparison of human tracheal/bronchial epithelial cell culture and bovine nasal respiratory explants for nasal drug transport studies. J. Pharm. Sci. 94, 1976-1985 (2005).
- Sharma, M., Schoop, R., Hudson, J. B. The efficacy of Echinacea in a 3-D tissue model of human airway epithelium. Phytother. Res. 24, 900-904 (2010).
- Sexton, K., Balharry, D., BeruBe, K. A. Genomic biomarkers of pulmonary exposure to tobacco smoke components. Pharmacogenet Genomics. 10, 853-860 (2008).
- Babu, R. J., Dayal, P., Singh, M. Effect of cyclodextrins on the complexation and nasal permeation of melatonin. Drug Deliv. 6, 381-388 (2008).
- Balharry, D., Sexton, K., BeruBe, K. A. An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane. Toxicology. 244, 66-76 (2008).
- Fahy, J. V., Dickey, M. D. Airway mucus function and dysfunction. N. Engl. J. Med. 363, 2233-2247 (2010).
- Huang, Y., Mikami, F., Jono, H., Zhang, W., Weng, X., Koga, T., Xu, H., Yan, C., Kai, H., Li, J. -D. Opposing roles of PAK2 and PAK4 in synergistic induction of MUC5AC mucin by bacterium NTHi. 359, 691-696 (2007).
