Summary
Vi en omkostningseffektiv og hurtig molekylær genotypebestemmelse protokol, der anvender forskellige specifikke PCR-primere, som er rettet DNA-sekvensforskelle i chloroplasten trnL-F spacerregionen at skelne mellem varianter af
Abstract
Vildtype I. cylindrica (cogongrass) er en af de top ti værste invasive planter i verden, negativ indvirkning landbrugs-og naturressourcer i 73 forskellige lande i hele Afrika, Asien, Europa, New Zealand, Oceanien og Amerika 1-2. Cogongrass danner hastigt breder sig, monodominant står der fortrænger en lang række af indfødte plantearter og igen true de indfødte dyr, der afhænger af de fordrevne indfødte plantearter for foder og husly. Hvis du vil føje til det problem, en ornamental sort [I. cylindrica var. koenigii (Retzius)] er almindeligt markedsføres under navnene Imperata cylindrica 'Rubra', Red Baron, og japansk blod græs (JBG). Denne sort er angiveligt steril og noninvasive og betragtes som en ønskelig ornamental for sine rød-farvede blade. Men under de korrekte forhold, kan JBG producere levedygtige frø (Carol Holko, 2009 personlig kommunikation) og kan vende tilbage til en grøn invasive form, ofte ikke kan skelnes fra cogongrass som det tager for de karakteristiske egenskaber vildtype-invasiv række 4 (figur 1). Dette gør identifikation ved hjælp af morfologi en vanskelig opgave, selv for veluddannede plante taksonomer. Tilbagevenden af JBG til en aggressiv grøn fænotype er heller ikke en sjælden begivenhed. Brug sekvens sammenligninger af kodning og variable regioner i både nukleare og kloroplast DNA, har vi bekræftet, at JBG har vendt tilbage til den grønne invasive i staterne Maryland, South Carolina og Missouri. JBG er blevet solgt og plantet i næsten hver eneste stat i det kontinentale USA, hvor der ikke er en aktiv cogongrass angreb. Omfanget af den tilbage problem ikke godt forstået, fordi reverterede planter er udokumenterede og ofte ødelagt.
Anvendelsen af denne molekylære protokol giver en metode til at identificere JBG tilbage og kan hjælpe med at holde disse sorter fra co-forekommende ennd muligvis hybridiserende. Cogongrass er en obligat outcrosser, og når krydset med en anden genotype, kan producere levedygtige vinden spredte frø, der spreder sig cogongrass over store afstande 5-7. JBG har en lidt forskellig genotype end cogongrass og kan være i stand til at danne levedygtige hybrider med cogongrass. Hvis du vil føje til problemet, JBG er mere kold og skygge tolerant end cogongrass 8-10, og gen flow mellem disse to sorter er tilbøjelige til at generere hybrider, som er mere aggressive, skygge tolerant, og koldt hårdfør end vildtype-cogongrass. Mens vildtype cogongrass øjeblikket inficerer mere end 490 millioner hektar i hele verden, i det sydøstlige USA er det inficerer over 500.000 hektar og er i stand til at besætte det meste af USA, da det hurtigt breder sig nordpå på grund af sin brede niche og geografiske potentiale 3,7,11. Potentialet for en genetisk krydsning er et alvorligt problem for USDA-APHIS Federal skadelige ugeprogram. I øjeblikket, USDA-APHIS forbyder JBG i stater whførend der er store cogongrass angreb (f.eks, Florida, Alabama, Mississippi). Men, kan forhindre de to sorter fra kombinere vise vanskeligere cogongrass og JBG udvide deres distributioner. Endvidere er fordelingen af JBG tilbage i øjeblikket ukendt, og uden evnen til at identificere disse sorter ved morfologi, kan nogle cogongrass parasitære være resultatet af JBG vender. Uheldigvis aktuelle molekylære fremgangsmåder til identifikation typisk afhængige AFLP (Amplificerede polymorfier) og DNA-sekventering, som begge er tidskrævende og dyrt. Her præsenterer vi den første cost-effektiv og pålidelig PCR-baseret molekylær genotypebestemmelse metode til præcist at skelne mellem cogongrass og JBG tilbage.
Protocol
1. Prøvetagning og Preservation
Denne metode blev udviklet og testet ved hjælp af friske, frosne, og for nylig tørrede blade væv.
- Identificer cogongrass og / eller JBG væv ved hjælp af en ichtyolog der specialiserer sig i græsset artsidentifikation. Med dets røde blade er dekorative JBG let visuelt skelnes fra vild-type cogongrass og JBG tilbage, men cogongrass og JBG vende næsten ikke kan skelnes fra hinanden. Cogongrass og JBG reverterede fænotype har grønne, længere blade betydeligt større og længere jordstængler, og mere bladareal end JBG 12 (fig. 1).
- Frisk blad væv giver den mest udbredte og højeste kvalitet DNA og kan indsamles fra mark eller væksthus vokset I. cylindrica planter. Hvis frisk væv skal anvendes, ekstrahere DNA inden for 3 timer efter samling til at forhindre nedbrydning. Ellers forberede væv til opbevaring, keeping vævet kølige og direkte sollys.
- At lagre væv til DNA-ekstraktion på et senere tidspunkt, den mest optimale metode er at fryse og opbevares vævet ved -80 ° C umiddelbart. Lad ikke det frosne væv til at tø før DNA-ekstraktion. Overfør det frosne væv med flydende nitrogen forud for formaling trin DNA-ekstraktion for at forhindre optøning.
- Hvis en -80 ° C fryser ikke er tilgængelig, tør vævet umiddelbart. Til opbevaring ved at anbringe vævet i en papir kuvert og opbevares konvolutten i dehydratiseret silicagel eller andre aktive tørremidler ved stuetemperatur. En lille mængde af indikator silica blandet med ikke-indikerende silica vil sikre, at silica er fuldt tørret og egnet til tørring plantevæv.
- Anvender mindst 10 gange mere silicagel end frisk bladvæv efter vægt. Plantevæv skal tørre i løbet af 24 timer. Kvaliteten og mængden af DNA reduceres ved tør opbevaring over tid (som i tilfælde af herbarium prøves).
2. DNA-ekstraktion
For at udvinde DNA fra plantevæv, følg DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, Californien, Cat # 69104 eller 69.106) producentens anvisninger med en mindre modifikation. Stedet for at anvende den foreslåede mindre end 100 mg friskt væv eller mindre end 20 mg tørt væv for hver søjle, slibe større end 100 mg, og derefter overføre 100 mg fra frisk eller frosset væv (eller> 20 mg af tør væv) til passende rør til ekstraktion. Nukleare og plastid-DNA ekstraheres samtidigt.
- Før du starter disse procedurer, at ethanol verificere blev tilføjet til buffere AP3 / E og AW.
- Male> 100 mg frisk eller frosset bladvæv (eller> 20 mg tørt bladvæv) til et fint pulver under anvendelse af tre runder af flydende nitrogen med formaling i en afkølet morter og pistil. Utilstrækkelig afbrydelse af udgangsmaterialet eller utilstrækkelig lysis kan også føre til lavere udbytter af DNA. Omhyggeligt formale Tissue og ikke overbelaste de kolonner, med for meget væv.
- Overfør 100 mg frosne pulver fra frisk eller frosset væv (eller 20 mg af pulver fra tør væv) med en 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 400 ul buffer AP1 og 4 gl RNase A. Hvert rør kan anbringes i en lille tandstang på en balance at overvåge den korrekte vægt af væv pr rør.
- Vortex eller ryste prøve (r) blandes og inkuberes i 10 minutter ved 65 ° C, vende røret (rørene) 2-3 gange i løbet af inkubationen.
- Tilsættes 130 ul buffer AP2 til hver prøve. Blandes ved at vende røret (rørene) flere gange, og der inkuberes i 5 minutter på is.
- Pipette hvert lysat i et separat QIAshredder Mini spinkolonne og placeres hver søjle i en 2 ml opsamlingsrør (tilvejebragt med kittet). Centrifuge kolonne (r) i 2 minutter ved 20.000 xg (~ 14.000 rpm), og overfører hver gennemstrømning fraktion til et nyt rør (ikke leveres med kittet) uden at forstyrre nogen dannet pellet.
- Tilsættes 1,5 volumener Buffer AP3 /E, og blandes ved pipettering.
- Overfør 650 ul af blandingen i en DNeasy Mini spinkolonne i en 2 ml opsamlingsrør. Centrifuge kolonne (r) i 1 minut ved 6000 xg (~ 8000 rpm) og kasseres gennemstrømning. Gentage dette trin med den resterende blanding for hver prøve.
- Anbring spinkolonne (r) i et nyt 2 ml opsamlingsrør (s), og der tilsættes 500 ul buffer AW til toppen af hver søjle. Centrifuge kolonne (r) i 1 minut ved 6000 xg (~ 8000 rpm) og kasseres gennemstrømning.
- Tilsættes yderligere 500 ul buffer AW til toppen af hver søjle. Centrifuger i 2 minutter ved 20.000 x g (~ 14.000 rpm). Dette trin vil tørre søjlen, således at fjerne eventuel resterende ethanol indeholdt i buffere, der kan inhibere PCR.
- Overfør hver spinkolonne en ny 1,5 ml mikrocentrifugerør prøveglas. Tilsæt 100 pi buffer AE til toppen af hver søjle til eluering, og inkuberes kolonne (r) i 5 minutter ved stuetemperatur. Centrifuge kolonne (r) i 1 minut ved 6000 xg (ca. 8000 omdrejninger i minuttet) til opsamling af DNA'et.
- Gentage disse elueringstrin én gang under eluering af DNA'et i den samme 1,5 ml mikrocentrifugerør, hvilket gav 200 ul prøve. Detaljerede DNA-prøver ved -20 ° C indtil anvendelse. DNA-koncentrationer afhænger vævstype-og opbevaringsbetingelser. Optimale udbytter opnås ved eluering DNA med en total på 200 pi puffer AE, men kan koncentrationen øges, hvis elueringsvolumener reduceres til så lidt som 50 ul.
3. Verifikation af DNA-kvalitet og kvantitet
- Test kvaliteten og mængden af ekstraheret DNA forud for PCR opsætning med et spektrofotometer eller fluorometer og gelelektroforese. Dette vil medvirke til at sikre succes efterfølgende trin.
- Ved hjælp af et spektrofotometer, test-DNA-kvalitet og kvantitet. Gode DNA udbytte skal være mellem 50 og 150 ng / gl med 260/280 og 230/280 forhold tæt på 2,0. Som et eksempel viser figur 2 gode kvalitet resultater ved anvendelse af NanoDrop spektrofotometer (ThermoScientific, Wilmington, DE).
- Udføre elektroforese under anvendelse af en standard 1% agarosegel. Kontroller tilstedeværelsen af relativt store bånd (> 10 Kb) uden at få striber fra RNA forurening (Figur 3).
- Hvis DNA-koncentrationen er høj, fortyndede DNA-prøver til 70 ng / ul til efterfølgende trin.
4. PCR primere
PCR primere, der anvendes i denne protokol, er baseret på sekvens forskelle mellem plastidrettet trnL-F spacer regionen cogongrass og JBG genotyper. Disse forskelle kommer i form af SNP'er (enkeltnucleotid-polymorfier) og InDels (Insertioner og deletioner), der tillod udviklingen af sorten-specifikke primere ved at placere primerne på stederne af unikke sekvenser (figur 4).
- Kvaliteten af primerne kan have en væsentlig indvirkning på PCR-resultater. Bestil primere fra et velrenommeret selskab. Vi bestiller vores primere fra Oblique Bio, Inc. (:/ / Www.obliquebio.com/web/ "target =" _blank "> http://www.obliquebio.com/web/, Huntsville, AL), anmoder om kun standard afsaltning procedurer.
- trnL-F positive kontrol primere: Dette primersæt forstærker plastidet trnL-F spacerregionen mest græs taxa 11-13 og tjener som en god positiv kontrol (resulterende i en 890 bp-bånd).
Navn Sequence trnF (GAA)-F 5'-ATTTGAACTGGTGACACGAG-3 ' trnL (5 'exon)-C 5'-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3 ' - Vildtype cogongrass primere: Denne primer sæt er specifik for cogongrass og ikke amplificere trnL-F region JBG genotyper. De indstillede resulterer i et band, der er 595 bp.
Navn Sequence trnLF-C-F1 5'-TCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGCAA-3 ' trnLF-C-R1 5'-GCCGATACTCTAATAAATAAAAAAAAAAAAGAAAT-3 ' - JBG og JBG Revert primere: Dette primersæt er specifik for JBG genotype og ikke amplificere trnL-F region cogongrass. De indstillede resulterer i et band, der er 594 bp.
Navn Sequence trnLF-R-F2 5'-CCAAATCCACTTTTTTGAAAAAACAAGTGGTT-3 ' trnLF-R-R2 5'-CGAGATTCCTTGCCGATACTCTAATAAAA-3 ' - Resuspender hver primer i tilstrækkelig mængde nuklease uden ddH2O til opnåelse af et 100 mM stamopløsninger, der kan opbevares ved -20 ° C, lang sigt.
- Fortyndes hver primer bestand til 12 mM forud for PCR opsætningstrin.
5. PCR opsætning
DNA ekstraktioner amplificeres under anvendelse af hver af de ovennævnte primersæt i PCR-reaktioner. Medtag en positiv kontrol for at sikre, at alle PCR-reagenser fungerer godt, og kan generere et band. Omfatter en negativ kontrol for at sikre, at ingen af reagenserne er forurenet med uønskede DNA. Den negative kontrol indeholder ingen skabelon og bør resultere i nogen bånd produktion.
- Forbered alle reaktioner i tyndvæggede PCR-rør for at muliggøre en bedre varmeoverførsel mellem thermocycleren blokken og prøven. Vi anbefaler brug af kommercielt tilgængelige aerosol-fri pipettespidser for at undgå forurening.
- For hver isoleret DNA-prøve, nedsat 50 pi PCR-reaktioner med hver af de ovennævnte primersæt i 0,2 ml-tyndvæggede PCR-rør ved tilsætning af følgende reagenser på is i den nedenfor angivne rækkefølge. Hvis flere prøver er under udarbejdelse, lave en cocktail, der indeholder alle reagenser med undtagelseaf DNA-templaten til at etablere en ensartet forhold mellem alle reaktioner.
PCR Reagent Anvendte mængde Endelig Concetration Nuklease uden ddH2O 40,5 gl 10X Advantage 2 PCR-buffer (Clonetech, CA) 5,0 gl 10% (v / v) Fordelen UltraPure PCR dNTP-blanding (10 mM hver, Clonetech, CA) 1,0 gl 0,2 mM Primer 1 (12μM i ddH2O) 1,0 gl 0,24 pM Primer 2 (12μM i ddH2O) 1,0 gl 0,24 pM Fordelen 2 Polymerase Mix (Clonetech, CA) 0,5 gl 1% (v / v) DNA-ekstraktion(70 ng / reaktion, justere ddH2O volumen efter behov) 1,0 gl 1,4 ng / ul Total: 50,0 gl - For at sikre, at alle PCR-reagenser fungerer godt, indstille den positive kontrol ved hjælp af de positive kontrol primere. Denne primer sæt virker lige godt for cogongrass, JBG, JBG vende tilbage og andre græsser, og vil resultere i et band, der er 890 bp.
- Opsætte den negative kontrol ved hjælp af samme kontrol primersæt som positiv kontrol ved hjælp ddH2O stedet for DNA-ekstraktion. Hvis alle reagenser er fri for DNA forurening, vil denne reaktion resulterer i ingen bånd.
- Hvis DNA-koncentrationen er lav, kan mere DNA tilsættes til hver reaktion, justere mængden af nuklease-fri ddH2O anvendes til at bringe det samlede reaktionsvolumen på 50 ul. Ikke anvende mere end 5 ul DNA (10% af det totale volumen) pr reaction kan som eventuelle urenheder indeholdt i DNA-prøver inhibere PCR-reaktioner.
6. PCR-cykling
- Udføre PCR-amplifikationer i en thermocycler udstyret med et opvarmet låg anvendelse af de følgende PCR-cykling parametre. Vi bruger Mastercycle Pro S thermocycler (Eppendorf, Hauppauge, NY) indstillet til at fungere med normal temperatur optrapning forhold. Enhver kvalitet termocyklusapparat skal udføre godt.
Cycle Denaturering Annealing Polymerisation 1 2 minutter ved 95 ° C 2 30 sekunder ved 95 ° C 30 sekunder ved 61 ° C 90 sek ved 68 ° C 35 cykler 3 5 minutter ved 68 ° C Henstand ved 4 ° C, indtil prøven er fjernet - Optimere betingelserne for PCR (herunder primerannealing temperatur, forlængelsestider, og antallet af cyklusser), som er nødvendig, afhængigt af kvaliteten af DNA, primere, Taq-polymerase eller type thermocycler anvendes. Vi anbefaler anvendelse af en gradient i stand thermocycler ved bestemmelse af den optimale udglødningstemperaturer.
- Hvis thermocycler anvendes ikke har en opvarmet låg, tilsættes en dråbe mineralolie til toppen af hver prøve for at forhindre fordampning under PCR cykler.
7. Gelelektroforese af PCR produkter
At visualisere resultaterne af analysen, separate PCR produkterne på en 1% agarosegel under anvendelse af standard-elektroforese.
- Kombiner 2 pi af en standard DNA-påsætningsbuffer (typisk en 5x eller 6x opløsning) med 5 pi af hver amplificerede PCR-produkt.
- Indlæse prøver på en 1% agarosegel indeholdende EtBr (ethidiumbromid for DNA-farvning) fremstillet med either Tae eller SB (natriumborat) puffersystemer 16. Vi anvender 1 ml af en 10 mg / ml EtBr stamopløsning 100 ml 1% agarose (0,1 ug / ml).
- Kør prøver ved ~ 120V indtil farvefronten når ¾ af den samlede længde af gelen.
- Under UV-lys (fx en kortbølget UV-lyskasse), inspicere de resulterende bånd for at se om en passende fragment blev amplificeret.
- Dokumentere gelen og resulterende bånd via et tilgængeligt foto-dokumentation system eller kamera.
8. Repræsentative resultater
Ved visualisering af PCR-produkter, har cogongrass et unikt båndmønster sammenlignet med JBG eller vendt JBG (figur 5). For hver DNA-prøve, bør trnL-F positiv kontrol primersæt resultere i en enkelt høj intensitet bånd ved ~ 890 bp. Dette bekræfter, at alle PCR-reagenser fungerer godt. Tilsvarende bør den negative kontrol (ingen skabelon) reaktion indeholder ingen bånd til en primer set anvendt. Dette bekræfter, at ingen af reagenserne blev kontamineret.
Hvis DNA-prøve er afledt fra vildtype-cogongrass en PCR reaktion under anvendelse af cogongrass-specifikke primer sæt vil resultere i et enkelt bånd på ~ 595 bp, mens JBG-specifikke primere vil resultere i ingen bånd. Ligeledes, hvis DNA-prøve er afledt fra JBG eller vendt JBG, vil en PCR reaktion under anvendelse af JBG-specifikke primer sæt resulterer i et enkelt bånd på ~ 594 bp, mens cogongrass-specifikke primere vil resultere i ingen bånd. Fordi JBG og vendte tilbage JBG har identisk nukleinsyresekvens, vil de således være identiske båndmønstre. Hvis mange prøver skal sammenlignes på en gel på samme tid, anbefales at køre alle prøverne er afledt fra hver primer beliggende ved siden af hinanden, hvilket gør det lettere at scanne prøverne til positive resultater.
Morfologiske forskelle mellem JBG og JBG vender tilbage er temmelig indlysende (fx rød farve af blade og mindre statur af JB G vs grøn farve, større vækst og aggressive vækst JBG tilbage), så mens PCR resultater vil være det samme, JBG sorter er lette at skelne ved hjælp af anlægget morfologi.
Figur 1. Sammenligning af drivhusgasser vokset Imperata cylindrica var. Koenigii (japansk blod græs), Reverted I. cylindrica var. koenigii (JBG Revert) og I. cylindrica (vildtype cogongrass).
Figur 2. Et eksempel på DNA-prøver verificerede bruger en NanoDrop spektrofotometer. Bemærk, at uanset den anvendte spektrofotometer bør 260/280 forholdet være tæt på 1,8, og 260/230 ratio tæt på 2,0.
Figur 3. DNA prøver kontrolleres ved hjælp af standard gel elektroforese på en 1% agarosegel. En kommerciel DNA-markør blev anvendt til størrelsesanalyse. Bane # 4 er et eksempel på dårlig kvalitet DNA-prøve, der viser udtværing og nogle RNA kontaminering.
Figur 4. Sekvensparallelopstillinger af trnL-F regioner Imperata cylindrica var. Koenigii (japansk blod græs) Reverted I. cylindrica var. koenigii (JBG Revert) og I. cylindrica (vildtype cogongrass). Lodrette sorte pile angiver forskelle i sekvenserne skyldes SNP'er og InDels. Vandrette grønne pile angiver positionerne af vildtype-cogongrass primere anvendt til cogongrass-specifik PCR. Horisontale røde pile markerer den potioner af JBG og JBG Revert primere anvendt til JBG-specifik PCR.
Figur 5. Repræsentativt resultat af gel elektroforese af PCR-produkter afledt af cogongrass, JBG og JBG vende DNA-prøver kombineret med cogongrass-og JBG-specifikke primere samt trnL-F positiv kontrol og en uden template negativ kontrol.
Discussion
Den amerikanske børnehave og landskab industrier trives med at dyrke og sælge eksotiske og nye plantearter. Dette, kombineret med den stigende globalisering af handelen, øger chancerne for, at en invasive plantearter vil komme ind, etablere, og spredes i USA Evnen til at føderalt regulere sådanne anlæg bygger på oplysninger, der er ofte ikke tilgængelige, herunder potentialet til at blive invasive , korrekt taksonomi og genetiske selvstændighed fra indfødte og naturaliserede taxa. Fordi vores viden om invasive planter er ofte begrænset, er importerede planter med skjulte invasive egenskaber er villigt kun indføres for at lære senere, at de invaderer vores landbrugs-og naturressourcer. Denne protokol har til formål at løse sådanne problemer i forbindelse med I. cylindrica sorter tilvejebringe den første forenklede molekylære fremgangsmåde, der nøjagtigt kan skelne mellem vild-type cogongrass og vendte tilbage form af dens dekorative JBG modstykke.
jove_content "> For udviklingen af denne protokol, blev vildtype cogongrass indsamlet fra naturaliserede populationer på Pond Creek skovbrug enhed i Santa Rosa County nær Jay, FL i juni 2008. JBG blev indkøbt fra en kommerciel planteskole (Bluebird Nursery, Inc .) i juni 2008 samt fra en boligejer samling i Columbia, vender MO JBG blev opnået fra gården af Campbell Geologisk Museum på Clemson University, SC i juni 2008;. fra University Park i Riverdale, MA i juni 2009, og fra forhaven en boligejer i Columbia, MO i 2009 (identificeret ved Leland Cseke). Alle anlæg blev opretholdt i et drivhus er placeret på University of Alabama i Huntsville (Huntsville, AL).Genetisk sekventering af DNA indsamlet fra disse planter omfattede grundige sammenligninger af 9 uafhængige DNA-regioner der almindeligvis anvendes til stregkode planter 2. I alle tilfælde var de sekvenser af JBG en 100% match til de af JBG tilbage, hvilket bidrager tilkontrollere, at JBG rent faktisk vende tilbage til en grøn, invasiv form. Kun nukleare ITS og kloroplast trnL-F regioner forskelle, der kan anvendes til genetisk skelne mellem cogongrass og JBG. ITS-regionen har i alt 3 SNPs (single nucleotide polymorphisms) mellem cogongrass og JBG, mens trnL-F region har 2 SNPs og 2 InDels (indsætninger og sletninger). Disse genetiske forskelle kunne række-specifikke PCR-primere, der udvikles, der kan skelne mellem vild-type cogongrass og JBG vender. De mest pålidelige resultater er kommet fra primere afledt fra plastidet trnL-F region. Således er denne protokol baseret på sekvensen forskellene mellem trnL-F regioner af chloroplast genom cogongrass, JBG og reverterede JBG (figur 4).
For at hjælpe generere primere, der er mere specifikke for de pågældende sorter og for at hjælpe med at undgå falske positiver fra nært beslægtede arter, all kendte trnL-F sekvenser I. cylindrica sorter blev sammenlignet med trnL-F sekvenser fra beslægtede græsarter (43 uafhængige sekvenser fra 29 arter, f.eks Cymbopogon citratus og Sorghastrum incompletum og Coix Lacryma-jobi, Miscanthus sinensis, saccharum officinarum, Sorghum halepense). Skønt vi undersøgte forskellige specifikke primersekvenser tværs 29 arter af græs, specificiteten af de forskellige specifikke primere ikke er blevet omfattende undersøgt for dets evne til at amplificere DNA fra de fleste andre græsarter. Derfor bør væv, der anvendes til DNA-ekstraktion omhyggeligt identificeres som I. cylindrica før du starter denne protokol. Hvis græsset ikke kan identificeres som enten cogongrass eller JBG, så foreslår vi, sekventering af PCR-produktet at sikre, at sekvenser er en eksakt match til cogongrass eller JBG. I øjeblikket er den mest nøjagtige metode til bekræfte identiteten af en given græs prøve er at udføre PCR på både T-rnL-F og regioner, efterfulgt af sekvensen kontrol af PCR-produkter og sammenligning af sekvenserne med kendte sekvenser fra præcist identificerede taxa. DNA kan forstærkes ved hjælp af kontrol primere er beskrevet i denne protokol (for trnL-F-regionen) eller andre primere, der findes i andre publikationer 13-15. Sekventering er langt mere arbejdskraft og omkostninger intensivt, end at bruge vores forenklet procedure.
Kvaliteten af primerne anvendt til PCR er kritisk for succesen af proceduren. Vi har primerne for denne fremgangsmåde fås fra Oblique Bio, Inc. ( http://www.obliquebio.com/web/ , Huntsville, AL). Fordelen ved at anordne de primere fra skrå Bio er, at de lagre et stort antal portioner af hver primer fra den samme prøve produktion serier som primerne vi anvendt til optimering i vores laboratorium. Følgelig primere ikke kun har den samme sekvens, men they kommer fra nøjagtig den samme produktion af masse, som blev anvendt i denne protokol. Brug primere fra samme parti, kan bidrage til at undgå uvedkommende variable i den procedure, som kan skyldes forskelle i kvaliteten af PCR-primere. Ligeledes vil mens andre Taq polymeraser skulle virke fint for PCR, kvaliteten af den Taq anvendte polymerase have en indvirkning på kvaliteten af PCR-resultater. For at muliggøre bedre sammenhæng i PCR-reagenser, har vi optimeret protokol under anvendelse af reagenser fra Clontech. Fordelen 2 Polymerase (Ciontech, Mountain View, CA, Cat # 639201 eller 639202) er en blanding af en robust, hot-start Taq polymerase og en korrekturlæsning enzym, der hjælper til at give en høj specificitet og mere præcise amplifikationer.
Fordi denne protokol bygger på kloroplast DNA, som er maternelt nedarvet i græsser, kan hybridisering begivenheder mellem cogongrass og JBG genotyper ikke kan indfanges med vores molekylær identifikation procedure. I tilfælde, hvor hypridization er suspected, anbefaler vi at bruge nukleare områder, der er nedarvet fra begge forældre. Det mest almindeligt anvendte ikke-plastidgenomet variable region til at overveje i anlægget genotypebestemmelse er det nukleare ribosomale regionen 13-15,17. I øjeblikket er vi gør fremskridt i retning af multiplexing forstærkningen af kloroplast trnL-F region med den nukleare ITS-regionen i det samme PCR-rør. Multiplexing plastidtransformation med nukleare DNA-regioner ville potentielt omgå de begrænsninger ved at bruge enten alene, men sådanne metoder kræver optimering og yderligere evaluering for at afgøre muligheden fra sag til sag. Brugen af kvantitativ real-time PCR (qPCR) og nyere teknologier, såsom molekylære beacons (fluorescerende primer prober), er også vurderet som ikke-sikker og præcis plante genotypebestemmelserne metoder.
Protokollen præsenteres her tilvejebringer en hurtig og pålidelig fremgangsmåde til at skelne JBG tilbage fra den for vildtype-cogongrass. Vi opfordrer brugerrs af denne protokol til at kontakte os at rapportere resultater, der stammer fra anvendelsen af denne protokol. Sådanne delte oplysninger vil bidrage til at give oplysninger om fordelingen af JBG tilbage. Dette vil også hjælpe lovgivere på USDA træffe kvalificerede beslutninger om handlinger, der kan være behov for at omgå spredning og potentiale hybridisering af de meget invasive cogongrass sorter.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Alan Tasker (USDA-APHIS, Riverdale, MD), Stephen Compton (Clemson), Sherry Aultman (Clemson), Craig Ramsey (USDA-APHIS, Fort Collins, CO), og Betty Marose (UMD) for hjælp til opnåelse af prøver . Vi takker de studerende Andrew Adrian (UA-Huntsville) og Derek Thacker (UA-Huntsville) for deres hjælp med at teste denne protokol, og Joseph Herdy for sit arbejde i optagelserne til videoen. Dette arbejde blev finansieret af National Fish and Wildlife Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DNeasy Plant Mini Kit | Qiagen | 69104 or 69106 | Any reputable genomic plant DNA kit that yields good quality DNA should work fine for these procedures. |
| trnF(GAA)-F | Oblique Bio, Inc. | 3-0578 | Forward positive control primer |
| trnL(5’ exon)-C | Oblique Bio, Inc. | 3-0579 | Reverse positive control primer |
| trnLF-C-F1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0864 | Forward wild-type cogongrass primer |
| trnLF-C-R1 | Oblique Bio, Inc. | 3-0865 | Reverse wild-type cogongrass primer |
| trnLF-R-F2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0866 | Forward JBG and JBG revert primer |
| trnLF-R-R2 | Oblique Bio, Inc. | 3-0867 | Reverse JBG and JBG revert primer |
| Advantage UltraPure PCR dNTP Mix | Clontech Laboratories | 639125 | |
| Advantage 2 Polymerase | Clontech Laboratories | 639201 or 639202 | A good proof-reading, hot-start Taq polymerase |
References
- Holm, L. G., Pancho, J. V., Herberger, J. P., Plucknett, D. L. A Geographical Atlas of World Weeds. , Krieger Publishing Company. Malabar, Florida, U.S. (1979).
- CABI, Crop Protection Compendium. Commonwealth Agricultural Bureau International (CABI). , Wallingford, UK. (2007).
- MacDonald, G. E. Cogongrass (Imperata cylindrica) - Biology, ecology, and management. Critical Reviews in Plant Sciences. 23, 367-380 (2004).
- Talley, S. M., Cseke, L. J. Molecular diagnostic technologies for invasive plants. CPHST Fort Collins Laboratory 2009 Annual Report. Zink, R. , USDA-APHIS-PPQ-CPHST. Fort Collins, Colorado. 27-28 (2009).
- Dozier, H., Gaffney, J. F., McDonald, S. -K., Johnson, E. R. R. L., Shilling, D. G. Cogongrass in the United States: History, ecology, impacts, and management. Weed Technology. 12, 737-743 (1998).
- Chikoye, D., Ekeleme, F. Weed flora and soil seedbanks in fields dominated by Imperata cylindrica in the moist savannah of West Africa. Weed Research. 41, 475-490 (2001).
- Weber, E. Invasive Plant Species of the World: A Reference Guide to Environmental Weeds. , CABI Publishing. Wallingford, UK. (2003).
- Patterson, D. T. Shading effects on growth and partitioning of plant biomass in Cogongrass (Imperata cylindrica) from shaded and exposed habitats. Weed Science. 28, 735-740 (1980).
- Cole, J. T., Cole, J. C. Ornamental grass growth response to three shade intensities. Journal of Environmental Horticulture. 18, 18-22 (2000).
- Bryson, C. T., Koger, C. H., Byrd, J. D. Effects of temperature and exposure period to heat on cogongrass (Imperata cylindrica) viability. Weed Technology. 21, 141-144 (2007).
- Capo-chichi, L. J. A., Faircloth, W. H., Williamson, A. G., Patterson, M. G., Miller, J. H., van Santen, E. Invasion Dynamics and Genotypic Diversity of Cogongrass (Imperata cylindrica) at the Point of Introduction in the Southeastern United States. Invasive Plant Science and Management. 1 (2), 133-141 (2008).
- Talley, S. M., Ramsey, C. L. Experimentally assessing the invasive potential of plants. CPHST Laboratory 2009 Annual Report. Zink, R. , USDA-APHIS-PPQ-CPHST. Fort Collins, Colorado. 29-30 (2009).
- Hodkinson, T. R., Chase, M. W., Lledó, M. D., Salamin, N., Renvoize, S. A. Phylogenetics of Miscanthus, Saccharum and related genera (Saccharinae, Andropogoneae, Poaceae) based on DNA sequences from ITS nuclear ribosomal DNA and plastid trnLintron and trnL-F intergenic spacers. J. Plant Res. 115, 381-392 (2002).
- Kress, W. J., Wurdack, K. J., Zimmer, E. A., Weigt, L. A., Janzen, D. H. Use of DNA barcodes to identify flowering plants. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (23), 8369-8374 (2005).
- Roodt-Wilding, R., Spies, J. J. Phylogenetic relationships in southern African chloridoid grasses (Poaceae) based on nuclear and chloroplast sequence data. Systematics and Biodiversity. 4, 401-415 (2006).
- Brody, J. R., Kern, S. E. Sodium boric acid: a Tris-free, cooler conductive medium for DNA electrophoresis. BioTechniques. 36, 214-216 (2004).
- Chou, C. -H., Tsai, C. C. Genetic variation in the intergenic spacer of ribosomal DNA of Imperata cylindrica (L.) Beauv. var. major (Cogongrass) populations in Taiwan. Botanical Bulletin of Academia Sinica (Taipei). 40, 319-332 (1999).
