Summary
本文介绍了标签胚胎皮肤和胸腺血管的方法。
Abstract
功能的血管网络的建立是一个器官形成的重要组成部分，是最佳的器官功能要求。例如，在胸腺适当的血管形成和图案是胸腺细胞进入到器官和成熟的T细胞向周边出口所必需的。在胸腺血管的空间安排，是依赖于从局部微环境的信号，即胸腺上皮细胞（TEC）。最近的一些报告表明，这些信号结果在胸腺血管缺陷1,2中断。以前的研究已经描述技术用于标签的新生儿和成人的胸腺血管 1,2 。我们在这里展示一个标签血管在胚胎胸腺技术。这种方法结合使用FITC -葡聚糖或加纳（Bandeiraea）Simplicifolia凝集素我（1 - GSL isolectin乙4）面部静脉注射和CD31抗体染色，以确定胸腺的血管结构和PDGFR -β标签胸腺血管周围间质 3-5 。还提供了使用冰冻切片或vibratome部分选项。该协议可用于识别胸腺血管的缺陷，这是定义在胸腺血管形成的TEC -派生分子的角色的关键。作为方法的标签，整个血管，它也可以被用来分析多个器官和整个组织，包括皮肤和心脏 6-10胚胎的血管网络。
Protocol
1。荧光标记的葡聚糖和金思朗我isolectin乙面部静脉注射标签胚胎血管
- 准备FITC -葡聚糖（50ug/mL）在磷酸盐缓冲液（PBS）或金思朗1 - isolectin乙4（20ug/200uL）在1.5ml的Eppendorf管中，并在PBS温暖至37 ° C 。股票1.25MM快速绿/ PBS 100uL FITC -葡聚糖溶液（总体积毫升）和股票1.25MM快速180uL绿/ PBS金思朗1 - isolectin乙4（总体积200uL），这样的解决方案是明显的蓝色。
- 解剖E14.5 - E18.5胚胎和卵黄囊在一起，留下的尿囊柄（脐动脉和静脉）不变。
- 胚胎转移到一个新的皮特里盘（60 × 15毫米），他们沉浸在PBS在室温下。
- 胚胎的位置，以提供的头部/面部矢状。使用微解剖钳轻轻抓住头胚胎。
- 使用30G针头，注入50uL FITC -葡聚糖（50ug/mL）或金思朗1 -到面部静脉针指 向的后脑勺isolectin乙4（20ug 200uL PBS）。
- 当染料是在脐静脉可见，去掉针头和独立的胚胎从尿囊柄（脐动脉和静脉）。
- 注射之后，让胚胎在室温下PBS为2-3分钟，使染料整个胚胎循环。
2。全安装皮肤血管分析
- 使染料流通整个胚胎后，取下皮肤样本地区的四肢，背部，和胃，等8,9。
- 在冷PBS洗皮肤样本，并在4％PFA / PBS固定为2小时8,9。 10分钟，每个4ML明确小瓶用2ml冷PBS洗3次。
- 放在皮肤样本在显微镜幻灯片，并添加100μL安装媒体每张幻灯片和一个玻璃盖。
- 允许的幻灯片，以干在黑暗的存储区域。
- 继续执行步骤2的图像采集“部分。
3。胸腺及心脏血管，血管周围细胞和冰冻切片的多色标签（继续从第1款，第7步）
- “闪光冻结”整个胚胎在液氮中。胚胎可以储存于-80 ° C，直到分析。
- 另外，解剖出胸腺，在4 °彗星PBS冲洗，并在2小时修复液2ml 4％多聚甲醛（PFA）/ PBS。洗3次，地点在华侨城thymi冷PBS，并冻结和存储10分钟，直到使用在-80 ° C
- cryosectioning，传播“块”一节OCT和安装的胚胎或切片解剖器官/组织。
- 切成10微米厚的冰冻组织和收集的幻灯片。
- 修复部分在5-10分钟丙酮。在寒冷的TBS清洗3次。
- 在室温湿度试验箱在10％驴血清/ TBS座。
- 孵育1初级抗体100μL湿度试验箱在4小时通宵部分℃：在这个例子中，我们使用大鼠抗小鼠CD31（1:100）标签内皮细胞和山羊抗鼠PDGFR -β （1:100）标签血管周围细胞。它是有用的覆盖与单独切割的封口膜条幻灯片，以确保该抗体是统一部分蔓延。
- 初级抗体的潜伏期后，在寒冷的TBS洗节3倍。 100μL适当的二级抗体孵育至少30分钟。
- 在寒冷的TBS清洗3次。加入100μL安装媒体每张幻灯片和一个玻璃盖。
- 允许的幻灯片，以干在黑暗的存储区域。
- 继续执行“图像采集”部分。
4。 vibratome部分胸腺血管和血管周围细胞的多色标签（继续从第1款，第7步）
- 解剖出胚胎胸腺叶，冷PBS冲洗。
- 4％PFA / PBS在室温下2小时修复胸腺。
- 在PBS - TRITON X（0.15％）的3倍，10分钟和地方thymi洗净，在一个小塑料盒和淹没在4％的低熔融琼脂糖/ PBS（4℃）。胸腺应与墨盒底部的接触。
- 允许琼脂糖上冰（3-5分钟），以巩固。使用刀片，切断多余的琼脂糖。添加胶水vibratome块，并坚持以块样品。
- 直到样品和刀片都沉浸冷PBS vibratome水浴。
- 设置速度和幅度（高幅度和低适中的速度，是理想的软胸腺部分）。如果部分打破由于多余的搅拌，应减少的幅度。
- 切割50微米的部分。
- 使用画笔，在冷PBS 24孔微孔板收集部分。
- 块切片在500μL10％驴血清PBS - TRITON X为30分钟（0.15％）。
- 孵育部分为8小时初级抗体过夜，如抗CD31和抗- PDGFR -β在有盖的24孔微孔板。
- 洗净比PBS - TRITON X 3次（0.15％）共8个小时，在4 ° C。
- 块切片在10％驴血清PBS - TRITON X为30分钟（0.15％）。
- 孵育4℃，适当的二次抗体的部分为8小时至过夜。
- 洗净比PBS - TRITON X 3次（0.15％）共8个小时，在4 ° C。
- 重新修复的样品在4％PFA / PBS在冰上30分钟。
- 在冰上超过30分钟，洗净PBS - TRITON X 3次（0.15％）。
- 通过分级甲醇/ PBS -海神X系列脱水样本：25％甲醇，50％甲醇，75％甲醇，每一步都在10分钟和100％甲醇。 10分钟后，替换100％，与新鲜甲醇的甲醇和1小时在室温下孵育。
- 在一个玻璃容器中，在1:2的比例混合BABB（苯甲醇苯甲酸苄酯）。为终浓度为50％和50％的BABB甲醇与甲醇结合BABB。孵育BABB样品：甲醇为10-15分钟。
- 转移样品到玻璃容器100％BABB孵育10-15分钟或直到被清除，在室温下。
- 填充新鲜的100％的BABB和转让样品侧面抑郁幻灯片（0.7毫米深度）。 2-3指甲油大衣盖玻璃（1.5号）和密封。允许波兰在室温下硬化钉在黑暗中，然后将其存储样品在4 ° C。
注：幻灯片等，必须完全密封的共聚焦图像采集前。图像应在12-24小时之内，收购在BABB荧光染料褪色。 - 继续执行“图像采集”部分。
5。图像采集
- 图片10微米的冰冻切片，共聚焦显微镜使用488计划复消色差透镜20X/0.8目标（512 x 512像素） - （FITC-dextran/GSL 1 - isolectin乙4），543 - ，和633纳米的激光线。
- 收购焦Z -整装皮肤和50微米琼脂糖包埋切片使用488计划复消色差透镜10X/0.4目标（512 x 512像素）的部分- （FITC-dextran/GSL 1 - isolectin 乙 4），543 - 633纳米的激光线。串行Z型截面应收集在1微米顺序，每个相应的通道。
- 重建串行Z轴部分使用蔡司Axiovision 4.6或其他图像分析软件。
6。代表性的成果：
胚胎血管的有效标签是评估在胚胎小鼠的血管缺陷的关键。图1显示了特定的标签E16.5胸腺血管（1A - B）和CD31（1B）的共同标签，除了左，右心室的染色（1E - F），分别。金思朗我isolectin乙4协议是在第1，第3和5中描述的冰冻切片在这些实验中使用。图1C - D E16.5小鼠皮肤的血液血管网全安装的标签，使用在第1，第2条所述的协议，和5所示。
图1传奇。 FITC金思朗我- isolectin乙4到E16.5小鼠胚胎的面部静脉注射 。 E.胚胎心脏E. F. Cryosection（右A. Cryosection胚胎胸腺注射后CD31的共同标签。B.合并isolectin B级4。C.和D.全胚胎皮肤血管注射后安装。心室）F.（左心室）注射后。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
全安装和PECAM - 1（CD31）染色部分标签在胚胎小鼠的血管的常规方法。这些方法需要使用的直接和/或间接免疫荧光和洗涤剂通透小鼠组织。这被证明是一个相当及时处理。在这里，我们有FITC -葡聚糖或isolectin B级4面部静脉注射直接标记的胚胎血管，从而消除了抗体标记的步骤要求。此外，这种方法使血管功能状态的评估，将通过这种方法，而不是由传统抗体染色方法显示“漏水”的表型。
我们已经验证了这种技术的效率，通过分析部分胚胎胸腺，和心脏，以及整个面部静脉注射后不久，皮肤血管坐骑。此外，我们有CD31以下FITC -葡聚糖或isolectin B级4注射证明，FITC标记的专门标签胚胎血管结构染色胸腺部分。因此FITC -葡聚糖或isolectin乙4在胚胎面部静脉注射可利用快速评估在整个开发过程中的多个器官的血管表型。此外，这种方法使研究人员能够在开发过程中确定的具体时间，周边胚胎血管连接到利益的器官，通过血管生成。我们有一个抗体标记的协议，这FITC -葡聚糖或isolectin 乙 4协议兼容。使用该协议，PDGFR -β，SMA -α，和其他抗体，标签血管的结构组件，可能会进一步评估胚胎的血管缺陷的性质。
注意事项：一，如快速绿色染料可添加到FITC-dextran/GSL 1 - isolectin乙4解决方案，以可视化的混合物，因为它是面部静脉注射。 FITC -葡聚糖注射液后不久，染料可以观察到整个卵黄囊及胎盘脐静脉血管。此时，脐带应该从胚胎中删除。在事件中没有检测尿囊柄（脐动脉和静脉），染料技术可能失败。我们观察到，如果针不直接进入面部静脉，FITC -葡聚糖/荧光标记金思朗1 - isolectin乙4面对邻近地区的积累。我们还观察到，FITC -葡聚糖标签整个血管，而GSL 1 -乙4 isolectin标签最胚胎的血管结构，但也非血管细胞在肝脏中。在荧光解剖显微镜可以用来测试是否成功注射。
小鼠
从杰克逊实验室（ME）的巴尔港，购C57BL6 / J小鼠。通过野生型，定时交配产生的胚胎。实验大学格鲁吉亚的机构动物护理和使用委员会批准。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持授权号码R01AI055001和R01AI082127从NIAID的自然资源管理和SREB论文奖学金奖JLB。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD150S-1G | |
| Fluorescein labeled GSL 1 - isolectin B4 | Vector Laboratories | FL-1201 | |
| Fast Green | MP Biomedicals | 195178 | |
| PFA | Fluka | 76240 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Optimal Cutting Temperature Compound (O.C.T. | VWR international | 25608-930 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-33 | |
| Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| rat anti-mouse CD31, | BD Biosciences | 558736 | |
| goat anti-mouse PDGFR-β | R&D Systems | AF1042 | |
| donkey anti-rat CD31 Alexa 647 (Invitrogen) | Biolegend | 102516 | |
| donkey anti-goat Alexa 594 (Invitrogen) | Invitrogen | A11058 | |
| Triton X -100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Low melt agarose/PBS | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Methanol | Fisher Scientific | A413-4 | |
| Benzyl Alcohol | Acros Organics | 148390010 | |
| Benzyl Benzoate | Acros Organics | 105860010 | |
| Depression slides | Fisher Scientific | S175201 | |
| Fluorogel | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Cover Glass (22X22)-1.5 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 152222 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Micro dissecting forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | |
| Parafilm No. OM992 | Fisher Scientific | 13-374-16 | |
| 12 and 24 well microplates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
| Superfrost/PlusMicroscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 4mL clear vials | National Scientific Company | B7800-2 |
References
- Cuddihy, A. R. VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus. Blood. 113, 2723-2731 (2009).
- Muller, S. M. Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).
- Muller, S. M. Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus. J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).
- Foster, K. Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus. J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).
- Liu, C. Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization. Blood. 108, 2531-2539 (2006).
- Lavine, K. J. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice. J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Murphy, P. A. Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).
