Summary
Vi erbjuder en kostnadseffektiv och snabb molekylär genotypning protokoll som använder olika specifika PCR-primers som riktar DNA-sekvens skillnader inom kloroplasten trnL-F spacerområdet att skilja mellan sorter av
Abstract
Vild-typ I. cylindrica (cogongrass) är en av de tio värsta invasiva växter i världen, negativt påverkar jordbruks-och naturresurser i 73 olika länder i Afrika, Asien, Europa, Nya Zeeland, Oceanien och Amerika 1-2. Cogongrass bildar snabbt sprider och monodominant står att förflytta en stor variation av inhemska växtarter och i sin tur hotar de inhemska djur som är beroende av de fördrivna inhemska växtarter för foder och skydd. För att lägga till problemet en prydnadsväxt sort [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] är allmänt marknadsförs under namnen Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, och japanska blod gräs (JBG). Denna mångfald är förmodat steril och icke-invasiv och anses vara en önskvärd ornamental för sina rödfärgade blad. Under de rätta förutsättningarna, kan JBG producera livskraftiga utsäde (Carol Holko, 2009 personlig kommunikation) och kan återgå till en grön invasive form som ofta är omöjlig att skilja från cogongrass som det tar på utmärkande egenskaper vildtyp invasiv variation 4 (figur 1). Detta gör identifiering med morfologi en svår uppgift även för välutbildade botanister. Återgång av JBG till en aggressiv gröna fenotyp är inte heller ovanligt. Använda sekvens jämförelser av kodning och variabla regioner i både kärnvapen och kloroplast-DNA, har vi bekräftat att JBG har återgått till den gröna invasiva inom delstaterna Maryland, South Carolina och Missouri. JBG har sålts och planteras i nästan alla stater i kontinentala USA där det inte finns en aktiv cogongrass angrepp. Omfattningen av återgå problem i inte väl förstådd, eftersom återgick växter är dokumenterade och ofta förstörs.
Tillämpningen av denna molekylära protokoll ger en metod för att identifiera JBG återgår och kan hjälpa till att hålla dessa sorter från co förekommande enND hybridiserande eventuellt. Cogongrass är en obligat outcrosser och när korsade med en annan genotyp, kan producera livskraftiga vinden spridda frön som sprider cogongrass över stora avstånd 5-7. JBG har en något annorlunda genotyp än cogongrass och kan vara i stånd att bilda viabla hybrider med cogongrass. Om du vill lägga till problemet är JBG mer kall och skugga toleranta än cogongrass 8-10, och genflöde mellan dessa två sorter kommer förmodligen att generera hybrider som är mer aggressiva, skugga tolerant, och kall hardy än vildtyp cogongrass. Medan vildtyp cogongrass närvarande infests över 490 miljoner hektar världen över, i sydöstra USA är det infests över 500.000 hektar och kan ockuperar större delen av USA som den snabbt sprider sig norrut på grund av dess breda nisch och geografiska potential 3,7,11. Potentialen för en genetisk korsning är ett allvarligt bekymmer för USDA-APHIS Federal skadliga Week Program. För närvarande är det förbjudet att USDA-APHIS JBG i stater where det finns stora cogongrass angrepp (t.ex. Florida, Alabama, Mississippi). Kan dock hindra de två sorterna genom att kombinera visa sig vara mer svårt som cogongrass och JBG utöka sina distributioner. Dessutom är fördelningen av JBG återkomma närvarande okända och utan förmåga att identifiera dessa sorter morfologi, kan vissa cogongrass infestationer vara resultatet av JBG återgår. Olyckligtvis aktuella molekylära metoder för identifiering förlitar sig typiskt på AFLP (Amplifierade fragment length polymorphisms) och DNA-sekvensering, av vilka båda är tidskrävande och kostsamt. Här presenterar vi den första kostnadseffektiva och pålitliga PCR-baserad molekylär genotypning metod för att noggrant skilja mellan cogongrass och JBG återställa.
Protocol
1. Provtagning och Preservation
Denna metod har utvecklats och testats med färska, frysta, och nyligen torkade blad vävnader.
- Identifiera cogongrass och / eller JBG vävnader med hjälp av en taxonom som specialiserat sig på gräset artidentifiering. Med sina röda blad är dekorativt JBG enkelt att visuellt skilja från vildtyp cogongrass och JBG återgå, men cogongrass och JBG återkomma är nästan omöjlig att skilja från varandra. Cogongrass och JBG återgått fenotypen har gröna, längre blad, betydligt större och längre jordstammar, och mer bladyta än JBG 12 (figur 1).
- Fresh bladvävnad ger den mest förekommande och högsta kvalitet DNA och kan hämtas från fält eller växthus odlas I. cylindrica växter. Om färsk vävnad skall användas, extrahera DNA inom 3 timmar efter uppsamling för att förhindra nedbrytning. Annars framställa vävnad för lagring, keeping vävnaden sval och i direkt solljus.
- Att lagra vävnad för DNA-extraktion vid en senare tidpunkt, är det mest optimala metoden för att frysa och lagra vävnad vid -80 ° C omedelbart. Tillåter inte den frysta vävnaden att tina före DNA-extraktion. Överföra den frysta vävnaden till flytande kväve före slipningssteg för DNA-extraktion för att förhindra upptining.
- Om en -80 ° C frys inte är tillgänglig, torr vävnaden omedelbart. För torr lagring placerar vävnaden i ett papperskuvert och förvara kuvertet i dehydratiserad kiselgel eller andra aktiva torkmedel vid rumstemperatur. En liten mängd av indikator kiseldioxid blandas med icke-indikerar kiseldioxid kommer att säkerställa att kisel är fullt uttorkad och passar för torkning växtvävnad.
- Använda minst 10 gånger mer silikagel än färska bladvävnad vikt. Växtvävnad bör torka inom 24 timmar. Kvalitet och kvantitet av DNA minskas genom torrt lagring under tiden (som i fallet med herbarium provets).
2. DNA-extraktion
För att extrahera DNA från växtvävnad, följ DNeasy Anläggningen Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA; Cat # 69.104 eller 69.106) tillverkarens anvisningar med en mindre modifiering. Istället för att använda den föreslagna mindre än 100 mg färsk vävnad eller mindre än 20 mg torr vävnad per kolumn, mala större än 100 mg, och sedan överföra 100 mg från färsk eller frusen vävnad (eller> 20 mg av torr vävnad) till lämpliga rör för extraktion. Kärnkraft och plastid DNA extraheras samtidigt.
- Innan du börjar dessa förfaranden, kontrollera att etanol till buffertar AP3 / E och AW.
- Mala> 100 mg färsk eller frusen bladvävnad (eller> 20 mg torr bladvävnad) till ett fint pulver med användning av tre omgångar av flytande kväve med målning i en kyld mortel och mortelstöt. Otillräcklig störning av det använda utgångsmaterialet eller otillräcklig lys kan också leda till lägre utbyten av DNA. Försiktigt slipa TissUE och inte överbelasta kolumnerna med för mycket vävnad.
- Överför 100 mg frysta pulvret från färsk eller frusen vävnad (eller 20 mg av pulvret från torr vävnad) till en 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 400 | il buffert AP1 och 4 pl av RNas A. Varje rör kan placeras i en liten kuggstång på en balansera att övervaka den korrekta vikten av vävnad per rör.
- Virvel eller skaka provet (proverna) för att blanda och inkubera under 10 min vid 65 ° C, att vända röret (n) 2-3 gånger under inkubation.
- Tillsätt 130 pl av Buffert AP2 till varje prov. Blanda genom att vända röret (s) flera gånger, och inkubera i 5 minuter på is.
- Pipettera varje lysat i en separat QIAshredder Mini spinnkolonn och placera varje kolumn i en 2 ml uppsamlingsrör (medföljer kitet). Centrifug kolumn (er) för 2 min vid 20.000 xg (~ 14.000 rpm), och överför varje genomströmning fraktionen till ett nytt rör (medföljer inte kitet) utan att störa någon bildas pellet.
- Tillsätt 1,5 volymer Buffert AP3 /E och blanda genom pipettering.
- Överföra 650 pl av blandningen till en DNeasy Mini spinnkolonn i en 2 ml provrör. Centrifug kolonn (er) under 1 minut vid 6000 x g (~ 8000 rpm), och kassera genomströmning. Upprepa detta steg med resten av blandningen för varje prov.
- Placera spinnkolonn (er) i en ny 2 ml provrör (er), och tillsätt 500 pl av Buffert AW till toppen av varje kolonn. Centrifug kolonn (er) under 1 minut vid 6000 x g (~ 8000 rpm), och kasseras genomflöde.
- Tillsätt ytterligare 500 pl av Buffert AW till toppen av varje kolonn. Centrifugera i 2 min vid 20.000 x g (~ 14.000 rpm). Detta steg kommer att torka kolumnen, vilket tar bort eventuell kvarvarande etanol som finns i de buffertar som kan hämma PCR.
- Överför varje dragning kolumn i en ny 1,5 ml mikrocentrifug provrör. Tillsätt 100 pl buffert AE till toppen av varje kolonn för eluering, och inkubera-kolonn (er) under 5 min vid rumstemperatur. Centrifug kolonn (er) under 1 minut vid 6000 x g (cirka 8000 rpm) för att samla upp DNA.
- Upprepa dessa elueringssteg en gång under eluering av DNA i samma 1,5 ml mikrocentrifugrör och gav 200 pl prov. Lagra DNA-prover vid -20 ° C fram till användning. DNA-koncentrationer beroende på vävnadstyp och lagringsförhållanden. Optimala utbyten erhålles då eluering DNA med totalt 200 | il buffert AE, men kan koncentrationerna ökas om elueringsvolymer reduceras till så lite som 50 | il.
3. Kontroll av DNA-kvalitet och kvantitet
- Testa kvaliteten och kvantiteten av extraherat DNA före PCR inställning med hjälp av en spektrofotometer eller fluorometer och gelelektrofores. Detta kommer att bidra till framgång för efterföljande steg.
- Användning av en spektrofotometer, kvalitet test-DNA och kvantitet. Goda DNA avkastning bör vara mellan 50 och 150 ng / l med 260/280 och 230/280 nyckeltal nära 2,0. Som ett exempel visar fig. 2 av god kvalitet resultat med användning av NanoDrop spektrofotometer (ThermoScientific, Wilmington, DE).
- Utföra elektrofores med användning av en standard 1% agarosgel. Kontrollera förekomsten av relativt stora band (> 10 Kb) utan för lite ränder från RNA föroreningar (Figur 3).
- Om DNA-koncentrationen är hög, utspädda DNA-prover till 70 ng / pl för efterföljande steg.
4. PCR-primers
PCR-primers som används i detta protokoll är baserade på sekvenser skillnader mellan plastid trnL-F spacer regionen cogongrass och JBG genotyper. Dessa skillnader kommer i form av SNP (Single nucleotide polymorphisms) och InDels (Infogat och borttaget) som gjorde utvecklingen av olika specifika primers genom att placera primrarna på platser av unika sekvenser (Figur 4).
- Kvaliteten på primers kan ha en betydande inverkan på PCR-resultaten. Beställ primers från ett välrenommerat företag. Vi beställer våra primers från Oblique Bio, Inc. (:/ / Www.obliquebio.com/web/ "target =" _blank "> http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL), begära bara vanliga avsaltnings förfaranden.
- trnL-F positiva kontroll primers: Detta primeruppsättningen förstärker plastid trnL-F spacerområdet flesta gräs taxa 11-13 och tjänar som en bra positiv kontroll (vilket resulterar i en 890 bp band).
Namn Sekvens trnF (GAA)-F 5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 ' trnL (5 'exon)-C 5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 ' - Vildtyp cogongrass primrar: Denna primer uppsättning är specifik för cogongrass och inte amplifiera trnL-F-regionen av JBG genotyper. De inställda resulterar i ett band som är 595 bp.
Namn Sequence trnLF-C-F1 5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 ' trnLF-C-R1 5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 ' - JBG och JBG Återställ primers: Detta primeruppsättning är specifikt för JBG genotyp och inte förstärker trnL-F regionen cogongrass. De inställda resulterar i ett band som är 594 bp.
Namn Sekvens trnLF-R-F2 5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 ' trnLF-R-R2 5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 ' - Ätersuspendera varje primer i tillräcklig volym av nukleasfritt ddHaO 2 O för erhållande av en 100 mM förrådslösningar som kan lagras vid -20 ° C, på lång sikt.
- Späd ut varje primer mald till 12 mM före PCR installationsstegen.
5. PCR-inställning
DNA-extraktioner amplifieras med användning av var och en av de ovan angivna primeruppsättningar i PCR-reaktioner. Inkludera en positiv kontroll för att säkerställa att alla PCR-reagenser fungerar bra och kan generera ett band. Innefattar en negativ kontroll för att säkerställa att ingen av de reagens är kontaminerade med oönskad DNA. Den negativa kontrollen inte innehåller någon-mall och bör resultera i inget band produktion.
- Förbered alla reaktioner i tunnväggiga PCR-rör för att möjliggöra bättre värmeöverföring mellan thermocycler blocket och provet. Vi rekommenderar att du använder kommersiellt tillgängliga aerosol-fria pipettspetsar för att undvika kontaminering.
- För varje isolerad DNA-prov, inrättat 50 pl PCR-reaktioner med användning var och en av de ovanstående primeruppsättningar i 0,2-ml tunnväggiga PCR-rör genom tillsats av följande reagens på is i den ordning som anges nedan. Om flera prover förbereds, gör en cocktail som innehåller alla reagenser, med undantagav DNA-mall för att upprätta enhetliga villkor mellan alla reaktioner.
PCR-reagens Använda volymen Slutlig Concetration Nukleasfritt ddHaO 2 O 40,5 | il 10X Fördel 2 PCR-buffert (Clonetech, CA) 5,0 pl 10% (volym / volym) Fördelen UltraPure PCR dNTP-blandning (10 mM vardera, Clonetech, CA) 1,0 pl 0,2 mM Primer 1 (12 pm i ddHaO 2 O) 1,0 pl 0,24 pM Primer 2 (12 pm i ddHaO 2 O) 1,0 pl 0,24 pM Fördel 2 Polymeras Mix (Clonetech, CA) 0,5 pl 1% (volym / volym) DNA-extraktion(70 ng / reaktion, justera ddHaO 2 O volym som behövs) 1,0 pl 1,4 ng / ^ il Totalt: 50,0 | il - För att säkerställa att alla PCR-reagens fungerar väl, ställa den positiva kontrollen med hjälp av positiva kontroll primers. Detta primerset fungerar lika bra för cogongrass, JBG, JBG återkomma och andra gräs och kommer att resultera i ett band som är 890 bp.
- Ställa den negativa kontrollen med användning av samma kontroll primeruppsättning som positiv kontroll, med användning av ddHaO 2 O i stället för DNA-extraktion. Om alla reagens är fria från DNA-kontaminerar, kommer denna reaktion att resultera i någon bandet.
- Om DNA-koncentrationen är låg, kan mer DNA sattes till varje reaktion, justering av mängden av nukleasfritt ddHaO 2 O används för att bringa den totala reaktionsvolymen till 50 | il. Inte använda mer än 5 | il DNA (10% av den totala volymen) per reaction kan som möjliga föroreningar som finns i DNA-proverna inhibera PCR-reaktioner.
6. PCR-cykling
- Utföra PCR-amplifieringar i en termocykelanordning utrustad med en uppvärmd lock med användning av följande PCR-cykelparametrar. Vi använder Mastercycle Pro S termocykler (Eppendorf, Hauppauge, NY) som för att fungera med vanliga temperaturförhållanden öka produktionstakten. Någon kvalitet termocykler bör utföra väl.
Cykel Denaturering Glödgning Polymerisation 1 2 min vid 95 ° C 2 30 sek vid 95 ° C 30 sek vid 61 ° C 90 sek vid 68 ° C 35 cykler 3 5 min vid 68 ° C Håll vid 4 ° C tills provet avlägsnas - Optimera förutsättningarna för PCR (inklusive primer glödgningstemperatur, tider förlängning, och antalet cykler) som behövs beroende på kvaliteten av DNA, primers, Taq-polymeras eller typ av termocykler används. Vi rekommenderar att du använder en gradient kan termocykler vid fastställandet av optimala glödgningstemperaturer.
- Om termocykler används inte har en uppvärmt lock, tillsätt 1 droppe mineralolja till den övre delen av varje prov för att förhindra avdunstning under PCR-cykling.
7. Gelelektrofores av PCR-produkter
Att visualisera resultaten av analysen, separata PCR-produkter på en 1% agarosgel med användning av standard-elektrofores.
- Kombinera 2 | il av en standard-DNA-laddningsbuffert (typiskt en 5x eller 6x lösning) med 5 | il av varje amplifierad PCR-produkt.
- Ladda prover på en 1% agarosgel innehållande EtBr (etidiumbromid för DNA-färgning) tillverkad med either TAE eller SB (natriumborat) buffertsystem 16. Vi använder 1 | il av en 10 mg / ml EtBr stamlösning per 100 ml 1% agaros (0,1 | ig / ml).
- Köra prover vid ~ 120 V tills färgfronten når tre fjärdedelar av den totala längden av gelén.
- Under UV-ljus (t.ex. ett kortvågigt box UV-ljus), inspektera de resulterande banden för att se om ett lämpligt fragment förstärks.
- Dokumentera gel och resulterande banden med hjälp av en Foto-dokumentationssystem eller kamera.
8. Representativa resultat
Efter visualisering av PCR-produkter, har cogongrass en unik bandmönster jämfört med den för JBG eller återgått JBG (figur 5). För varje DNA-prov bör trnL-F positiv kontroll primeruppsättning resultera i en enda hög intensitet bandet vid ~ 890 bp. Detta verifierar att alla PCR-reagens fungerar bra. På samma sätt bör den negativa kontrollen (ingen mall) reaktion innehåller inga band för alla primer set användas. Detta verifierar att ingen av de reagens var kontaminerade.
Om DNA-prov härlett från vildtyp cogongrass, en PCR-reaktion med användning av cogongrass-specifik primer uppsättning kommer att resultera i ett enda band vid ~ 595 bp medan JBG-specifika primrar kommer att resultera i någon bandet. På samma sätt om den DNA-prov härlett från JBG eller återgått JBG, kommer en PCR-reaktion med användning av JBG-specifik primer uppsättning resultera i ett enda band vid ~ 594 bp medan cogongrass-specifika primrar kommer att resultera i någon bandet. Eftersom JBG och återgick JBG har identisk nukleinsyrasekvens, kommer de att ha därmed identiska bandmönster. Om många prover ska jämföras på en gel på samma gång, rekommenderar vi att köra alla prover från varje primer ligger bredvid varandra, vilket gör det lättare att scanna proverna för positiva resultat.
Morfologiska skillnader mellan JBG och JBG återgår är ganska uppenbara (t.ex. röd färg på bladen och mindre tillväxten hos JB G vs gröna färgen, större kroppsstorlek och aggressiva tillväxt JBG återgå), så medan PCR-resultaten kommer att vara samma, JBG sorterna är lätt att skilja använda anläggningen morfologi.
Figur 1. Jämförelse av växthusgaser ökat Imperata cylindrica var. Koenigii (japanska blodet gräs), Återställde I. cylindrica var. koenigii (JBG Återställ) och I. cylindrica (vildtyp cogongrass).
Figur 2. Ett exempel på DNA-prover verifierade att använda en NanoDrop spektrofotometer. Notera att, oberoende av den använda spektrofotometern, bör 260/280 förhållandet vara nära 1,8 och 260/230 Förhållandet bör nära 2,0.
Figur 3. DNA-prover verifieras med användning av standard-elektrofores på en 1% agarosgel. En kommersiell DNA-markör, användes för storleksanalys. Bana # 4 är ett exempel på dålig kvalitet DNA-prov, som visar utsmetning och några RNA kontaminering.
Figur 4. Sekvensinpassningar av trnL-F regioner Imperata cylindrica var. Koenigii (japanska blodet gräs), Återställde I. cylindrica var. koenigii (JBG Återställ) och I. cylindrica (vildtyp cogongrass). Vertikala svarta pilar visar på skillnader i sekvenser till följd av SNP och InDels. Horisontella gröna pilarna anger positionerna av vildtyp cogongrass primrar som användes för cogongrass-specifik PCR. Horisontella röda pilarna indikerar poförvärv av JBG och JBG Revert primrar som användes för JBG-specifik PCR.
Figur 5. Representativa resultat av gelelektrofores av PCR-produkter härledda från cogongrass, JBG och JBG återgå DNA-prover i kombination med cogongrass-och JBG-specifika primrar samt trnL-F positiv kontroll och en kontroll utan templat negativ kontroll.
Discussion
Den amerikanska plantskola och industri landskap frodas på odla och sälja exotiska och nya växtarter. Detta, i kombination med den växande globaliseringen av handeln, ökar chanserna att en invasiv växtarter kommer att träda, etablera och sprida i USA Förmågan att federalt reglera sådana växter är beroende av information som ofta inte tillgängliga, inklusive möjligheten att bli invasiv , korrekt taxonomi, och genetiska särskiljbarhet från inhemska och vilda taxa. Eftersom vår kunskap om invasiva växter är ofta begränsad, har importerade växter med dolda invasiva egenskaper har frivilligt införts bara att lära sig senare att de invaderar våra jordbruks-och naturresurser. Detta protokoll syftar till att åtgärda sådana problem som är förknippade med I. cylindrica sorter genom att tillhandahålla den första förenklade molekylär metod som exakt kan skilja mellan vildtyp cogongrass och återgick form av dess dekorativa JBG motsvarighet.
jove_content "> För utvecklingen av detta protokoll, var vild typ cogongrass samlas in från naturaliserade populationerna vid dammen Creek skogsbruk enheten i Santa Rosa County i närheten av Jay, FL i juni 2008. anskaffades från en kommersiell plantskola (Bluebird Nursery, Inc JBG ). i juni 2008 samt från en husägare samling i Columbia, återgår MO JBG erhölls från gård Campbell Geologiska museet vid Clemson University, SC i juni 2008,. från University Park i Riverdale, MA i juni 2009, och från gården av en husägare i Columbia, MO 2009 (identifieras av Leland Cseke). var alla plantor kvar i ett växthus ligger vid University of Alabama i Huntsville (Huntsville, AL).Genetisk sekvensering av DNA samlas in från dessa växter inkluderade på djupet jämförelse av 9 oberoende DNA-regioner som vanligtvis används för streckkodsläsare växter 2. I samtliga fall var de sekvenser av JBG en 100% matchning till de av JBG återgå, vilket bidrar till attverifiera att JBG verkligen återgå till en grön, invasiv form. Endast den nukleära ITS och kloroplasttransitpeptidsekvensen trnL-F regioner har skillnader som kan användas för att genetiskt skilja mellan cogongrass och JBG. ITS-regionen har totalt 3 SNP (single nucleotide polymorphisms) mellan cogongrass och JBG, medan trnL-F regionen har 2 SNP och 2 InDels (infogningar och borttagningar). Dessa genetiska skillnader tillåts variation-specifika PCR-primers för att tas fram som kan skilja mellan vildtyp cogongrass och JBG återgår. De mest tillförlitliga resultat har kommit från primrar härledda från plastiden trnL-F-regionen. Således är detta protokoll baserat på sekvensskillnader mellan de trnL-F regioner av kloroplast genomet av cogongrass, JBG och återgick JBG (figur 4).
Bidra till att skapa primers som är mer specifika för de sorterna i fråga och för att bidra till att undvika falska positiva från närbesläktade arter, all kända trnL-F-sekvenser enligt I. cylindrica sorter jämfördes med trnL-F-sekvenser från närstående gräsarter (43 fristående sekvenser från 29 arter, t.ex. Cymbopogon citratus och Sorghastrum incompletum och Coix Lacryma-Jobi, Miscanthus sinensis, Saccharum officinarum och Sorghum halepense). Även om vi granskat olika specifika primersekvenserna i 29 arter av gräs, specificiteten av sorten-specifika primers har inte heltäckande undersökts för dess förmåga att förstärka DNA från de flesta andra gräsarter. Följaktligen bör vävnad användes för DNA-extraktion noggrant identifieras som I. cylindrica före start detta protokoll. Om gräset inte kan identifieras som antingen cogongrass eller JBG, så föreslår vi att sekvensera PCR-produkten att se till att sekvenser är en exakt matchning för att cogongrass eller JBG. För närvarande är den mest exakta metoden för att kontrollera identiteten hos en viss gräs prov att utföra PCR på både tRNL-F och ITS-regionerna, följt av sekvensen kontroll av PCR-produkter och jämförelse av sekvenserna med kända sekvenser från exakt identifieras taxa. DNA kan amplifieras med användning av kontroll-primrar som beskrivs i detta protokoll (till trnL-F-regionen) eller andra primrar som är tillgängliga i andra publikationer 13-15. Sekvensering är mycket mer arbete och kostnader intensiv än att använda vårt förenklat förfarande.
Kvaliteten hos de primers som användes för PCR är kritisk för framgången av förfarandet. Vi har gjort primers för detta förfarande kan erhållas från Oblique Bio, Inc. ( http://www.obliquebio.com/web/ , Huntsville, AL). Fördelen med att beställa primers från Oblique Bio är att de lagrar stora mängder portioner av varje primer från identiskt prov serier som de primers vi använde för optimering i vårt laboratorium. Därför primers inte bara samma sekvens, men thej kommer från exakt samma produktionen mycket som användes i detta protokoll. Använda primers från samma parti, kan bidra till att undvika främmande variabler i det förfarande som kan bero på skillnader i kvaliteten på PCR-primers. På samma sätt kommer medan andra Taq-polymeraser bör fungera bra för PCR, kvaliteten på den använda Taq-polymeras har en inverkan på kvaliteten av PCR-resultat. För att möjliggöra bättre samstämmighet i PCR-reagens, har vi optimerat protokollet med reagens från Clontech. Fördel 2-polymeras (Clontech, Mountain View, CA, Cat # 639.201 eller 639.202) är en blandning av en robust, varm-start Taq polymeras och en korrekturläsning enzym som bidrar till att ge hög specificitet och mer exakta förstärkningar.
Eftersom detta protokoll bygger på kloroplast-DNA, som modern ärvs i gräs kan hybridisering händelser mellan cogongrass och JBG genotyper inte fångas med vår molekylär identifiering förfarande. I fall där hypridization är hjulupphcted rekommenderar vi att du använder nukleära regioner som ärvs från båda föräldrarna. Den vanligaste icke-plastid variabel region att tänka på anläggningen genotypning är den nukleära ribosomala ITS regionen 13-15,17. För närvarande gör vi framsteg mot multiplexering förstärkningen av kloroplasten trnL-F region med den nukleära ITS regionen i samma PCR rör. Multiplexering plastid med nukleära DNA-regioner skulle potentiellt kringgå begränsningarna med att använda antingen ensam, men sådana metoder kräver optimering och ytterligare utvärdering för att fastställa genomförbarheten från fall till fall. Användningen av kvantitativ realtids-PCR (qPCR) och nyare teknik, t.ex. Molecular Beacons (fluorescerande primer prober), är också utvärderas som felsäkra och korrekt sätt växt gentypning.
Protokollet som presenteras här ger en snabb och tillförlitlig metod för att särskilja den JBG återgå från den hos vildtyps-cogongrass. Vi uppmuntrar använderrs av detta protokoll för att kontakta oss för att rapportera resultat som härrör från användningen av detta protokoll. Sådan delad information kommer bidra till att ge information om fördelningen av JBG återgår. Detta kommer också att hjälpa tillsynsmyndigheter på USDA fatta välgrundade beslut om åtgärder som kan behöva att kringgå spridning och potential hybridisering av de mycket invasiva cogongrass sorter.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Alan Tasker (USDA-APHIS, Riverdale, MD), Stephen Compton (Clemson), Sherry Aultman (Clemson), Craig Ramsey (USDA-APHIS, Fort Collins, CO) och Betty Marose (UMD) för att få hjälp med att få prover . Vi tackar elever Andrew Adrian (UA-Huntsville) och Derek Thacker (UA-Huntsville) för deras hjälp med att testa detta protokoll, och Joseph Herdy för sitt arbete i inspelningen av videon. Detta arbete har finansierats av National Fish and Wildlife Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 or 69106 | Any reputable genomic plant DNA kit that yields good quality DNA should work fine for these procedures. |
| trnF(GAA)-F | Oblique Bio, Inc. | 3-0578 | Forward positive control primer |
| trnL(5’ exon)-C | Oblique Bio, Inc. | 3-0579 | Reverse positive control primer |
| trnLF-C-F1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0864 | Forward wild-type cogongrass primer |
| trnLF-C-R1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0865 | Reverse wild-type cogongrass primer |
| trnLF-R-F2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0866 | Forward JBG and JBG revert primer |
| trnLF-R-R2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0867 | Reverse JBG and JBG revert primer |
| Advantage UltraPure PCR dNTP Mix | Clontech Laboratories | 639125 | |
| Advantage 2 Polymerase | Clontech Laboratories | 639201 or 639202 | A good proof-reading, hot-start Taq polymerase |
References
- Holm, L. G., Pancho, J. V., Herberger, J. P., Plucknett, D. L. A Geographical Atlas of World Weeds. , Krieger Publishing Company. Malabar, Florida, U.S. (1979).
- CABI, Crop Protection Compendium. Commonwealth Agricultural Bureau International (CABI). , Wallingford, UK. (2007).
- MacDonald, G. E. Cogongrass (Imperata cylindrica) - Biology, ecology, and management. Critical Reviews in Plant Sciences. 23, 367-380 (2004).
- Talley, S. M., Cseke, L. J. Molecular diagnostic technologies for invasive plants. CPHST Fort Collins Laboratory 2009 Annual Report. Zink, R. , USDA-APHIS-PPQ-CPHST. Fort Collins, Colorado. 27-28 (2009).
- Dozier, H., Gaffney, J. F., McDonald, S. -K., Johnson, E. R. R. L., Shilling, D. G. Cogongrass in the United States: History, ecology, impacts, and management. Weed Technology. 12, 737-743 (1998).
- Chikoye, D., Ekeleme, F. Weed flora and soil seedbanks in fields dominated by Imperata cylindrica in the moist savannah of West Africa. Weed Research. 41, 475-490 (2001).
- Weber, E. Invasive Plant Species of the World: A Reference Guide to Environmental Weeds. , CABI Publishing. Wallingford, UK. (2003).
- Patterson, D. T. Shading effects on growth and partitioning of plant biomass in Cogongrass (Imperata cylindrica) from shaded and exposed habitats. Weed Science. 28, 735-740 (1980).
- Cole, J. T., Cole, J. C. Ornamental grass growth response to three shade intensities. Journal of Environmental Horticulture. 18, 18-22 (2000).
- Bryson, C. T., Koger, C. H., Byrd, J. D. Effects of temperature and exposure period to heat on cogongrass (Imperata cylindrica) viability. Weed Technology. 21, 141-144 (2007).
- Capo-chichi, L. J. A., Faircloth, W. H., Williamson, A. G., Patterson, M. G., Miller, J. H., van Santen, E. Invasion Dynamics and Genotypic Diversity of Cogongrass (Imperata cylindrica) at the Point of Introduction in the Southeastern United States. Invasive Plant Science and Management. 1 (2), 133-141 (2008).
- Talley, S. M., Ramsey, C. L. Experimentally assessing the invasive potential of plants. CPHST Laboratory 2009 Annual Report. Zink, R. , USDA-APHIS-PPQ-CPHST. Fort Collins, Colorado. 29-30 (2009).
- Hodkinson, T. R., Chase, M. W., Lledó, M. D., Salamin, N., Renvoize, S. A. Phylogenetics of Miscanthus, Saccharum and related genera (Saccharinae, Andropogoneae, Poaceae) based on DNA sequences from ITS nuclear ribosomal DNA and plastid trnLintron and trnL-F intergenic spacers. J. Plant Res. 115, 381-392 (2002).
- Kress, W. J., Wurdack, K. J., Zimmer, E. A., Weigt, L. A., Janzen, D. H. Use of DNA barcodes to identify flowering plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (23), 8369-8374 (2005).
- Roodt-Wilding, R., Spies, J. J. Phylogenetic relationships in southern African chloridoid grasses (Poaceae) based on nuclear and chloroplast sequence data. Systematics and Biodiversity. 4, 401-415 (2006).
- Brody, J. R., Kern, S. E. Sodium boric acid: a Tris-free, cooler conductive medium for DNA electrophoresis. BioTechniques. 36, 214-216 (2004).
- Chou, C. -H., Tsai, C. C. Genetic variation in the intergenic spacer of ribosomal DNA of Imperata cylindrica (L.) Beauv. var. major (Cogongrass) populations in Taiwan. Botanical Bulletin of Academia Sinica (Taipei). 40, 319-332 (1999).
