Summary
מאמר זה מתאר שיטה תיוג עור וכלי דם עובריים התימוס.
Abstract
הקמתה של רשת כלי דם תפקודית הוא חלק חיוני של organogenesis, והוא נחוץ לצורך תפקוד האיבר אופטימלית. לדוגמה, במבנה vasculature התימוס נכונה דפוסים חיונית כניסה thymocyte לתוך איבר ויציאה בוגרת T-cell לפריפריה. הסידור המרחבי של כלי הדם התימוס תלוי אותות microenvironment המקומית, כלומר בתאי אפיתל הרתי (TEC). הדיווחים האחרונים מצביעים על כך מספר שיבוש תוצאות אלו אותות כלי דם התימוס 1,2 פגמים. מחקרים קודמים תיארו טכניקות המשמשים התווית התימוס ילודים ומבוגרים 1,2 vasculature. אנו מדגימים כאן טכניקה תיוג כלי הדם התימוס עובריים. שיטה זו משלבת את השימוש FITC-dextran או Griffonia (Bandeiraea) לקטינים Simplicifolia אני (GSL 1 - isolectin B 4) זריקות וריד הפנים CD31 מכתים נוגדן לזהות מבנים וסקולרית התימוס ועל PDGFR-β לתייג הרתי perivascular mesenchyme 3-5. האפשרות של שימוש cryosections או חלקים vibratome הוא גם סיפק. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות מומים בכלי הדם התימוס, שהוא קריטי עבור הגדרת התפקידים של TEC-derived מולקולות היווצרות כלי דם התימוס. כפי שיטת התוויות vasculature כולו, זה יכול לשמש גם כדי לנתח את רשתות כלי דם באיברים ורקמות רבות ברחבי העובר כולל העור לב 6-10.
Protocol
1. והעמסת שכותרתו dextran ו-GSL אני isolectin ב 4 זריקות וריד הפנים לתייג vasculature עובריים
- הכן FITC-dextran (50ug/mL) ב בופר פוספט (PBS) או GSL 1 - isolectin B 4 (20ug/200uL) ב-PBS בצינור Eppendorf 1.5mL וחם עד 37 ° C. הוסף 100uL מניות 1.25mM מהיר ירוק / PBS לפתרון FITC-dextran (הנפח הכולל 1mL) ו 180uL מניות 1.25mM מהיר ירוק / PBS עד 1 GSL - isolectin B 4 (200uL הנפח הכולל), ולכן הפתרון הוא כחול בעליל.
- לנתח E14.5-E18.5 עוברים שק החלמון יחד, עוזב את גבעול allantoic (עורק הטבור וריד) ללא פגע.
- העברת עוברים לצלחת פטרי חדש (60 X 15 מ"מ) לטבול אותם PBS בטמפרטורת החדר.
- מקם את העובר כדי לספק מבט sagittal הראש / פנים. שימוש במלקחיים לנתח מיקרו בעדינות לתפוס את העובר בראש.
- באמצעות מחט 30G, להזריק 50uL FITC-dextran (50ug/mL) או GSL 1 - isolectin B 4 (ב 20ug 200uL PBS) לווריד הפנים מכוון את המחט לכיוון החלק האחורי של הראש.
- כאשר צבע גלוי בווריד הטבור, להוציא את המחט ולהפריד את העובר מן גבעול allantoic (עורק הטבור וריד).
- בעקבות זריקות, לאפשר לעובר להישאר PBS בטמפרטורת החדר למשך 2-3 דקות כדי לצבוע זורם לאורך העובר.
2. Whole-Mount ניתוח בכלי הדם בעור
- לאחר המאפשר לצבוע לזרום לאורך העובר, להסיר דגימות עור מאזורים של הגפיים, הגב, הבטן וכו '8,9.
- לשטוף מדגם העור בקור PBS, ולתקן 4% PFA / PBS למשך 2 שעות 8,9. לשטוף 3 פעמים במשך 10 דקות כל בקבוקון ברור 4mL עם 2ml קר PBS.
- מניחים על עור מדגם מיקרוסקופ שקופיות ולהוסיף 100 μl של הרכבה התקשורת כל שקופית וכוס לכסות.
- אפשר שקופיות יבש באזור אחסון כהה.
- המשך שלב בסעיף "רכישת תמונות" 2.
3. רב צבע תיוג של התימוס ועל vasculature לב ותאי perivascular עבור cryosections (המשך של סעיף 1, שלב 7)
- העובר כולו "פלאש להקפיא" בחנקן נוזלי. עוברים יכולים להיות מאוחסנים ב -80 ° C עד הניתוח.
- לחלופין, לנתח את בלוטת התימוס, לשטוף ב 4 ° C PBS, ולתקן ב Paraformaldehyde 2ml 4% (PFA) / PBS למשך 2 שעות. שטוף 3 פעמים למשך 10 דקות בקור PBS, מקום thymi ב אוקטובר, ולהקפיא ולאחסן עד השימוש ב -80 ° C.
- עבור cryosectioning, להפיץ אוקטובר על "הבלוק" קטע והר את העובר או באיברים גזור / רקמות עבור חתך.
- גזור הרקמה הקפואה אל תוך 10 חלקים עבים מיקרומטר ולאסוף בשקופיות.
- תיקון הסעיפים אצטון למשך 5-10 דקות. לשטוף 3 פעמים TBS קר.
- חסום חמור בדם 10% / כפות בתא לחות בטמפרטורת החדר.
- לדגור על סעיפים 1 שעה לילה עם 100 μl של נוגדנים העיקרי בתא לחות על 4 מעלות צלזיוס: בדוגמה זו, אנו משתמשים עכברוש אנטי עכבר CD31 (1:100) על האנדותל, תווית עז אנטי עכבר PDGFR-β (1:100) לתייג תאים perivascular. כדאי לכסות שקופיות עם לחתוך בנפרד רצועות Parafilm כדי להבטיח את הנוגדן היא התפשטה באופן אחיד על פני הקטע.
- לאחר הדגרה עם נוגדן ראשוני, לשטוף סעיפים 3 פעמים TBS קר. דגירה עם 100 μl של נוגדנים משני מתאים במשך 30 דקות מינימום.
- לשטוף 3 פעמים TBS קר. הוסף 100 μl של הרכבה התקשורת כל שקופית וכוס לכסות.
- אפשר שקופיות יבש באזור אחסון כהה.
- המשך לסעיף "ייבוא תמונות".
4. רב צבע תיוג של התימוס בכלי הדם ותאי perivascular עבור חלקים vibratome (המשך של סעיף 1, שלב 7)
- לנתח את אונות התימוס מעובר ולשטוף בקור PBS.
- תקן התימוס ב 4% PFA / PBS בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות.
- לשטוף ב-PBS טריטון X (0.15%) 3 פעמים, 10 דקות thymi מקום מחסנית פלסטיק לצלול קטן ב -4% נמוך להמיס agarose / PBS (~ 4 ° C). התימוס צריך להיות במגע עם החלק התחתון של המחסנית.
- אפשר agarose לבסס על הקרח (3-5 דקות). השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך agarose עודף. הוסף דבק כדי לחסום את vibratome לדבוק מדגם לחסום את.
- הוסף קר PBS לאמבטיה מים vibratome עד המדגם להב שקועים.
- קביעת מהירות משרעת (אמפליטודה גבוהה נמוכה בינונית מהירות הוא אידיאלי עבור חלקים התימוס רך). משרעת צריך להיות מופחת אם חלקים להתפרק עקב תסיסה עודף.
- חותכים 50 מקטעים אממ.
- בעזרת מכחול, לאסוף מקטעים microplate 24 באר בקור PBS.
- בלוק הסעיפים 500 μl של נסיוב חמור של 10% טריטון X-PBS (0.15%) במשך 30 דקות.
- סעיפים דגירה עבור 8 שעות לילה עם נוגדן ראשוני, כגון אנטי CD31 ואנטי PDGFR-β, ב microplate 24-מכוסה היטב.
- לשטוף 3 פעמים ב-PBS טריטון X (0.15%) על סך של 8 שעות 4 ° C.
- בלוק סעיפים בסרום חמור של 10% טריטון X-PBS (0.15%) במשך 30 דקות.
- דגירה חלקים עבור 8 שעות הלילה ב 4 ° C עם נוגדנים משני המתאים.
- לשטוף 3 פעמים ב-PBS טריטון X (0.15%) על סך של 8 שעות 4 ° C.
- Re-לתקן דגימות 4% PFA / PBS במשך 30 דקות על הקרח.
- לשטוף 3 פעמים ב-PBS טריטון X (0.15%) מעל 30 דקות על הקרח.
- מייבשים דגימות דרך מדורגת MeOH / PBS-טריטון X סדרה: 25% MeOH, MeOH 50%, MeOH 75% ו 100% MeOH ב 10 דקות לכל שלב. החלף MeOH 100% עם MeOH טרי אחרי 10 דקות לדגור במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר.
- במיכל זכוכית, לערבב באב (בנזיל אלכוהול: בנזיל בנזואט) ביחס 1:02. שלב באב עם MeOH ריכוז סופי של 50% ו באב MeOH 50%. דגירה המדגם באב: MeOH במשך 10-15 דקות.
- העברת דגימת למיכל זכוכית עם 100% ו באב דגירה במשך 10-15 דקות או עד פינה, בטמפרטורת החדר.
- מלא שקופיות דיכאון (0.7mm עומק) עם באב 100% טרי מדגם להעביר לצד. מוסיפים כיסוי זכוכית (מס '1.5) ואת החותם עם 2-3 שכבות של לק. אפשר לק להקשיח בחושך בטמפרטורת החדר, ואז לאחסן מדגם ב 4 ° C.
הערה: שקופיות חייב להיות אטום לחלוטין לפני רכישת התמונה confocal. תמונות צריך להירכש בתוך 12-24 שעות, כמו צבעי ניאון יכול להמוג באב. - המשך לסעיף "ייבוא תמונות".
5. תמונה הרכישה
- תמונה 10 מיקרומטר חלקים קפואים עם מיקרוסקופ confocal באמצעות תכנית-Apochromat 20X/0.8 אובייקטיבי (512 X 512 פיקסלים) עם 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin ב '4), 543 -, ו - 633 ננומטר קווי לייזר.
- רוכשת confocal Z-קטעים של העור הר שלם 50 מיקרומטר agarose-משובצים קטעים באמצעות תכנית-Apochromat 10X/0.4 אובייקטיבי (512 X 512 פיקסלים) עם 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin ב '4), 543 -, ו 633 ננומטר קווי לייזר. Serial-Z קטעי יש לאסוף באופן רציף עבור כל ערוץ בהתאמה ב 1 מיקרון.
- לשחזר סדרתי Z-קטעים באמצעות Zeiss AxioVision 4.6 או תוכנות אחרות ניתוח התמונה.
6. נציג תוצאות:
תיוג יעיל של כלי הדם העוברי היא קריטית להערכת פגמים כלי דם בעכברים עובריים. איור 1 מציג תוויות ספציפיים של כלי הדם E16.5 התימוס (1A-B) ושיתוף עם תיוג CD31 (1B), בנוסף מכתים של החדרים, ימין ושמאל (1E-F), בהתאמה. I-GSL isolectin B 4 פרוטוקול cryosections כמתואר בסעיפים 1, 3 ו 5 שימש בניסויים אלו. Whole-Mount תיוג של רשת כלי דם בעור E16.5 על עכברים, באמצעות פרוטוקולים המתוארים בסעיפים 1, 2, ו -5 מוצג באיור 1C-D.
איור 1 מקרא. FITC GSL אני - isolectin ב 4 זריקות לתוך וריד הפנים E16.5 עוברי עכברים. Cryosection א של התימוס עובריים לאחר ההזרקה. b. מיזוג של CD31 במשותף עם תיוג B isolectin 4. ג ו - ד Whole-mount של הזרקת vasculature עובריים העור הבאה. e. ו Cryosection ו עובריים של הלב ה (מימין החדר) ו (משמאל החדר) הזריקה הבאה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Whole-mount ו PECAM-1 (CD31) מכתים על הסעיפים הם בשיטות המקובלות על תיוג vasculature בעכברים עובריים. שיטות אלו דורשים שימוש immunofluorescence ישיר ו / או עקיף, דטרגנטים כדי permeabilize רקמות העכבר. זה מוכיח להיות תהליך עדכני למדי. הנה, יש לנו עובדים FITC-dextran או isolectin ב 4 זריקות וריד הפנים ישירות התווית vasculature עובריים, ובכך למנוע את הדרישה צעדים תיוג נוגדן. יתר על כן, שיטה זו מאפשרת הערכה של המצב התפקודי של כלי הדם, כמו "דולף" פנוטיפים יתגלה בשיטה זו, אך לא על ידי שיטות קונבנציונאלי מכתים נוגדן.
יש לנו תוקף את היעילות של טכניקה זו על ידי ניתוח קטעי התימוס עובריים, והלב, וכן mounts שלם של כלי הדם בעור זמן קצר לאחר הזרקות וריד הפנים. בנוסף, יש לנו חלקים התימוס מוכתם עבור CD31 הבאים FITC-dextran או isolectin ב 4 זריקות כדי להדגים FITC ספציפית תוויות מבנים כלי דם עובריים. לכן FITC-dextran או isolectin ב 4 זריקות וריד הפנים בעוברים יכול להיות מנוצל כדי להעריך במהירות פנוטיפים כלי דם באיברים רבים ברחבי הפיתוח. בנוסף, שיטה זו מאפשרת לחוקרים לקבוע את זמן מסוים במהלך ההתפתחות שבו כלי הדם ההיקפיים עובריים מתחבר איבר של עניין, באמצעות אנגיוגנזה. יש לנו כלל תיוג נוגדן פרוטוקול התואמת זה FITC-dextran או isolectin B 4 בפרוטוקול. שימוש בפרוטוקול זה, PDGFR-β, α-SMA, ונוגדנים אחרים, אשר תווית רכיבים מבניים של כלי הדם, יכולים להיות מועסקים כדי להמשיך להעריך את טיבו של מומים עובריים וסקולרית.
הערות חשובות: לצבוע כמו גרין מהיר ניתן להוסיף 1 FITC-dextran/GSL - isolectin ב 4 פתרון כדי להמחיש את התערובת כפי שהוא מוזרק לווריד הפנים. זמן קצר לאחר ההזרקה FITC-dextran, לצבוע ניתן לצפות בווריד הטבור בכלי הדם ברחבי שק החלמון ואת השליה. בשלב זה, חבל הטבור יש להסיר מן העובר. במקרה של צבע לא מזוהה ב גבעול allantoic (עורק הטבור וריד) הטכניקה סביר נכשל. ראינו שאם המחט לא להיכנס ישירות לווריד פנים, FITC-dextran / והעמסת שכותרתו GSL 1 - isolectin B 4 מצטבר באזורים הסמוכים של הפנים. ראינו גם כי FITC-dextran התוויות vasculature כולו, בעוד GSL 1 - isolectin B 4 תוויות מבנים כלי דם עובריים ביותר, אלא גם אי - וסקולרית תאים בכבד. מיקרוסקופ פלואורסצנטי, לנתח ניתן להשתמש כדי לבדוק אם הזריקה הייתה מוצלחת.
עכברים
עכברים C57Bl6 / י נרכשו מ ג'קסון מעבדה (בר הרבור, ME). העוברים שנוצרו באמצעות סוג בר, הזדווגויות מתוזמנות. הניסויים אושרו על ידי האוניברסיטה של טיפול בבעלי חיים המוסדית של גאורגיה ועדת שימוש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מספרים מענק R01AI055001 ו R01AI082127 מ NIAID כדי NRM ואת אחוות SREB בפרס על עבודת JLB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD150S-1G | |
| Fluorescein labeled GSL 1 - isolectin B4 | Vector Laboratories | FL-1201 | |
| Fast Green | MP Biomedicals | 195178 | |
| PFA | Fluka | 76240 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Optimal Cutting Temperature Compound (O.C.T. | VWR international | 25608-930 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-33 | |
| Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| rat anti-mouse CD31, | BD Biosciences | 558736 | |
| goat anti-mouse PDGFR-β | R&D Systems | AF1042 | |
| donkey anti-rat CD31 Alexa 647 (Invitrogen) | Biolegend | 102516 | |
| donkey anti-goat Alexa 594 (Invitrogen) | Invitrogen | A11058 | |
| Triton X -100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Low melt agarose/PBS | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Methanol | Fisher Scientific | A413-4 | |
| Benzyl Alcohol | Acros Organics | 148390010 | |
| Benzyl Benzoate | Acros Organics | 105860010 | |
| Depression slides | Fisher Scientific | S175201 | |
| Fluorogel | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Cover Glass (22X22)-1.5 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 152222 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Micro dissecting forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | |
| Parafilm No. OM992 | Fisher Scientific | 13-374-16 | |
| 12 and 24 well microplates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
| Superfrost/PlusMicroscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 4mL clear vials | National Scientific Company | B7800-2 |
References
- Cuddihy, A. R. VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus. Blood. 113, 2723-2731 (2009).
- Muller, S. M. Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).
- Muller, S. M. Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus. J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).
- Foster, K. Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus. J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).
- Liu, C. Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization. Blood. 108, 2531-2539 (2006).
- Lavine, K. J. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice. J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Murphy, P. A. Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).
