Summary
Vi tilbyr en kostnadseffektiv og rask molekylær genotyping protokoll som sysselsetter rekke spesifikke PCR primere som mål DNA sekvens forskjeller innenfor kloroplast trnL-F spacer regionen for å skille mellom varianter av
Abstract
Wild-type I. cylindrica (cogongrass) er en av de ti verste invaderende plantene i verden, negativt påvirker landbruks-og naturressurser i 73 forskjellige land over hele Afrika, Asia, Europa, New Zealand, Oseania og Amerika 1-2. Cogongrass danner hurtig spredning, monodominant stands som fortrenger et stort utvalg av innfødte plantearter og i sin tur truer de innfødte dyrene som er avhengige av de fordrevne innfødte planteartene for grovfôr og husly. Å legge til problemet, en ornamental variasjon [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] er viden markedsført under navnene Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron og japansk blod gress (JBG). Dette mangfoldet er putatively sterilt og ikke-invasiv og regnes som en ønskelig ornamentale for sine rød-fargede bladene. Men under de riktige forholdene, kan JBG produsere levedyktig avkom (Carol Holko, 2009 personlig kommunikasjon) og kan gå tilbake til en grønn jegnvasive form som ofte er umulig å skille fra cogongrass som det tar på de karakteristiske kjennetegn ved villtype invasive utvalg 4 (figur 1). Dette gjør identifisering ved hjelp av morfologi en vanskelig oppgave selv for veltrente plante taksonomer. Hjemfall av JBG til en aggressiv grønn fenotype er heller ikke en sjelden foreteelse. Bruke sekvens sammenligninger av koding og variable regioner i både kjernekraft og kloroplast DNA, har vi bekreftet at JBG har hjemfalt til det grønne invasiv innenfor statene Maryland, South Carolina, og Missouri. JBG er solgt og plantet i omtrent hver eneste stat i det kontinentale USA, hvor det ikke er en aktiv cogongrass infestation. Omfanget av den tilbake problem i ikke godt forstått fordi hjemfalt planter er udokumentert og ofte ødelagt.
Anvendelse av denne molekylære protokollen gir en metode for å identifisere JBG går tilbake og kan bidra til å holde disse variantene fra co forekommende ennd muligens hybridizing. Cogongrass er en obligat outcrosser og når krysset med en annen genotype, kan produsere levedyktig vind-dispergert frø som spres over store avstander cogongrass 5-7. JBG har en litt annen genotype enn cogongrass og kan være i stand til å danne levedyktige hybrider med cogongrass. Å legge til problemet, er JBG mer kald og skygge tolerant enn cogongrass 8-10, og genflyt mellom disse to variantene er sannsynlig å generere hybrider som er mer aggressive, skygge tolerant, og kaldt hardfør enn vill-type cogongrass. Mens villtype cogongrass tiden infiserer over 490 millioner hektar verden over, i Sørøst USA den infiserer over 500.000 hektar og er i stand til opptar det meste av USA som den raskt sprer seg nordover på grunn av sin brede nisje og geografisk potensial 3,7,11. Potensialet for en genetisk kryssing er en alvorlig bekymring for USDA-APHIS Federal skadelige Week Program. Foreløpig forbyr USDA-APHIS JBG i stater hvere er det store cogongrass angrep (f.eks Florida, Alabama, Mississippi). Imidlertid kan hindre de to varianter fra kombinere bevise mer vanskelig som cogongrass og JBG utvide sine distribusjoner. Videre er fordelingen av den JBG tilbake foreløpig ukjent, og uten evne til å identifisere disse varianter gjennom morfologi, kan enkelte cogongrass infestations være resultat av JBG går tilbake. Dessverre, dagens molekylære metoder for identifikasjon typisk stole på AFLP (Amplified Fragment Length polymorfismer) og DNA-sekvensering, som begge er tidkrevende og kostbart. Her presenterer vi den første kostnadseffektiv og pålitelig PCR-baserte molekylære genotyping metode for å nøyaktig skille mellom cogongrass og JBG tilbake.
Protocol
1. Prøvetaking og konservering
Denne metoden ble utviklet og testet ved hjelp av ferske, frosne og nylig tørket blad vev.
- Identifisere cogongrass og / eller JBG vev ved hjelp av en taksonom som spesialiserer seg på gresset artsidentifikasjon. Med sine lyse røde blader, er ornamental JBG lett å visuelt skille fra villtype cogongrass og JBG tilbake, men cogongrass og JBG tilbake er nesten umulig å skille fra hverandre. Cogongrass og JBG hjemfalt fenotypen har grønne, lengre blader, betydelig større og lengre rotstokker, og mer bladareal enn JBG 12 (figur 1).
- Fersk blad vev gir den mest tallrike og høyeste kvalitet DNA og kan hentes fra felt eller drivhus vokst I. cylindrica planter. Hvis frisk vev skal benyttes, trekke ut DNA innen 3 timer etter innsamling for å hindre nedbrytning. Ellers forberede vev for lagring, keeping vevet kjølig og ut av direkte sollys.
- For å lagre vev for DNA-ekstraksjon på et senere tidspunkt, er den mest optimale metoden for å fryse og lagre vev ved -80 ° C umiddelbart. Ikke la den frosne vev å tine før DNA-ekstraksjon. Overfør den frosne vev til flytende nitrogen før sliping trinn av DNA-ekstraksjon for å hindre tining.
- Hvis en -80 ° C fryser ikke er tilgjengelig, tørr vevet umiddelbart. For tørr lagring, plasserer vevet inn i en papir konvolutt og lagre konvolutten i dehydrert silica gel eller andre aktive tørkemidler ved romtemperatur. En liten mengde indikator silika blandet med ikke-indikerer silica vil sikre at silika er fullt dehydrert og egnet for tørkeanlegg vev.
- Bruk minst 10 ganger mer silikagel enn ferskt blad vev etter vekt. Plantevevet bør tørke innen 24 timer. Kvaliteten og mengden av DNA reduseres gjennom tørr lagring over tid (som i tilfellet herbarium prøvens).
2. DNA-ekstraksjon
Hvis du vil trekke DNA fra plantevev, følg DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, Cat # 69104 eller 69106) produsentens instruksjoner med en mindre endring. I stedet for å bruke det foreslåtte mindre enn 100 mg fersk vev eller mindre enn 20 mg tørr vev for hver kolonne, male større enn 100 mg, og deretter overføre 100 mg fra fersk eller frossen vev (eller> 20 mg fra tørr vev) til egnede rør for utvinning. Kjerne-og plastid DNA ekstraheres samtidig.
- Før du starter disse prosedyrene, må du kontrollere at etanol ble lagt til buffere AP3 / E og AW.
- Grind> 100 mg av fersk eller frossen leaf vev (eller> 20 mg tørt blad vev) til et fint pulver ved hjelp av tre runder med flytende nitrogen med sliping i en kjølt morter. Utilstrekkelig forstyrrelse av utgangsmaterialet eller utilstrekkelig lysis kan også føre til lavere avkastning av DNA. Forsiktig slipe Tissue og ikke overbelaste kolonnene med for mye vev.
- Overfør 100 mg frossen pulver fra fersk eller frossen vev (eller 20 mg pulver fra tørr vev) til en 1,5 ml mikrosentrifuge tube inneholder 400 mL buffer AP1 og 4 mL av RNase A. Hvert rør kan plasseres i en liten stativ på en balansere å overvåke den riktige vekten av vev per rør.
- Vortex eller riste prøven (e) å blande og inkuber i 10 min ved 65 ° C, snu røret (e) 2-3 ganger i løpet inkubasjon.
- Legg 130 mL buffer AP2 til hver prøve. Bland ved å snu røret (e) flere ganger, og inkuber i 5 min på isen.
- Pipet hver lysate i et eget QIAshredder Mini spin kolonne, og plassere hver kolonne i en 2 ml samling rør (følger med kit). Sentrifuger kolonnen (e) for 2 min ved 20.000 xg (~ 14 000 rpm), og overføre hver gjennomstrømning fraksjon inn i et nytt rør (følger ikke med settet) uten å forstyrre noen dannet pellet.
- Tilsett 1,5 volum buffer AP3 /E, og bland ved pipettering.
- Overføring 650 mL av blandingen i en DNeasy Mini spin kolonne i en 2 ml samling rør. Sentrifuger kolonnen (e) for 1 min ved 6000 xg (~ 8000 rpm), og kast den gjennomstrømning. Gjenta dette trinnet med de resterende blandingen for hver prøve.
- Plasser spin kolonnen (e) inn i en ny 2 ml samling tube (r), og legge til 500 mL buffer AW til toppen av hver kolonne. Sentrifuger kolonnen (e) for 1 min ved 6000 xg (~ 8000 rpm), og forkaste gjennomstrømning.
- Legg til en annen 500 mL buffer AW til toppen av hver kolonne. Sentrifuger i 2 min ved 20.000 xg (~ 14 000 rpm). Dette trinnet vil tørke kolonnen, og dermed fjerne alle rester av etanol inneholdt i de buffere som kan hemme PCR.
- Overfør hver spin kolonne til en ny 1,5 ml mikrosentrifuge prøverør. Tilsett 100 mL buffer AE til toppen av hver kolonne for eluering, og inkuber kolonne (r) i 5 min ved romtemperatur. Sentrifuger kolonnen (e) for 1 min ved 6000 xg (~~~HEAD=NNS 8000 rpm) å samle DNA.
- Gjenta disse eluering skritt en gang, eluting DNA inn i den samme 1,5 ml mikrosentrifuge tube å gi 200 mL av prøven. Store DNA-prøver ved -20 ° C inntil bruk. DNA-konsentrasjoner avhenger vevstype og lagringsforhold. Optimale avlinger oppnås når eluting DNA med en total på 200 mL buffer AE, men kan konsentrasjonene økes dersom eluering volumer er redusert til så lite som 50 mL.
3. Verifikasjon av DNA kvalitet og kvantitet
- Test kvaliteten og kvantiteten av ekstrahert DNA før PCR oppsett ved hjelp av et spektrofotometer eller fluorometer og gel elektroforese. Dette vil bidra til å sikre suksess for etterfølgende trinn.
- Ved hjelp av et spektrofotometer, test DNA kvalitet og kvantitet. Gode DNA gir bør være mellom 50 og 150 ng / mL med 260/280 og 230/280 forholdstall nær 2,0. Som et eksempel viser figur 2 gode resultater ved hjelp av NanoDrop spektrofotometer (ThermoScientific, Wilmington, DE).
- Gjennomføre elektroforese bruker en standard 1% agarose gel. Kontroller av den relativt store band (> 10 Kb) uten å lite streker fra RNA forurensning (figur 3).
- Hvis DNA konsentrasjonen er høy, tynn DNA-prøver til 70 ng / mL for etterfølgende trinn.
4. PCR primere
De PCR primere som brukes i denne protokollen er basert på sekvens forskjeller mellom plastid trnL-F spacer regionen cogongrass og JBG genotyper. Disse forskjellene kommer i form av SNPs (single nukleotid polymorfismer) og InDels (Innsettinger og slettinger) som tillot utviklingen av variasjon-spesifikke primere ved å finne den primere på nettstedene til unike sekvenser (Figur 4).
- Kvaliteten på primere kan ha en betydelig innvirkning på PCR-resultater. Bestill primere fra et anerkjent selskap. Vi bestiller våre primere fra Oblique Bio, Inc. (:/ / Www.obliquebio.com/web/ "target =" _blank "> http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, Alabama), ber bare standard avsalting prosedyrer.
- trnL-F positive kontroll primere: Denne primer sett forsterker plastid trnL-F spacer regionen mest gress taxa 11-13 og fungerer som en god positiv kontroll (som resulterer i en 890 bp band).
Navn Sequence trnF (GAA)-F 5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 ' trnL (5 'exon)-C 5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 ' - Villtype cogongrass primere: Dette primer sett er spesifikk for cogongrass og ikke forsterke ikke trnL-F regionen JBG genotyper. De faste resulterer i et band som er 595 bp.
Navn Sequence trnLF-C-F1 5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 ' trnLF-C-R1 5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 ' - JBG og JBG Revert primere: Dette primer settet er spesifikt for JBG genotype og ikke forsterke ikke trnL-F regionen cogongrass. De faste resulterer i et band som er 594 bp.
Navn Sequence trnLF-R-F2 5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 ' trnLF-R-R2 5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 ' - Resuspender hver primer i nok volum av nukleasefritt DDH 2 O for å få en 100 mm lager løsninger som kan lagres ved -20 ° C, lang sikt.
- Fortynn hver primer lager til 12 mm før de PCR installeringsinstruksjonene.
5. PCR oppsett
DNA ekstraksjoner blir forsterket ved hjelp av hver av de ovennevnte primer settene i PCR reaksjoner. Inkluder en positiv kontroll for å sikre at alle PCR reagenser fungerer godt og kan generere et band. Inkluder en negativ kontroll for å sikre at ingen av reagenser er forurenset med uønsket DNA. Den negative kontrollen inneholder ingen mal og bør resultere i noe bandet produksjon.
- Forbered alle reaksjoner i tynnveggede PCR-rør for å gi bedre varmeoverføring mellom thermocycler blokk og prøven. Vi anbefaler bruk av kommersielt tilgjengelige aerosol-frie pipettespisser for å unngå forurensning.
- For hver isolert DNA-prøve, satt opp 50 mL PCR reaksjoner med hver av de ovennevnte primer sett i 0,2 ml tynnveggede PCR-rør ved å legge følgende reagensene på ICE i den rekkefølgen nedenfor. Hvis flere prøver er under utarbeidelse, ta en cocktail som inneholder alle reagenser med unntakav DNA malen for å etablere ensartede betingelser mellom alle reaksjoner.
PCR Reagens Volum Brukte Endelig Concetration Nukleasefritt DDH 2 O 40,5 mL 10X Advantage to PCR buffer (Clonetech, CA) 5,0 mL 10% (v / v) Advantage ultrarene PCR dNTP Mix (10 mM hver, Clonetech, CA) 1,0 mL 0,2 mm Primer 1 (12μM i DDH 2 O) 1,0 mL 0.24 mM Primer 2 (12μM i DDH 2 O) 1,0 mL 0.24 mM Fordel 2 Polymerase Mix (Clonetech, CA) 0,5 mL 1% (v / v) DNA-ekstraksjon(70 ng / reaksjon, justere DDH 2 O volum etter behov) 1,0 mL 1,4 ng / mL Totalt: 50,0 mL - For å sikre at alle PCR reagenser fungerer bra, sette den positive kontrollen ved hjelp av positiv kontroll primere. Dette primer settet fungerer like godt for cogongrass, JBG, JBG tilbake og andre gressarter, og vil resultere i et band som er 890 bp.
- Stille den negative kontrollen med den samme kontrollen primer angitt som positiv kontroll, ved hjelp DDH 2 O i stedet for DNA-ekstraksjon. Hvis alle reagenser er fri for DNA forurenser, vil denne reaksjonen resultere i ingen band.
- Hvis DNA konsentrasjonen er lav, kan mer DNA bli lagt til hver reaksjon, justere mengden nukleasefritt DDH 2 O brukes til å bringe det totale reaksjonen volumet til 50 mL. Ikke bruk mer enn 5 mL av DNA (10% av det totale volum) per reaction, kan som eventuelle urenheter som finnes i DNA-prøvene hemmer PCR reaksjoner.
6. PCR Sykling
- Utfør PCR presiseringer i en thermocycler utstyrt med et oppvarmet lokk ved hjelp av følgende PCR sykling parametere. Vi bruker Mastercycle pro S thermocycler (Eppendorf, Hauppauge, NY) satt til å operere med standard temperatur ramping forhold. Eventuelle kvalitet thermocycler burde fungere bra.
Cycle Denaturering annealing Polymerisasjon 1 2 min ved 95 ° C 2 30 sek på 95 ° C 30 sek på 61 ° C 90 sek på 68 ° C 35 sykluser 3 5 min ved 68 ° C Hold ved 4 ° C inntil prøven er fjernet - Optimalisere forholdene for PCR (inkludert primer annealing temperatur, forlengelse ganger, og antall sykluser) etter behov, avhengig av kvaliteten på DNA, primere, Taq polymerase eller type thermocycler brukt. Vi anbefaler å bruke en gradient i stand thermocycler ved fastsettelse av optimal annealing temperaturer.
- Dersom thermocycler som brukes ikke har et oppvarmet lokk, tilsett 1 dråpe av mineralolje til toppen av hver prøve for å hindre fordamping under PCR sykling.
7. Gel elektroforese av PCR produkter
For å visualisere resultatene av analysen, separate PCR produktene på en 1% agarose gel med standard elektroforese.
- Kombiner to mL av en standard DNA lasting buffer (vanligvis en 5x eller 6x løsning) med 5 mL av hver forsterket PCR produkt.
- Laste prøver på en 1% agarose gel inneholder EtBr (etidiumbromid for DNA farging) laget med either TAE eller SB (natrium borate) buffer-systemer 16. Vi bruker en mL av en 10 mg / ml EtBr stamløsning per 100 ml 1% agarose (0,1 mikrogram / ml).
- Kjør prøver på ~ 120V til fargestoff front når ¾ av den totale lengden på gel.
- Under UV-lys (f.eks en kortbølge UV lys boks), inspisere de resulterende bandene å se om en passende fragment ble forsterket.
- Dokumentere gel og resultat band med et tilgjengelig foto-dokumentasjon system eller kamera.
8. Representative Resultater
Ved visualisering av PCR produktene, har cogongrass en unik banding mønster sammenlignet med JBG eller tilbakevendt JBG (figur 5). For hver DNA-prøve, bør trnL-F positiv kontroll primer sett resultere i en enkelt høy intensitet band på ~~~HEAD=NNS 890 bp. Dette bekrefter at alle PCR reagenser fungerer bra. Likeledes bør den negative kontrollen (ingen mal) reaksjon inneholder ingen band for enhver primer set brukt. Dette bekrefter at ingen av reagensene var forurenset.
Dersom DNA-prøven er hentet fra villtype cogongrass, en PCR reaksjon med cogongrass-spesifikke primer sett vil resultere i ett band på ~ 595 bp, mens JBG-spesifikke primere vil resultere i noe band. Likeledes, hvis DNA-prøven er hentet fra JBG eller hjemfalt JBG, vil en PCR reaksjon med JBG-spesifikke primer sett resultere i ett band på ~ 594 bp, mens cogongrass-spesifikke primere vil resultere i noe band. Fordi JBG og tilbakevendt JBG har identiske nukleinsyre sekvens, vil de derfor ha identiske banding mønstre. Hvis mange prøvene skal sammenlignes på en gel samtidig, anbefaler vi kjører alle prøvene stammer fra hver primer satt ved siden av hverandre, og dermed gjør det enklere å skanne prøver for positive resultater.
Morfologiske forskjeller mellom JBG og JBG går tilbake er ganske opplagt (f.eks rød fargen på bladene og mindre vekst av JB G vs grønn farge, større vekst og aggressiv vekst av JBG tilbake), så mens PCR-resultater vil være den samme, JBG varianter er lett å skille ved hjelp plante morfologi.
Figur 1. Sammenligning av klimagasser vokst Imperata cylindrica var. Koenigii (japansk blod gress), Tilbakestilte I. cylindrica var. koenigii (JBG Revert) og I. cylindrica (villtype cogongrass).
Figur 2. Et eksempel på DNA-prøvene bekreftet ved hjelp av en NanoDrop spektrofotometer. Merk at, uavhengig av spektrofotometer benyttes, skal 260/280 forholdet være nær 1,8 og 260/230 ratio bør lukke til 2,0.
Figur 3. DNA-prøver bekreftet ved hjelp av standard gelelektroforese på en 1% agarose gel. En kommersiell DNA markør ble brukt til størrelse analyse. Lane # 4 er et eksempel på dårlig kvalitet DNA-prøve, som viser smøre og noen RNA forurensning.
Figur 4. Sequence alignments av trnL-F regioner i Imperata cylindrica var. Koenigii (japansk blod gress), Tilbakestilte I. cylindrica var. koenigii (JBG Revert) og I. cylindrica (villtype cogongrass). Vertikale svarte pilene indikerer forskjeller i sekvenser som følge av SNPs og InDels. Horisontale grønne piler indikerer plasseringen av villtype cogongrass primere som brukes for cogongrass-spesifikk PCR. Horisontale røde piler indikerer pooppkjøp av JBG og JBG Revert primere som brukes for JBG-spesifikk PCR.
Figur 5. Representant resultat av gel elektroforese av PCR produktene stammer fra cogongrass, JBG og JBG tilbake DNA-prøver kombinert med cogongrass-og JBG-spesifikke primere samt trnL-F positiv kontroll og en nei mal negativ kontroll.
Discussion
Den amerikanske barnehage og landskap bransjer trives på dyrking og salg eksotiske og romanen plantearter. Dette, kombinert med den økende globaliseringen av handel, øker sjansene for at en invaderende plantearter vil inn, etablere og spre i USA Evnen til føderalt regulere slike planter er avhengig av informasjon som er ofte ikke tilgjengelig, herunder potensialet til å bli invaderende , riktig taksonomi og genetisk distinctness fra innfødte og naturalisert taxa. Fordi vår kunnskap om invasive planter er ofte begrenset, har importerte planter med skjulte invasive egenskaper blitt frivillig innført bare for å lære senere at de invaderer våre landbruks-og naturressurser. Denne protokollen tar sikte på å løse slike problemer forbundet med I. cylindrica sorter ved å gi den første forenklede molekylære metode som kan nøyaktig skille mellom vill-type cogongrass og hjemfalt form av dekorativt JBG motstykke.
jove_content "> For utviklingen av denne protokollen, ble vill-type cogongrass hentet fra naturalisert populasjonen ved dammen Creek Forestry Unit i Santa Rosa County i nærheten Jay, FL i juni 2008. JBG ble anskaffet fra en kommersiell barnehage (Bluebird Nursery, Inc .) i juni 2008 samt fra et hus samling i Columbia, går MO JBG ble hentet fra gårdsplassen til Campbell Geologisk museum ved Clemson University, SC i juni 2008;. fra University Park i Riverdale, MA i juni 2009, og fra front yard av et hus i Columbia, MO i 2009 (identifisert av Leland Cseke). Alle plantene ble opprettholdt i et drivhus som ligger ved University of Alabama i Huntsville (Huntsville, Alabama).Genetisk sekvensering av DNA hentet fra disse plantene inkluderte i dybden sammenligninger av 9 uavhengige DNA regioner som vanligvis brukes til å strekkode planter 2. I alle tilfeller var sekvenser av JBG en 100% match til de av JBG tilbake, og dermed bidra tilverifisere at JBG ikke tilbake faktisk til en grønn, invasiv form. Bare kjernefysisk ITS og kloroplast trnL-F regionene har forskjeller som kan brukes til genetisk skille mellom cogongrass og JBG. ITS regionen har totalt 3 SNPs (single nukleotid polymorfismer) mellom cogongrass og JBG, mens trnL-F-regionen har to SNPs og 2 InDels (innsettinger og slettinger). Disse genetiske forskjellene tillatt rekke spesifikke PCR primere skal utvikles som kan skille mellom vill-type cogongrass og JBG går tilbake. De mest pålitelige resultater har kommet fra primere derivert fra den plastid trnL-F-regionen. Dermed er denne protokoll basert på sekvensen forskjeller mellom trnL-F områder av kloroplast genomet til cogongrass, JBG og hjemfalt JBG (figur 4).
For å hjelpe generere primere som er mer spesifikke for de varianter i spørsmålet og for å unngå falske positiver fra nært beslektede arter, all kjente trnL-F sekvenser av I. cylindrica varianter ble sammenlignet med trnL-F sekvenser fra beslektede grasarter (43 selvstendige sekvenser fra 29 arter, f.eks Cymbopogon citratus og Sorghastrum incompletum og Coix lacryma-Jobi og Miscanthus sinensis, Saccharum officinarum, durra halepense). Selv undersøkte vi forskjellige-spesifikke primer sekvenser over 29 arter av gress, spesifisiteten av sorten-spesifikke primere har ikke blitt grundig undersøkt for sin evne til å forsterke DNA fra de fleste andre grasarter. Derfor bør vev brukes til DNA-ekstraksjon nøye identifisert som I. cylindrica før du starter denne protokollen. Hvis gresset ikke kan bli identifisert som enten cogongrass eller JBG, så vi foreslår sekvensering av PCR produktet å sørge for at sekvenser er en eksakt match til cogongrass eller JBG. Foreløpig er den mest nøyaktige metoden for å bekrefte identiteten til en gitt gress eksemplar til å utføre PCR på både trnL-F og regioner, etterfulgt av sekvens verifisering av PCR produktene og sammenligning av sekvensene til kjente sekvenser fra nøyaktig identifisert taxa. DNA kan forsterkes ved hjelp av kontroll primere beskrevet i denne protokollen (for trnL-F region) eller andre primere som er tilgjengelige i andre publikasjoner 13-15. Sekvensering er mye mer arbeid og kostnader intensiv enn å bruke vårt forenklet prosedyre.
Kvaliteten på primere som brukes for PCR er avgjørende for å lykkes med forsøket. Vi har gjort de primere for denne prosedyren tilgjengelig fra Oblique Bio, Inc. ( http://www.obliquebio.com/web/ , Huntsville, AL). Fordelen til bestilling av primere fra Oblique Bio er at de lagrer store mengder alikvoter av hver primer fra identiske prøven produksjonsserier som primere vi brukte for optimalisering i vårt laboratorium. Følgelig primere ikke bare ha den samme sekvensen, men thei kommer fra nøyaktig samme produksjonen mye som ble brukt i denne protokollen. Bruke primere fra samme tomt, kan bidra til å unngå utenforliggende variabler i prosedyren som kan resultere fra forskjeller i kvaliteten på PCR primere. Likeledes vil mens andre Taq polymerase bør fungere fint for PCR, kvaliteten på Taq polymerase som brukes har en innvirkning på kvaliteten på PCR-resultater. For å muliggjøre bedre konsistens i PCR reagenser, har vi optimalisert protokollen ved hjelp av reagenser fra Clontech. Fordelen 2 Polymerase (Clontech, Mountain View, CA, Cat # 639201 eller 639202) er en blanding av en robust, hot-start Taq polymerase og en korrekturlesing enzym som bidrar til å gi høy spesifisitet og mer nøyaktige presiseringer.
Fordi denne protokollen er avhengig av kloroplast DNA, som er moderlig arvet i gress, kan hybridisering hendelser mellom cogongrass og JBG genotyper ikke fanges med vår molekylær identifikasjon prosedyre. I tilfeller der hypridization er suspected, anbefaler vi å bruke kjernefysiske regioner som er arvet fra begge foreldre. Den mest brukte ikke-plastid variabel region å vurdere i plante genotyping er den kjernefysiske ribosomalt ITS-regionen 13-15,17. Vi er for tiden gjør fremskritt mot multipleksing forsterkningen av kloroplast trnL-F region med at kjernefamiliens ITS-regionen i samme PCR rør. Multipleksing plastid med kjernefysiske DNA regioner ville potensielt omgå begrensningene ved bruk av enten alene, men slike metoder krever optimalisering og ytterligere evaluering for å avgjøre gjennomførbarheten fra sak til sak. Bruk av kvantitative real-time PCR (qPCR) og nyere teknologier, slik som molekylære fyrtårn (fluorescerende primer sonder), vurderes også som fail-safe og nøyaktig plante genotyping metoder.
Protokollen presenteres her gir en rask og pålitelig måte å skille JBG tilbake fra den i vill-type cogongrass. Vi oppfordrer brukerrs av denne protokollen til å kontakte oss for å rapportere resultatene fra bruken av denne protokollen. Slike delte informasjon vil bidra til å gi informasjon om fordelingen av JBG går tilbake. Dette vil også bidra regulatorer ved USDA å ta informerte beslutninger om tiltak som kan være behov for å omgå spredning og potensialet hybridisering av de svært invasive cogongrass varianter.
Disclosures
Vi har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Alan Tasker (USDA-APHIS, Riverdale, MD), Stephen Compton (Clemson), Sherry Aultman (Clemson), Craig Ramsey (USDA-APHIS, Fort Collins, CO), og Betty Marose (UMD) for bistand til innhenting av prøver . Vi takker studentene Andrew Adrian (UA-Huntsville) og Derek Thacker (UA-Huntsville) for deres assistanse i å teste denne protokollen, og Joseph Herdy for sitt arbeid i filmingen av videoen. Dette arbeidet ble finansiert av National Fish and Wildlife Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 or 69106 | Any reputable genomic plant DNA kit that yields good quality DNA should work fine for these procedures. |
| trnF(GAA)-F | Oblique Bio, Inc. | 3-0578 | Forward positive control primer |
| trnL(5’ exon)-C | Oblique Bio, Inc. | 3-0579 | Reverse positive control primer |
| trnLF-C-F1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0864 | Forward wild-type cogongrass primer |
| trnLF-C-R1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0865 | Reverse wild-type cogongrass primer |
| trnLF-R-F2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0866 | Forward JBG and JBG revert primer |
| trnLF-R-R2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0867 | Reverse JBG and JBG revert primer |
| Advantage UltraPure PCR dNTP Mix | Clontech Laboratories | 639125 | |
| Advantage 2 Polymerase | Clontech Laboratories | 639201 or 639202 | A good proof-reading, hot-start Taq polymerase |
References
- Holm, L. G., Pancho, J. V., Herberger, J. P., Plucknett, D. L. A Geographical Atlas of World Weeds. , Krieger Publishing Company. Malabar, Florida, U.S. (1979).
- CABI, Crop Protection Compendium. Commonwealth Agricultural Bureau International (CABI). , Wallingford, UK. (2007).
- MacDonald, G. E. Cogongrass (Imperata cylindrica) - Biology, ecology, and management. Critical Reviews in Plant Sciences. 23, 367-380 (2004).
- Talley, S. M., Cseke, L. J. Molecular diagnostic technologies for invasive plants. CPHST Fort Collins Laboratory 2009 Annual Report. Zink, R. , USDA-APHIS-PPQ-CPHST. Fort Collins, Colorado. 27-28 (2009).
- Dozier, H., Gaffney, J. F., McDonald, S. -K., Johnson, E. R. R. L., Shilling, D. G. Cogongrass in the United States: History, ecology, impacts, and management. Weed Technology. 12, 737-743 (1998).
- Chikoye, D., Ekeleme, F. Weed flora and soil seedbanks in fields dominated by Imperata cylindrica in the moist savannah of West Africa. Weed Research. 41, 475-490 (2001).
- Weber, E. Invasive Plant Species of the World: A Reference Guide to Environmental Weeds. , CABI Publishing. Wallingford, UK. (2003).
- Patterson, D. T. Shading effects on growth and partitioning of plant biomass in Cogongrass (Imperata cylindrica) from shaded and exposed habitats. Weed Science. 28, 735-740 (1980).
- Cole, J. T., Cole, J. C. Ornamental grass growth response to three shade intensities. Journal of Environmental Horticulture. 18, 18-22 (2000).
- Bryson, C. T., Koger, C. H., Byrd, J. D. Effects of temperature and exposure period to heat on cogongrass (Imperata cylindrica) viability. Weed Technology. 21, 141-144 (2007).
- Capo-chichi, L. J. A., Faircloth, W. H., Williamson, A. G., Patterson, M. G., Miller, J. H., van Santen, E. Invasion Dynamics and Genotypic Diversity of Cogongrass (Imperata cylindrica) at the Point of Introduction in the Southeastern United States. Invasive Plant Science and Management. 1 (2), 133-141 (2008).
- Talley, S. M., Ramsey, C. L. Experimentally assessing the invasive potential of plants. CPHST Laboratory 2009 Annual Report. Zink, R. , USDA-APHIS-PPQ-CPHST. Fort Collins, Colorado. 29-30 (2009).
- Hodkinson, T. R., Chase, M. W., Lledó, M. D., Salamin, N., Renvoize, S. A. Phylogenetics of Miscanthus, Saccharum and related genera (Saccharinae, Andropogoneae, Poaceae) based on DNA sequences from ITS nuclear ribosomal DNA and plastid trnLintron and trnL-F intergenic spacers. J. Plant Res. 115, 381-392 (2002).
- Kress, W. J., Wurdack, K. J., Zimmer, E. A., Weigt, L. A., Janzen, D. H. Use of DNA barcodes to identify flowering plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (23), 8369-8374 (2005).
- Roodt-Wilding, R., Spies, J. J. Phylogenetic relationships in southern African chloridoid grasses (Poaceae) based on nuclear and chloroplast sequence data. Systematics and Biodiversity. 4, 401-415 (2006).
- Brody, J. R., Kern, S. E. Sodium boric acid: a Tris-free, cooler conductive medium for DNA electrophoresis. BioTechniques. 36, 214-216 (2004).
- Chou, C. -H., Tsai, C. C. Genetic variation in the intergenic spacer of ribosomal DNA of Imperata cylindrica (L.) Beauv. var. major (Cogongrass) populations in Taiwan. Botanical Bulletin of Academia Sinica (Taipei). 40, 319-332 (1999).
