Summary
هذه المقالة طريقة لوصفها الجلد والأوعية الدموية الجنينية الغدة الصعترية.
Abstract
إنشاء شبكة الأوعية الدموية الوظيفية هو جزء أساسي من توالد الأعضاء، ومطلوب من أجل وظيفة الجهاز الأمثل. على سبيل المثال، في تشكيل الأوعية الدموية السليمة الغدة الصعترية والزخرفة أمر ضروري لدخول خلية توتية في الجهاز وناضجة الخلايا T-الخروج إلى المحيط. الترتيب المكاني للأوعية الدموية في الغدة الصعترية يعتمد على إشارات من المكروية المحلية، وهي الخلايا الظهارية الغدة الصعترية (TEC). التقارير الأخيرة تشير إلى أن العديد من تعطيل هذه النتائج في الغدة الصعترية إشارات عيوب الأوعية الدموية 1،2. وقد وصفت دراسات سابقة التقنيات المستخدمة لتسمية المواليد والأوعية الدموية الغدة الصعترية الكبار 1،2. نبين هنا تقنية لوصفها الأوعية الدموية في الغدة الصعترية الجنينية. هذا الأسلوب يجمع بين استخدام FITC-ديكستران أو غريفونيا (Bandeiraea) Simplicifolia I كتين (GSL 1 - isolectin B 4) حقن الوريد الوجه والجسم المضاد تلطيخ CD31 لتحديد الغدة الصعترية فاهياكل scular وPDGFR β-لتسمية الغدة الصعترية حول الأوعية اللحمة المتوسطة 3-5. وتقدم أيضا خيار استخدام cryosections أو أقسام vibratome. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد العيوب الأوعية الدموية الغدة الصعترية، وهو أمر حاسم لتحديد أدوار جزيئات TEC المستمدة من الغدة الصعترية في الدم تشكيل السفينة. كأسلوب تصف الأوعية الدموية بأكملها، فإنه يمكن أيضا أن تستخدم لتحليل الشبكات الأوعية الدموية في عدة أعضاء وأنسجة الجنين بما في ذلك في جميع أنحاء الجلد والقلب 6-10.
Protocol
1. وصفت فلوريسئين ديكستران GSL I-B 4 isolectin حقن الوريد الوجه لتسمية الأوعية الدموية الجنينية
- إعداد FITC-ديكستران (50ug/mL) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) أو GSL 1 - isolectin B 4 (20ug/200uL) في برنامج تلفزيوني في أنبوب إيبندورف 1.5mL ودافئة إلى 37 ° C. إضافة 100uL من الأسهم 1.25mM سريعة الأخضر / PBS في حل FITC-ديكستران (إجمالي حجم 1ML) و180uL من الأسهم 1.25mM سريعة الأخضر / PBS إلى ال 1 GSL - isolectin B 4 (مجموع حجم 200uL)، بحيث الحل هو الأزرق بوضوح.
- تشريح E14.5-E18.5 الأجنة وكيس المح معا، وترك ساق السقاء (الشريان والوريد السري) سليمة.
- نقل الأجنة إلى طبق بتري جديد (60 X 15 ملم) وتزج بهم في برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة.
- وضع الجنين لتقديم وجهة نظر السهمي من الرأس / الوجه. استخدام ملقط تشريح الدقيقة لفهم بلطف الجنين في الرأس.
- باستخدام إبرة 30G، وضخ 50uL FITC-ديكستران (50ug/mL) أو GSL1 - isolectin B 4 (PBS 20ug في 200uL) في الوريد الوجه مشيرا الإبرة نحو الجزء الخلفي من الرأس.
- عندما الصبغة مرئيا في الوريد السري، وإزالة الإبرة وفصل الجنين من ساق السقائي (الشريان والوريد السري).
- بعد الحقن، والسماح الجنين على البقاء في PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 دقائق حتى الصبغة يدور في جميع أنحاء الجنين.
2. كامل جبل تحليل الأوعية الدموية الجلد
- بعد السماح الصبغة أن يعمم في جميع أنحاء الجنين، وإزالة الجلد عينات من مناطق في الأطراف والظهر والمعدة و، الخ. 8،9.
- غسل الجلد في عينة PBS الباردة، وإصلاح في PFA 4٪ / لمدة 2 ساعة PBS 8،9. يغسل 3 مرات لمدة 10 دقيقة في كل من القارورة واضحة 4mL مع 2mL الباردة PBS.
- المكان عينة الجلد على شريحة المجهر وإضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام إلى كل شريحة متزايدة والزجاج غطاء.
- تسمح الشرائح لتجف في منطقة التخزين الظلام.
- Proceed إلى الخطوة الباب "الحصول على صورة" 2.
3. متعددة الألوان والعلامات على الغدة الصعترية الأوعية الدموية والخلايا حول الأوعية القلبية لcryosections (متابعة من القسم 1، الخطوة 7)
- "فلاش تجميد 'الجنين كله في النيتروجين السائل. يمكن أن تكون الأجنة وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى التحليل.
- بدلا من ذلك، من تشريح الغدة الصعترية، وشطف في 4 PBS C °، وإصلاح في 2mL امتصاص العرق 4٪ (PFA) / برنامج تلفزيوني لمدة 2 ساعة. يغسل 3 مرات لمدة 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني الباردة، التوتة مكان في OCT، وتجميد وتخزين حتى استخدام في -80 ° C.
- لcryosectioning، وانتشار أكتوبر على 'وقف' قسم تحميل والجنين أو أجهزة تشريح / أنسجة لتقطيع.
- قطع الأنسجة المجمدة في البابين 10 ميكرومتر سميكة وجمع على الشرائح.
- إصلاح المقاطع في الأسيتون لمدة 5-10 دقائق. يغسل 3 مرات في TBS الباردة.
- منع 10٪ في المصل حمار / TBS في غرفة الرطوبة في درجة حرارة الغرفة.
- احتضان لمدة 1 ليلة وضحاها أقسام ساعة مع 100 ميكرولتر من الابتدائيالأجسام المضادة في غرفة الرطوبة في 4 درجات مئوية: في هذا المثال، فإننا نستخدم الفئران لمكافحة فأر CD31 (1:100) لالبطانة التسمية، والماعز المضادة للماوس PDGFR-β (1:100) لتسمية الخلايا حول الأوعية. ومن المفيد لتغطية الشرائح مع شرائط Parafilm خفض بشكل فردي لضمان أن ينتشر بشكل موحد في جميع أنحاء الجسم المضاد القسم.
- بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية، وغسل أقسام 3 مرات في TBS الباردة. احتضان مع 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية الحد الأدنى المناسب ل30 دقيقة.
- يغسل 3 مرات في TBS الباردة. إضافة 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام إلى كل شريحة متزايدة والزجاج غطاء.
- تسمح الشرائح لتجف في منطقة التخزين الظلام.
- انتقل إلى قسم "الحصول على صورة".
4. متعددة الألوان وسم الأوعية الدموية والخلايا حول الأوعية الغدة الصعترية لأقسام vibratome (متابعة من القسم 1، الخطوة 7)
- تشريح من فصوص الغدة الصعترية من الجنين وشطف في برنامج تلفزيوني الباردة.
- إصلاح الغدة الصعترية في PFA 4٪ / PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعةق.
- يغسل في برنامج تلفزيوني-X تريتون (0.15٪) 3 مرات، و10 دقائق التوتة مكان في خرطوشة من البلاستيك الصغيرة ويغرق في 4٪ انخفاض ذوبان الاغاروز / PBS (~ 4 ° C). يجب أن تكون على اتصال الغدة الصعترية مع الجزء السفلي من الخرطوشة.
- السماح لترسيخ الاغاروز على الجليد (3-5 دقائق). استخدام شفرة حلاقة لقطع الاغاروز الزائدة. إضافة الغراء إلى كتلة vibratome والالتزام عينة إلى كتلة.
- إضافة إلى حمام الباردة PBS المياه vibratome حتى يتم مغمورة العينة والنصل.
- تعيين السرعة والسعة (السعة العالية والسرعة المنخفضة المعتدلة مثالية للأقسام الغدة الصعترية لينة). ينبغي خفض السعة إذا أقسام تفريق بسبب التحريض الزائدة.
- خفض 50 أقسام ام.
- باستخدام فرشاة الرسام، وجمع المقاطع في صفيحة ميكروسكوبية 24 بشكل جيد في PBS الباردة.
- أقسام كتلة في 500 ميكرولتر من المصل حمار 10٪ في PBS-تريتون X (0.15٪) لمدة 30 دقيقة.
- احتضان لمدة 8 ساعات أقسام ليلة وضحاها مع الأجسام المضادة الأولية، مثل CD31 المضادة للطائرات والمضادة للPDGFR β-، في صفيحة ميكروسكوبية 24-غطت بشكل جيد.
- يغسل 3 مرات في PBS-تريتون X (0.15٪) على ما مجموعه 8 ساعات في C. ° 4
- أقسام كتلة في المصل حمار 10٪ في PBS-X تريتون (0.15٪) لمدة 30 دقيقة.
- احتضان لمدة 8 ساعات أقسام ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة.
- يغسل 3 مرات في PBS-X تريتون (0.15٪) على ما مجموعه 8 ساعات في C. ° 4
- إعادة الإصلاح في عينات PFA 4٪ / PBS لمدة 30 دقيقة على الجليد.
- يغسل 3 مرات في PBS-X تريتون (0.15٪) أكثر من 30 دقيقة على الجليد.
- يذوى عينات من خلال سلسلة متدرجة X MeOH / PBS-تريتون: 25٪ MeOH، MeOH 50٪، 75٪ MeOH، و 100٪ في MeOH 10 دقائق لكل خطوة. استبدال MeOH 100٪ مع MeOH جديدة بعد 10 دقائق، واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- في وعاء زجاجي، مزيجا BABB (البنزيل الكحول: بنزوات البنزيل) في نسبة 1:2. الجمع بين BABB مع MeOH لتركيز النهائي من 50٪ وBABB MeOH 50٪. احتضان العينة في BABB: MeOH لمدة 10-15 دقيقة.
- نقل SAmple إلى وعاء زجاجي مع BABB 100٪ واحتضان لمدة 10-15 دقيقة أو حتى تطهيرها، في درجة حرارة الغرفة.
- ملء الشريحة الاكتئاب (0.7mm العمق) مع الطازجة BABB 100٪ وعينة نقل إلى الجانب. إضافة تغطية الزجاج (رقم 1.5) وختم مع 2-3 طبقات من طلاء الأظافر. تسمح طلاء الأظافر لتتصلب في الظلام في درجة حرارة الغرفة، ثم تخزين العينة في C. ° 4
ملاحظة: يجب الشرائح مختومة تماما قبل الحصول على الصور مبائر. وينبغي الحصول على صور داخل 12-24 ساعة، والأصباغ الفلورية يمكن أن تتلاشى في BABB. - انتقل إلى قسم "الحصول على صورة".
5. الصورة اكتساب
- صورة رقم 10 ميكرومتر المقاطع المجمدة مع المجهر متحد البؤر باستخدام خطة لامزيغ-20X/0.8 الهدف (512 X 512 بكسل) مع 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B 4)، 543 -، وخطوط الليزر 633-نانومتر.
- الحصول على مبائر Z-مقاطع من الجلد جبل كامل و 50 ميكرومتر الاغاروز جزءا لا يتجزأ من خطة أقسام باستخدام-Apochroma ر 10X/0.4 الهدف (512 X 512 بكسل) مع 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B 4)، 543 -، وخطوط الليزر 633-نانومتر. وينبغي جمع المسلسل Z-المقاطع بالتسلسل في ميكرون-1 لكل قناة منهما.
- إعادة المسلسل Z-المقاطع باستخدام زايس Axiovision 4.6 أو غيرها من البرامج تحليل الصور.
6. ممثل النتائج:
وضع العلامات كفاءة الأوعية الدموية الجنينية هو أمر حاسم لتقييم عيوب الأوعية الدموية في الفئران الجنينية. ويظهر الشكل 1 وضع العلامات المحددة للE16.5 الأوعية الدموية الغدة الصعترية (1A-B) وشارك في وضع العلامات مع CD31 (1B)، بالإضافة إلى تلطيخ من البطينين الأيمن والأيسر (1E-F) على التوالي. تم استخدام I-isolectin GSL B 4 بروتوكول للcryosections كما هو موضح في الأبواب 1 و 3 و 5 في هذه التجارب. جبل كامل وصفها للسفينة شبكة الدم على الجلد E16.5 الفئران، وذلك باستخدام بروتوكولات المبينة في القسمين 1 و 2، ويظهر الشكل 5 في 1C-D.
ntent ">
الشكل 1 أسطورة. FITC GSL I - isolectin B 4 حقن الوريد الوجه في أجنة الفئران E16.5. وCryosection. من الغدة الصعترية الجنينية بعد الحقن. ب. دمج من شارك في وضع العلامات CD31 مع B isolectin 4. ج. ود. الجامعة جبل من الجلد الجنينية حقن الأوعية الدموية التالية. ه. وو. Cryosection ه القلب الجنينية. (يمين البطين) و (البطين الأيسر) الحقن التالية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
جبل كامل وPECAM 1-(CD31) على تلطيخ أقسام هي الأساليب التقليدية لوصفها الأوعية الدموية في الفئران الجنينية. هذه الأساليب تتطلب استخدام المناعي المباشر و / أو غير المباشرة، والمنظفات لpermeabilize الأنسجة الماوس. هذا يبرهن على أن تكون عملية في الوقت المناسب إلى حد ما. هنا، لقد استخدمنا FITC-ديكستران أو isolectin B 4 حقن الوريد الوجه لتسمية مباشرة الأوعية الدموية الجنينية، وبالتالي القضاء على الحاجة إلى وضع العلامات الخطوات الأجسام المضادة. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة تسمح بتقييم الحالة الوظيفية للالأوعية الدموية، كما سيتم الكشف عن 'راشح' الظواهر بهذه الطريقة ولكن ليس عن طريق الطرق التقليدية تلطيخ الأجسام المضادة.
والتحقق من صحة نحن كفاءة هذه التقنية من خلال تحليل قطاعات الغدة الصعترية الجنينية، والقلب، وكذلك يتصاعد كاملة من الأوعية الدموية الجلد بعد فترة قصيرة من حقن الوريد الوجه. بالإضافة إلى ذلك، لدينا أقسام الغدة الصعترية ملطخة CD31 عن بعد FITC-dextrوأو isolectin B 4 حقن لإثبات أن تصف على وجه التحديد FITC هياكل الأوعية الدموية الجنينية. ويمكن استخدام ذلك FITC-B ديكستران أو 4 حقن الوريد isolectin الوجه في الأجنة لتقييم الظواهر بسرعة الأوعية الدموية في الأجهزة متعددة خلال مراحل تطوره. وبالإضافة إلى ذلك، وهذه الطريقة تسمح للباحثين لتحديد وقت محدد خلال التنمية في الأوعية الدموية الطرفية التي الجنينية يتصل جهاز المصالح، عن طريق الأوعية الدموية. أدرجنا بروتوكول وضع العلامات الأجسام المضادة والتي تتوافق مع هذا FITC-B isolectin ديكستران أو بروتوكول 4. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن توظيف PDGFR-β، α-SMA، والأجسام المضادة الأخرى، والتي تسمية المكونات الهيكلية للأوعية الدموية، كذلك لتقييم طبيعة العيوب الجنينية الأوعية الدموية.
يمكن إضافة صبغة مثل الأخضر السريع لال 1 FITC-dextran/GSL - B 4 isolectin حل من أجل رؤية الخليط لأنه الأول: ملاحظات هامةحقن في الوريد ليالي الوجه. بعد وقت قصير من FITC-ديكستران الحقن، يمكن ملاحظة الصبغة في الوريد السري والأوعية الدموية في جميع أنحاء في الكيس المحي والمشيمة. عند هذه النقطة، يجب إزالة الحبل السري من الجنين. في حال لم يتم الكشف عن الصبغة في ساق السقاء (الشريان والوريد السري) تقنية فشل محتمل. وقد لاحظنا أنه إذا كان لا يدخل إبرة في الوريد مباشرة في الوجه، FITC-ديكستران / فلوريسئين المسمى GSL 1 - B 4 isolectin يتراكم في المناطق المتاخمة للوجه. وقد لاحظنا أيضا أن FITC-ديكستران تصف الأوعية الدموية بأكملها، في حين GSL 1 - B 4 isolectin التسميات هياكل الأوعية الدموية أكثر الجنينية، ولكن أيضا غير الوعائية الخلايا في الكبد. ويمكن استخدام المجهر مضان-تشريح لاختبار ما إذا كان حقن ناجحة.
الفئران
تم شراء C57Bl6 / J الفئران من مختبر جاكسون (بار هاربور، ME). وقد تم توليد أجنة عن طريق تي البرية[يب]، التزاوج التوقيت. تمت الموافقة على تجارب أجرتها جامعة جورجيا رعاية الحيوان واللجنة المؤسسية الاستخدام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل أعداد منحة R01AI055001 وR01AI082127 من NIAID لإدارة الموارد الطبيعية وSREB جائزة الزمالة لأطروحة JLB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD150S-1G | |
| Fluorescein labeled GSL 1 - isolectin B4 | Vector Laboratories | FL-1201 | |
| Fast Green | MP Biomedicals | 195178 | |
| PFA | Fluka | 76240 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Optimal Cutting Temperature Compound (O.C.T. | VWR international | 25608-930 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-33 | |
| Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| rat anti-mouse CD31, | BD Biosciences | 558736 | |
| goat anti-mouse PDGFR-β | R&D Systems | AF1042 | |
| donkey anti-rat CD31 Alexa 647 (Invitrogen) | Biolegend | 102516 | |
| donkey anti-goat Alexa 594 (Invitrogen) | Invitrogen | A11058 | |
| Triton X -100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Low melt agarose/PBS | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Methanol | Fisher Scientific | A413-4 | |
| Benzyl Alcohol | Acros Organics | 148390010 | |
| Benzyl Benzoate | Acros Organics | 105860010 | |
| Depression slides | Fisher Scientific | S175201 | |
| Fluorogel | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Cover Glass (22X22)-1.5 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 152222 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Micro dissecting forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | |
| Parafilm No. OM992 | Fisher Scientific | 13-374-16 | |
| 12 and 24 well microplates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
| Superfrost/PlusMicroscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 4mL clear vials | National Scientific Company | B7800-2 |
References
- Cuddihy, A. R. VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus. Blood. 113, 2723-2731 (2009).
- Muller, S. M. Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).
- Muller, S. M. Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus. J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).
- Foster, K. Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus. J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).
- Liu, C. Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization. Blood. 108, 2531-2539 (2006).
- Lavine, K. J. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice. J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Murphy, P. A. Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).
