Summary
यह लेख भ्रूण त्वचा और थाइमस रक्त वाहिकाओं की लेबलिंग के लिए एक विधि का वर्णन है.
Abstract
एक कार्यात्मक रक्त वाहिका नेटवर्क की स्थापना जीवोत्पत्ति का एक अनिवार्य हिस्सा है, और इष्टतम अंग समारोह के लिए आवश्यक है. उदाहरण के लिए, थाइमस उचित vasculature गठन और patterning में अंग और परिपक्व टी सेल परिधि करने के लिए बाहर निकलने में thymocyte प्रवेश के लिए आवश्यक है. thymus में रक्त वाहिकाओं के स्थानिक व्यवस्था स्थानीय microenvironment, अर्थात् thymic उपकला कोशिकाओं (टीईसी) से संकेतों पर निर्भर है. हाल ही में कई रिपोर्टों थाइमस रक्त वाहिका दोष 1,2 में इन संकेतों के परिणामों की है कि विघटन का सुझाव देते हैं. पिछले अध्ययनों से पता करने के लिए नवजात और वयस्क thymus vasculature 1,2 लेबल किया तकनीकों का वर्णन है. हम यहाँ भ्रूण thymus में रक्त वाहिकाओं की लेबलिंग के लिए एक तकनीक को प्रदर्शित करता है. चेहरे की नस इंजेक्शन और CD31 एंटीबॉडी धुंधला हो थाइमस va की पहचान करने के लिए इस विधि FITC dextran या Griffonia (Bandeiraea) का उपयोग मैं (1 isolectin 4 बी जीएसएल) Simplicifolia Lectin को जोड़ती हैscular संरचनाओं और PDGFR β thymic perivascular mesenchyme 3-5 लेबल. cryosections या vibratome वर्गों का उपयोग करने का विकल्प भी उपलब्ध है. इस प्रोटोकॉल थाइमस नाड़ी दोष, जो thymus रक्त वाहिनियों के गठन में टीईसी व्युत्पन्न अणुओं की भूमिका को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. विधि के रूप में पूरे vasculature लेबल, यह भी त्वचा और दिल 6-10 सहित भ्रूण भर में कई अंगों और ऊतकों में संवहनी नेटवर्क का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
1. Fluorescein dextran और मैं isolectin जीएसएल बी 4 चेहरे नस इंजेक्शन भ्रूण vasculature लेबल लेबल
- फास्फेट में FITC dextran (50ug/mL) तैयार खारा (पीबीएस) buffered या जीएसएल 1 - बी isolectin पीबीएस में (20ug/200uL) एक 1.5ml Eppendorf ट्यूब में और 4 37 गर्म सेल्सियस / ग्रीन पीबीएस समाधान FITC - dextran (कुल 1mL मात्रा) और स्टॉक 1.25mm फास्ट 180uL स्टॉक 1.25mm फास्ट 100uL / ग्रीन पीबीएस जीएसएल 1 जोड़ें - isolectin बी (कुल मात्रा 200uL) 4, इतना है कि समाधान है जाहिरा तौर पर नीले रंग की.
- E14.5 E18.5 भ्रूण और जर्दी थैली के साथ टुकड़े करना, अपरापोषिक डंठल (नाल की धमनी और नस) बरकरार जा.
- एक नई पेट्री डिश (60 x 15 मिमी) भ्रूण स्थानांतरण और पीबीएस में उन्हें कमरे के तापमान पर विसर्जित कर दिया.
- भ्रूण की स्थिति के लिए सिर / चेहरे की एक बाण के समान दृश्य प्रदान करते हैं. सूक्ष्म विदारक संदंश का उपयोग करने के लिए धीरे से सिर पर भ्रूण समझ.
- सुई का प्रयोग एक 30G, FITC-dextran 50uL (50ug/mL) या जीएसएल इंजेक्षन1 - बी isolectin चेहरे सिर के पीछे की ओर की ओर इशारा करते हुए सुई नस में 4 (20ug 200uL पीबीएस में).
- जब डाई नाल की शिरा में दिखाई देता है, सुई को हटाने और अपरापोषिक डंठल (नाल की धमनी और नस) से भ्रूण को अलग.
- इंजेक्शन के बाद भ्रूण पीबीएस में कमरे के तापमान पर इतना है कि डाई भ्रूण में circulates 2-3 मिनट के लिए रहने के लिए अनुमति देते हैं.
2. त्वचा vasculature की विश्लेषण पूरे माउंट
- डाई भ्रूण भर में प्रसारित करने की अनुमति के बाद अंगों के क्षेत्रों से त्वचा के नमूने निकालने के लिए, पीठ, और पेट, 8,9 आदि.
- ठंड पीबीएस में त्वचा नमूना धो, और 2 8,9 घंटे के लिए 4% / पीएफए पीबीएस में तय. 10 2ml ठंड पीबीएस के साथ 4ml स्पष्ट शीशी में प्रत्येक मिनट के लिए 3 बार धोएं.
- जगह एक माइक्रोस्कोप त्वचा नमूना स्लाइड और प्रत्येक स्लाइड और एक गिलास को कवर करने के लिए बढ़ते मीडिया के 100 μl जोड़ें.
- स्लाइड एक अंधेरे भंडारण क्षेत्र में शुष्क करने की अनुमति दें.
- पीचरण 2 'छवि अधिग्रहण' अनुभाग roceed.
3. Thymus और दिल vasculature और cryosections के लिए perivascular कोशिकाओं की लेबलिंग बहु रंग (1 धारा, चरण 7 से जारी)
- 'फ्लैश' फ्रीज तरल नाइट्रोजन में पूरे भ्रूण. भ्रूण और -80 डिग्री विश्लेषण जब तक सी संग्रहित किया जा सकता है.
- वैकल्पिक रूप से, थाइमस टुकड़े करना, 4 डिग्री सेल्सियस पीबीएस में कुल्ला, और 2 घंटे के लिए 2ml 4% (पीएफए) Paraformaldehyde / पीबीएस में तय. ठंड पीबीएस, अक्टूबर में जगह thymi, और फ्रीज और दुकान में 10 मिनट के लिए 3 बार -80 में उपयोग करें जब तक धो डिग्री सेल्सियस
- Cryosectioning के लिए, एक अनुभाग 'ब्लॉक' पर अक्टूबर फैला है और भ्रूण या सेक्शनिंग के लिए dissected अंगों / ऊतकों माउंट.
- 10 सुक्ष्ममापी मोटी वर्गों में जमे हुए ऊतक में कटौती और स्लाइड पर इकट्ठा.
- 5-10 मिनट के लिए एसीटोन में वर्गों फिक्स. ठंड टीबीएस में 3 बार धोएं.
- कमरे के तापमान पर नमी के चेंबर में 10% गधा / सीरम टीबीएस में ब्लॉक.
- प्राथमिक के 100 μl के साथ 1 घंटे रातोंरात के लिए वर्गों सेते4 में नमी के चेंबर में एंटीबॉडी ° C: इस उदाहरण में, हम चूहे CD31 विरोधी माउस (1:100) लेबल endothelium, और बकरी विरोधी माउस (1:100) PDGFR-β लिए perivascular कोशिकाओं लेबल का उपयोग करें. यह उपयोगी है करने के लिए व्यक्तिगत रूप से कटौती Parafilm स्ट्रिप्स के साथ स्लाइड को कवर करने के लिए सुनिश्चित करें कि एंटीबॉडी समान रूप से भाग में फैला हुआ है.
- प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन के बाद, वर्गों ठंडा टीबीएस में 3 बार धो लो. 30 मिनट न्यूनतम के लिए उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के 100 μl के साथ सेते हैं.
- ठंड टीबीएस में 3 बार धोएं. प्रत्येक स्लाइड और एक गिलास को कवर करने के लिए मीडिया के बढ़ते 100 μl जोड़ें.
- स्लाइड एक अंधेरे भंडारण क्षेत्र में शुष्क करने की अनुमति दें.
- 'छवि अधिग्रहण' अनुभाग के लिए आगे बढ़ें.
4. थाइमस vasculature और vibratome वर्गों के लिए perivascular कोशिकाओं की लेबलिंग बहु रंग (1 धारा, चरण 7 से जारी)
- भ्रूण से थाइमस lobes काटना और ठंड पीबीएस में कुल्ला.
- 4% / पीएफए पीबीएस में थाइमस 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर ठीकहै.
- पीबीएस - ट्राइटन (0.15%) एक्स 3 बार, 10 मिनट और एक छोटे से प्लास्टिक और 4 पिघल कम% में कारतूस डूब में जगह thymi में धो / agarose पीबीएस (~ 4 डिग्री सेल्सियस). थाइमस कारतूस के नीचे के साथ संपर्क में होना चाहिए.
- Agarose बर्फ (3-5 मिनट) पर जमना करने के लिए अनुमति दें. एक रेजर ब्लेड का प्रयोग करने से अतिरिक्त agarose कटौती. Vibratome ब्लॉक करने के लिए गोंद जोड़ें और ब्लॉक करने के लिए नमूना पालन करना.
- Vibratome पानी स्नान करने के लिए ठंड पीबीएस जोड़ें जब तक नमूना और ब्लेड डूब रहे हैं.
- गति और आयाम (उच्च आयाम और कम मध्यम गति नरम थाइमस वर्गों के लिए आदर्श है) सेट. आयाम अगर वर्गों अतिरिक्त आंदोलन के कारण को तोड़ने कम किया जाना चाहिए.
- 50 उम वर्गों में कटौती.
- एक तूलिका का प्रयोग, ठंड पीबीएस में एक 24-अच्छी तरह से microplate में वर्गों इकट्ठा.
- पीबीएस Triton 30 मिनट के लिए एक्स (0.15%) में 10% गधा सीरम के 500 μl में ब्लॉक वर्गों.
- 8 घंटे के लिए वर्गों विरोधी CD31 और विरोधी PDGFR-β के रूप में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ रात भर, सेतेएक कवर 24-अच्छी तरह से microplate में.
- पीबीएस Triton एक्स (0.15%) में 3 बार 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे की एक कुल धो
- पीबीएस Triton 30 मिनट के लिए एक्स (0.15%) में 10% गधा सीरम में ब्लॉक वर्गों.
- 8 घंटे के लिए 4 में रातोंरात वर्गों सेते डिग्री सेल्सियस उपयुक्त माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ.
- पीबीएस Triton एक्स (0.15%) में 3 बार 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे की एक कुल धो
- पुन तय नमूने 4% पीएफए / बर्फ पर 30 मिनट के लिए पीबीएस.
- पीबीएस Triton एक्स (0.15%) में बर्फ पर 30 मिनट से अधिक 3 बार धोएं.
- ओह 25%, 50% ओह, 75% ओह, और प्रत्येक चरण के लिए 10 मिनट में 100% ओह: वर्गीकृत ओह / पीबीएस - Triton एक्स श्रृंखला के माध्यम से नमूने निर्जलीकरण. 10 मिनट के बाद ताजा ओह के साथ 100% ओह बदलें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
- एक ग्लास कंटेनर में मिश्रण Babb (लोबान शराब लोबान Benzoate) एक 1:2 के अनुपात में. 50% Babb और 50% ओह ओह साथ एक अंतिम एकाग्रता के लिए Babb जुडा है. 10-15 मिनट के लिए ओह: Babb में नमूना सेते हैं.
- स्थानांतरण सा10-15 मिनट के लिए 100% Babb और सेते के साथ एक ग्लास कंटेनर mple या जब तक कमरे के तापमान पर मंजूरी दे दी है,.
- ताजा 100% Babb और पक्ष को हस्तांतरण नमूना के साथ अवसाद स्लाइड (0.7mm गहराई) भरें. कांच (1.5 सं) को कवर और नेल पॉलिश के 2-3 कोट के साथ सील जोड़ें. अंधेरे में कड़ा करने के लिए कमरे के तापमान पर पॉलिश नाखून की अनुमति दें, तो 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूना की दुकान
नोट: स्लाइड्स confocal छवि अधिग्रहण करने से पहले पूरी तरह सील चाहिए. छवियाँ 12-24 घंटे के भीतर प्राप्त किया जाना चाहिए, के रूप में फ्लोरोसेंट रंजक Babb में फीका कर सकते हैं. - 'छवि अधिग्रहण' अनुभाग के लिए आगे बढ़ें.
5. छवि अधिग्रहण
- छवि एक confocal खुर्दबीन योजना APOCHROMAT 20X/0.8 उद्देश्य (512 X 512 पिक्सल) के साथ 488 का उपयोग के साथ 10 जमी वर्गों सुक्ष्ममापी (1 FITC-dextran/GSL - isolectin 4 बी), 543, और 633 एनएम लेजर लाइनों.
- पूरे माउंट त्वचा और 50 सुक्ष्ममापी agarose एम्बेडेड वर्गों के confocal z-वर्गों योजना Apochroma मोल (1 FITC-dextran/GSL - 4 बी isolectin), 543, और 488 के साथ 633 एनएम लेजर लाइनों 10X/0.4 (512 X 512 पिक्सल) उद्देश्य टी. सीरियल Z वर्गों 1-माइक्रोन में क्रमिक रूप से प्रत्येक संबंधित चैनल के लिए एकत्र की.
- धारावाहिक फिर से संगठित Zeiss AxioVision 4.6 या अन्य छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर के Z वर्गों.
6. प्रतिनिधि परिणाम:
भ्रूण vasculature की कुशल लेबलिंग भ्रूण चूहों में रक्त वाहिका दोष का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है. चित्रा 1 E16.5 थाइमस रक्त वाहिकाओं के विशिष्ट लेबलिंग (1A-B) और CD31 (1 बी) के साथ सह लेबलिंग, सही और बाएँ ventricles (1E एफ) के धुंधला करने के लिए इसके अलावा में, क्रमशः से पता चलता है. जीएसएल के रूप में 1, 3 वर्गों में वर्णित cryosections, और 5 के लिए मैं isolectin बी 4 प्रोटोकॉल इन प्रयोगों में इस्तेमाल किया गया था. पूरे माउंट E16.5 चूहों पर त्वचा, रक्त वाहिका नेटवर्क की लेबलिंग, 1, 2 वर्गों में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, और 5 1C - डी चित्र में दिखाया गया है.
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चित्रा 1 लीजेंड. FITC जीएसएल मैं - isolectin बी 4 E16.5 माउस भ्रूण में चेहरे की नस इंजेक्शन. भ्रूण दिल ई के इंजेक्शन के बाद भ्रूण thymus की Cryosection. ख से isolectin 4 बी साथ CD31 सह लेबलिंग के मर्ज ग और घ भ्रूण त्वचा vasculature निम्नलिखित इंजेक्शन के पूरे माउंट. ई और च. Cryosection (सही. निलय च) (बाएं) निलय निम्नलिखित इंजेक्शन.
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Discussion
वर्गों पर धुंधला हो जाना पूरे माउंट और PECAM-1 (CD31) भ्रूण चूहों में vasculature लेबलिंग के लिए पारंपरिक तरीकों के हैं. इन तरीकों को प्रत्यक्ष और / या अप्रत्यक्ष immunofluorescence, और डिटर्जेंट का उपयोग माउस ऊतक permeabilize की आवश्यकता होती है. यह करने के लिए एक नहीं बल्कि समय पर प्रक्रिया साबित होता है. यहाँ, हम FITC dextran या isolectin बी 4 चेहरे नस इंजेक्शन सीधे भ्रूण vasculature लेबल करने के लिए, जिससे एंटीबॉडी लेबलिंग कदम के लिए आवश्यकता को नष्ट करने के लिए कार्यरत है. इसके अलावा, इस विधि vasculature की कार्यात्मक स्थिति के मूल्यांकन की अनुमति देता है, के रूप में 'टपकाया' phenotypes इस विधि से नहीं बल्कि पारंपरिक एंटीबॉडी धुंधला हो जाना तरीकों से पता चला जाएगा.
हम भ्रूण thymus, और दिल है, साथ ही चेहरे नस इंजेक्शन के बाद शीघ्र ही त्वचा vasculature की पूरी mounts के वर्गों का विश्लेषण करके इस तकनीक की क्षमता की पुष्टि की है. इसके अतिरिक्त, हम FITC dextr के बाद CD31 के लिए दाग थाइमस वर्गोंएक या isolectin बी 4 इंजेक्शन कि FITC प्रदर्शन के लिए विशेष रूप से भ्रूण संवहनी संरचनाओं लेबल. इसलिए FITC - dextran या isolectin बी 4 भ्रूण में चेहरे की नस इंजेक्शन के लिए तेजी से विकास भर में कई अंगों में संवहनी phenotypes का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. इसके अलावा, इस विधि शोधकर्ताओं विकास के दौरान विशिष्ट समय निर्धारित करने के लिए जो में परिधीय भ्रूण vasculature ब्याज का एक अंग को जोड़ता angiogenesis के माध्यम से की अनुमति देता है. हम एक एंटीबॉडी लेबलिंग प्रोटोकॉल है कि इस FITC dextran या isolectin बी 4 प्रोटोकॉल के साथ संगत है शामिल है. इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, PDGFR-β, SMA α, और अन्य एंटीबॉडी, जो रक्त वाहिकाओं के संरचनात्मक घटकों लेबल आगे भ्रूण नाड़ी दोषों की प्रकृति का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
महत्वपूर्ण नोट्स: फास्ट ग्रीन के रूप में इस तरह के एक डाई FITC-dextran/GSL 1 से जोड़ा जा सकता है - isolectin बी 4 समाधान के क्रम में के रूप में मैं यह मिश्रण कल्पनाचेहरे की नस में इंजेक्शन है. FITC - dextran इंजेक्शन के फौरन बाद, डाई जर्दी थैली और नाल भर नाल की शिरा में और रक्त वाहिकाओं में मनाया जा सकता है. इस बिंदु पर, गर्भनाल भ्रूण से हटाया जाना चाहिए. घटना है कि डाई अपरापोषिक डंठल में नहीं पता लगाया (नाल की धमनी और नस) में तकनीक की संभावना में विफल रहा है. हमने देखा है कि अगर सुई सीधे चेहरे नस में प्रवेश नहीं करता, FITC dextran / Fluorescein 1 जीएसएल लेबल - isolectin 4 बी चेहरे के आसन्न क्षेत्रों में जम जाता है. हम यह भी कहा है कि FITC - dextran पूरे vasculature लेबल, जबकि जीएसएल 1 - isolectin बी 4 सबसे भ्रूण संवहनी संरचनाओं लेबल, लेकिन यह भी जिगर में गैर संवहनी कोशिकाओं. एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन विदारक कि परीक्षण इंजेक्शन सफल रहा था के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
चूहे
C57BL6 / जम्मू चूहों जैक्सन प्रयोगशाला (बार हार्बर, इ) से खरीदे गए थे. भ्रूण जंगली टी के माध्यम से उत्पन्न किया गयाype, समय matings. प्रयोगों जॉर्जिया संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस काम अनुदान R01AI055001 और R01AI082127 NIAID से NRM और SREB निबंध फैलोशिप JLB पुरस्कार संख्या के द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD150S-1G | |
| Fluorescein labeled GSL 1 - isolectin B4 | Vector Laboratories | FL-1201 | |
| Fast Green | MP Biomedicals | 195178 | |
| PFA | Fluka | 76240 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Optimal Cutting Temperature Compound (O.C.T. | VWR international | 25608-930 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-33 | |
| Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| rat anti-mouse CD31, | BD Biosciences | 558736 | |
| goat anti-mouse PDGFR-β | R&D Systems | AF1042 | |
| donkey anti-rat CD31 Alexa 647 (Invitrogen) | Biolegend | 102516 | |
| donkey anti-goat Alexa 594 (Invitrogen) | Invitrogen | A11058 | |
| Triton X -100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Low melt agarose/PBS | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Methanol | Fisher Scientific | A413-4 | |
| Benzyl Alcohol | Acros Organics | 148390010 | |
| Benzyl Benzoate | Acros Organics | 105860010 | |
| Depression slides | Fisher Scientific | S175201 | |
| Fluorogel | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Cover Glass (22X22)-1.5 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 152222 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Micro dissecting forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | |
| Parafilm No. OM992 | Fisher Scientific | 13-374-16 | |
| 12 and 24 well microplates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
| Superfrost/PlusMicroscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 4mL clear vials | National Scientific Company | B7800-2 |
References
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