Summary
Dit artikel beschrijft een methode voor het labelen van embryonale huid en thymus bloedvaten.
Abstract
De oprichting van een functioneel bloedvat-netwerk is een essentieel onderdeel van organogenese, en is noodzakelijk voor een optimale orgaanfunctie. Bijvoorbeeld, in de thymus juiste vaatstelsel vorming en patroonvorming is essentieel voor thymocyt toegang tot het orgel en de mature T-cel uitgang naar de periferie. De ruimtelijke ordening van de bloedvaten in de thymus is afhankelijk van signalen uit de lokale micro-omgeving, namelijk de thymus epitheelcellen (TEC). Diverse recente rapporten suggereren dat verstoring van deze signalen leidt tot thymus bloedvat gebreken 1,2. Eerdere studies hebben beschreven technieken die gebruikt worden om de neonatale en volwassen thymus bloedvaten 1,2 label. We zien hier een techniek voor de etikettering de bloedvaten in de embryonale thymus. Deze methode combineert het gebruik van de FITC-dextran of Griffonia (Bandeiraea) simplicifolia Lectin I (GSL 1 - isolectin B 4) gezichts-ader injecties en CD31 antilichaam kleuring om thymus vasculaire structuren en PDGFR-β aan thymus perivasculaire mesenchym 3-5 label te identificeren. De optie van het gebruik van vriescoupes of vibratome secties is ook voorzien. Dit protocol kan worden gebruikt om de thymus vasculaire defecten, wat essentieel is voor het definiëren van de rol van TEC-afgeleide moleculen in thymus bloedvatvorming te identificeren. Als de methode labels van de gehele vaatstelsel, het kan ook gebruikt worden om de vasculaire netwerken te analyseren in meerdere organen en weefsels in het hele embryo inclusief huid en hart 6-10.
Protocol
1. Fluoresceïne gelabelde dextran en GSL I-isolectin B 4 gezicht ader injecties om embryonale vasculatuur label
- Bereid FITC-dextran (50ug/mL) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of GSL 1 - isolectin B 4 (20ug/200uL) in PBS in een 1,5 ml Eppendorf buis en warm tot 37 ° C. Voeg 100uL op voorraad 1.25mm snel groen / PBS om de FITC-dextran-oplossing (totaal volume 1 ml) en 180uL voorraad 1.25mm snel groen / PBS om de GSL 1 - isolectin B 4 (totaal volume 200uL), zodat de oplossing is zichtbaar blauw.
- Samen ontleden E14.5-E18.5 embryo's en dooierzak, waardoor het allantoïs steeltje (navelstreng slagader en ader) intact.
- Transfer embryo's om een nieuw gerecht Petrie (60 X 15 mm) en dompel hen in PBS bij kamertemperatuur.
- Positie van het embryo naar een sagittale uitzicht op het hoofd / gezicht te geven. Gebruik micro ontleden tang voor het embryo zachtjes greep aan het hoofd.
- Met behulp van een 30G naald injecteren 50uL FITC-dextran (50ug/mL) of GSL 1 - isolectin B 4 (20ug in 200uL PBS) in het gelaat ader wijst de naald naar de achterkant van het hoofd.
- Wanneer de kleurstof zichtbaar is in de navelstreng ader, verwijder de naald en scheiden het embryo van de allantoïs steeltje (arteria umbilicalis en ader).
- Na de injecties, laat embryo in PBS te blijven bij kamertemperatuur gedurende 2-3 minuten, zodat de kleurstof circuleert de hele embryo.
2. Whole-mount analyse van de huid vasculatuur
- Na aftrek van de kleurstof te laten circuleren in de hele embryo, verwijder de huid monsters uit de regio's van de ledematen, rug en buik, etc. 8,9.
- Was de huid monster in koude PBS, en vast te stellen 4% PFA / PBS gedurende 2 uur 8,9. Was drie keer voor 10 minuten elk in 4 ml flacon met 2 ml heldere koude PBS.
- Plaats huid monster op een objectglaasje en voeg 100 ul van montage media om elke dia en een afdekglas.
- Laat dia's te drogen in een donkere opslagruimte.
- Ga verder met twee 'Image Acquisition' sectie Step.
3. Multi-color etikettering van thymus en hart bloedvaten en perivasculaire cellen voor vriescoupes (Vervolg van deel 1, Stap 7)
- Hele embryo 'Flash bevriezen' in vloeibare stikstof. Embryo's kunnen worden en bewaard bij -80 ° C tot analyse.
- Als alternatief, ontleden uit thymus, spoelen in 4 ° C PBS, en vast te stellen 2 ml 4% paraformaldehyde (PFA) / PBS gedurende 2 uur. Was drie keer gedurende 10 minuten in koud PBS, plaats thymi in oktober, en vries en bewaar tot gebruik bij -80 ° C.
- Voor cryosectioning, verspreid LGO op 'blok' een sectie en monteren van de embryo of ontleed organen / weefsels voor het snijden.
- Snijd bevroren weefsel in 10 urn dikke secties en het verzamelen van op dia's.
- Fix secties in aceton gedurende 5-10 minuten. Was drie keer in koude TBS.
- Blok in 10% ezel serum / TBS in een vochtige kamer bij kamertemperatuur.
- Incubeer profielen voor een uur 's nachts-met 100 ul van de primaire antilichamen in een vochtige kamer bij 4 ° C: In dit voorbeeld gebruiken we rat anti-muis-CD31 (1:100) naar label endotheel, en de geit anti-muis PDGFR-β (1:100) naar perivasculaire cellen label. Het is nuttig om dia's te dekken met een individueel gesneden Parafilm strips om ervoor te zorgen dat het antilichaam gelijkmatig is verdeeld over de sectie.
- Na incubatie met het primaire antilichaam, wassen secties 3 keer in koude TBS. Incubeer met 100 ul van een passende secundaire antilichamen gedurende 30 minuten minimum.
- Was drie keer in koude TBS. Voeg 100 ul van de montage media om elke dia en een afdekglas.
- Laat dia's te drogen in een donkere opslagruimte.
- Ga verder naar sectie 'Image Acquisition'.
4. Multi-color etikettering van thymus bloedvaten en perivasculaire cellen voor vibratome secties (Vervolg van deel 1, Stap 7)
- Ontleden van zwezerik kwabben van de embryo en spoel met koud PBS.
- Fix zwezerik in 4% PFA / PBS bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
- Wassen in PBS-Triton X (0,15%) drie keer, 10 minuten en plaats thymi in een kleine plastic cartridge en onder te dompelen in 4% low melt agarose / PBS (~ 4 ° C). De thymus moet in contact komen met de onderkant van de cartridge.
- Laat agarose stollen op ijs (3-5 minuten). Gebruik een scheermesje af te snijden overtollige agarose. Voeg lijm op de vibratome blokkeren en houden monster het blok.
- Voeg koude PBS aan vibratome waterbad tot het monster en het blad worden ondergedompeld.
- Ingestelde snelheid en amplitude (hoge amplitude en lage gemiddelde snelheid is ideaal voor zachte thymus secties). De amplitude moet worden verminderd als secties breken als gevolg van teveel onrust.
- Snijd 50 um secties.
- Met behulp van een penseel, verzamelen secties in een 24-wells microtiterplaat in koude PBS.
- Blok secties in 500 pi van 10% ezel serum in PBS-Triton X (0,15%) voor 30 minuten.
- Incubeer secties voor 8 uur 's nachts met primaire antilichaam, zoals anti-CD31 en anti-PDGFR-β, In een overdekte 24-wells microtiterplaat.
- Was drie keer in PBS-Triton X (0,15%) over een totaal van 8 uur bij 4 ° C.
- Blok secties in 10% ezel serum in PBS-Triton X (0,15%) voor 30 minuten.
- Incubeer secties voor 8 uur 's nachts bij 4 ° C met passende secundaire antilichamen.
- Was drie keer in PBS-Triton X (0,15%) over een totaal van 8 uur bij 4 ° C.
- Re-fix samples in 4% PFA / PBS gedurende 30 minuten op ijs.
- Was drie keer in PBS-Triton X (0,15%) meer dan 30 minuten op ijs.
- Uitdrogen monsters door een gegradeerde MeOH / PBS-Triton X-serie: 25% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH, en 100% MeOH in 10 minuten voor elke stap. Vervang de 100% MeOH met verse MeOH na 10 minuten en incubeer 1 uur bij kamertemperatuur.
- In een glazen container, mix Babb (benzylalcohol: Benzyl Benzoate) in een 1:2 verhouding. Combineer Babb met MeOH voor een uiteindelijke concentratie van 50% Babb en 50% MeOH. Incubeer het monster in Babb: MeOH gedurende 10-15 minuten.
- Transfer monster tot een glazen fles met 100% Babb en incubeer gedurende 10-15 minuten of tot gewist, bij kamertemperatuur.
- Vul depressie dia (0,7 mm diepte) met verse 100% Babb en overdracht monster aan de zijkant. Voeg afdekglas (nr. 1.5) en de afdichting met 2-3 lagen van de nagellak. Laat nagellak uit te harden in het donker bij kamertemperatuur, vervolgens monster bewaren bij 4 ° C.
Let op: Dia's moeten volledig worden voorafgaand aan de confocale beeldacquisitie verzegeld. Afbeeldingen moeten worden verworven binnen 12-24 uur, als fluorescerende kleurstoffen kunnen vervagen in Babb. - Ga verder naar sectie 'Image Acquisition'.
5. Beeldacquisitie
- Image 10 urn bevroren secties met een confocale microscoop met behulp van de Plan-Apochromat 20X/0.8 doelstelling (512 x 512 pixels) met 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B 4), 543 - en 633-nm laser lijnen.
- Acquire confocale z-secties van ganse berg huid en 50 um agarose ingebedde coupes met behulp van de Plan-Apochromat 10X/0.4 doelstelling (512 x 512 pixels) met 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B 4), 543 -, en 633-nm laser lijnen. Serial Z-profielen moeten achtereenvolgens worden verzameld op 1-micron voor de respectievelijke kanaal.
- Reconstrueren serial Z-profielen met behulp van Zeiss AxioVision 4.6 of andere software voor beeldanalyse.
6. Representatieve resultaten:
Efficiëntie-etikettering van de embryonale vasculatuur is van cruciaal belang voor de beoordeling van bloedvaten defecten in de embryonale muizen. Figuur 1 toont de specifieke kenmerken van E16.5 thymus bloedvaten (1A-B) en co-labeling met CD31 (1B), in aanvulling op kleuring van de rechter en linker ventrikel (1E-F), respectievelijk. De GSL I-isolectin B 4 protocol voor vriescoupes, zoals beschreven in de secties 1, 3 en 5 werd gebruikt in deze experimenten. Whole-mount etikettering van de huid bloedvat netwerk op E16.5 muizen, met behulp van protocollen beschreven in de secties 1, 2 en 5 is weergegeven in figuur 1C-D.
Figuur 1 Legend. FITC GSL I - isolectin B 4 gezichts-ader injecties in E16.5 muis embryo's. a. Cryosection van embryonale thymus na de injectie. b. samenvoegen van CD31 co-labeling met isolectin B 4. c. en d. Whole-mount van de embryonale bloedvaten de huid na de injectie. e. en f. Cryosection van de embryonale hart e. (rechts ventrikel) f. (linker ventrikel) na injectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Whole-mount en PECAM-1 (CD31) kleuring op de afdelingen zijn de conventionele methoden voor etikettering van het vaatstelsel in de embryonale muizen. Deze methoden vereisen het gebruik van directe en / of indirecte immunofluorescentie, en reinigingsmiddelen om de muis weefsel permeabilize. Dit blijkt een nogal tijdig proces. Hier hebben we in dienst FITC-dextran of isolectin B 4 gezicht ader injecties om direct het etiket van de embryonale vaatstelsel, zodat er geen vereiste voor antilichaam labeling stappen. Bovendien is deze methode kan de beoordeling van de functionele status van het vaatstelsel, als 'lekkende' fenotypes zal worden onthuld door deze methode, maar niet door conventionele antilichamen kleuringsmethoden.
We hebben gekeken naar de efficiëntie van deze techniek door het analyseren van delen van de embryonale thymus, en het hart, maar ook als hele bergen van de huid vasculatuur kort na het gezicht ader injecties. Daarnaast hebben we gekleurde thymus secties voor CD31 volgende FITC-dextran of isolectin B 4 injecties aan te tonen dat FITC specifiek embryonale vasculaire structuren labels. Daarom is FITC-dextran of isolectin B 4 gezicht ader injecties in embryo's kunnen worden gebruikt om een snelle beoordeling van vasculaire fenotypes in meerdere organen tijdens de ontwikkeling. Daarnaast is deze methode laat onderzoekers het bepalen van de specifieke tijd tijdens de ontwikkeling waarbij het perifere vaatstelsel embryonale verbinding met een orgaan van belang, via angiogenese. We hebben een antilichaam labeling protocol dat compatibel is met deze FITC-dextran of isolectin B 4 protocol. Met behulp van dit protocol, kan PDGFR-β, SMA-α, en andere antistoffen, die de structurele elementen van de bloedvaten label, worden gebruikt om nader te beoordelen van de aard van embryonale vasculaire defecten.
Belangrijk: Een kleurstof zoals Fast Green kan worden toegevoegd aan de FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B 4 oplossing om het mengsel te visualiseren als het wordt ingespoten in de ader gezicht. Kort na FITC-dextran injectie, kan de kleurstof worden waargenomen in de navelstreng ader en in de bloedvaten in de dooierzak en de placenta. Op dit punt moet de navelstreng worden verwijderd uit het embryo. In het geval dat kleurstof niet wordt gedetecteerd in de allantoïs steeltje (navelstreng slagader en ader), de techniek waarschijnlijk mislukt. Wij hebben geconstateerd dat als de naald niet direct invoeren van de gezichts-ader, FITC-dextran / fluoresceïne GSL een label - isolectin B 4 stapelt zich op in aangrenzende gebieden van het gezicht. We hebben ook geconstateerd dat FITC-dextran de hele vaatstelsel labels, terwijl GSL 1 - isolectin B 4 labels meest embryonale vasculaire structuren, maar ook niet-vasculaire cellen in de lever. Een fluorescentie-microscoop ontleden kan worden gebruikt om te testen of de injectie succesvol was.
Muizen
C57Bl6 / J muizen werden gekocht bij Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Embryo's werden gegenereerd via wild-type, getimed paringen. Experimenten werden goedgekeurd door de Universiteit van Institutional Animal Care van Georgië en gebruik Comite.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidie nummers R01AI055001 en R01AI082127 van NIAID naar NRM en SREB Proefschrift Fellowship Award aan JLB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD150S-1G | |
| Fluorescein labeled GSL 1 - isolectin B4 | Vector Laboratories | FL-1201 | |
| Fast Green | MP Biomedicals | 195178 | |
| PFA | Fluka | 76240 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Optimal Cutting Temperature Compound (O.C.T. | VWR international | 25608-930 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-33 | |
| Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| rat anti-mouse CD31, | BD Biosciences | 558736 | |
| goat anti-mouse PDGFR-β | R&D Systems | AF1042 | |
| donkey anti-rat CD31 Alexa 647 (Invitrogen) | Biolegend | 102516 | |
| donkey anti-goat Alexa 594 (Invitrogen) | Invitrogen | A11058 | |
| Triton X -100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Low melt agarose/PBS | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Methanol | Fisher Scientific | A413-4 | |
| Benzyl Alcohol | Acros Organics | 148390010 | |
| Benzyl Benzoate | Acros Organics | 105860010 | |
| Depression slides | Fisher Scientific | S175201 | |
| Fluorogel | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Cover Glass (22X22)-1.5 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 152222 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Micro dissecting forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | |
| Parafilm No. OM992 | Fisher Scientific | 13-374-16 | |
| 12 and 24 well microplates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
| Superfrost/PlusMicroscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 4mL clear vials | National Scientific Company | B7800-2 |
References
- Cuddihy, A. R. VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus. Blood. 113, 2723-2731 (2009).
- Muller, S. M. Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).
- Muller, S. M. Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus. J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).
- Foster, K. Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus. J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).
- Liu, C. Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization. Blood. 108, 2531-2539 (2006).
- Lavine, K. J. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice. J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Murphy, P. A. Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).
