Summary
Este artigo descreve um método para a rotulagem de pele embrionária e vasos sanguíneos do timo.
Abstract
O estabelecimento de uma rede funcional dos vasos sanguíneos é uma parte essencial da organogênese, e é necessário para a função do órgão ideal. Por exemplo, na formação adequada vascularização do timo e padronização é essencial para a entrada timócito no órgão e saída de células T maduras para a periferia. O arranjo espacial dos vasos sanguíneos no timo é dependente de sinais a partir do microambiente local, ou seja, células epiteliais tímicas (TEC). Vários relatórios recentes sugerem que a interrupção desses resultados no timo sinais de sangue 1,2 defeitos navio. Estudos anteriores descreveram técnicas usadas para rotular os 1,2 vasculatura neonatal e adulto timo. Nós demonstramos aqui uma técnica para a rotulagem dos vasos sanguíneos no timo embrionárias. Este método combina o uso de FITC-dextran ou Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectina I (GSL 1 - isolectin B 4) injeções veia facial e coloração de anticorpos CD31 para identificar timo estruturas vasculares e PDGFR-β para rotular tímica perivascular mesênquima 3-5. A opção de usar ou seções criosecções vibratome também é fornecido. Este protocolo pode ser usado para identificar defeitos do timo vascular, que é crítico para a definição dos papéis dos TEC derivadas moléculas na formação do timo dos vasos sanguíneos. Como o método de rótulos toda a vasculatura, ele também pode ser usado para analisar as redes vascular em vários órgãos e tecidos em todo o embrião, incluindo pele e do coração 60-10.
Protocol
1. Fluoresceína rotulados dextran e GSL I-isolectin B 4 injeções veia facial para rotular vasculatura embrionárias
- Prepare FITC-dextran (50ug/mL) em tampão fosfato salino (PBS) ou GSL 1 - isolectin B 4 (20ug/200uL) em PBS em um tubo Eppendorf 1,5 ml e aquecer a 37 ° C. Adicionar 100uL de estoque 1,25 mM Fast Green / PBS para a solução FITC-dextran (volume total de 1ml) e 180uL de estoque 1,25 mM Fast Green / PBS a um GSL - isolectin B 4 (200uL volume total), de modo que a solução é visivelmente azul.
- E14.5-E18.5 dissecar embriões e saco vitelino juntos, deixando o talo alantóide (artéria e veia umbilical) intacta.
- Transferência de embriões para um prato novo Petrie (60 X 15 mm) e mergulha-as na PBS em temperatura ambiente.
- Posição do embrião para fornecer uma visão sagital da cabeça / face. Use uma pinça de dissecação micro suavemente para entender o embrião na cabeça.
- Usando uma agulha 30G, injetar 50uL FITC-dextran (50ug/mL) ou GSL 1 - isolectin B 4 (20ug em 200uL PBS) na veia facial apontando a agulha para a parte traseira da cabeça.
- Quando a tintura é visível na veia umbilical, retire a agulha e separar o embrião do talo alantóide (artéria e veia umbilical).
- Após as injeções, permitem embrião permanecer em PBS à temperatura ambiente por 2-3 minutos para que o corante circula por todo o embrião.
2. Todo-mount análise da vascularização da pele
- Depois de permitir que o corante para circular por todo o embrião, retire amostras de pele das regiões dos membros, costas e estômago, etc 8,9.
- Lavar amostra de pele no frio PBS, e fixar em 4% PFA / PBS por 2 horas 8,9. Lavar 3 vezes durante 10 minutos cada, em frasco com 2 ml clara 4mL frio PBS.
- Colocar a amostra de pele em um microscópio de slides e adicione 100 ml de montagem de mídia para cada slide e uma tampa de vidro.
- Permitir slides para secar em uma área de armazenamento.
- Vá para a Etapa seção "Aquisição de Imagem" 2.
3. Multi-cor rotulagem de timo e vascularização do coração e células perivascular para criosecções (Continue da Seção 1, Passo 7)
- Embrião 'Flash congelar "todo em nitrogênio líquido. Embriões podem ser e armazenadas a -80 ° C até a análise.
- Alternativamente, dissecar timo, enxágüe em 4 ° C PBS, e fixar em 2 mL paraformaldeído 4% (PFA) / PBS por 2 horas. Lavar 3 vezes durante 10 minutos no frio PBS, thymi lugar em outubro, e congelar e armazenar até usar a -80 ° C.
- Para cryosectioning, espalhados em outubro 'block' uma seção e montar o embrião ou órgãos dissecados / tecidos para corte.
- Corte de tecido congelado em 10 mM de espessura e recolher em slides.
- Fix seções em acetona por 5-10 minutos. Lavar 3 vezes em TBS frio.
- Bloco em 10% de soro de burro / TBS em uma câmara de umidade em temperatura ambiente.
- Incubar seções de 1 hora durante a noite com 100 ul de anticorpos primários em câmara úmida a 4 ° C: neste exemplo, usamos ratos anti-rato-CD31 (1:100) ao endotélio rótulo, e de cabra anti-rato PDGFR β- (1:100) para rotular as células perivascular. É útil para cobrir slides com tiras cortadas individualmente Parafilm para garantir que o anticorpo é uniformemente distribuídos em toda a seção.
- Após a incubação com o anticorpo primário, lave seções 3 vezes em TBS frio. Incube com 100 ul de anticorpos secundários apropriada por 30 minutos mínimo.
- Lavar 3 vezes em TBS frio. Adicione 100 ml de montagem de mídia para cada slide e uma tampa de vidro.
- Permitir slides para secar em uma área de armazenamento.
- Vá para a seção "Aquisição de Imagem".
4. Multi-cor rotulagem de timo vascularização e células perivascular para seções vibratome (Continue da Seção 1, Passo 7)
- Dissecar lobos do timo, do embrião e enxaguar em água fria PBS.
- Fix timo em 4% PFA / PBS em temperatura ambiente por 2 horas.
- Lavar em PBS-Triton X (0,15%) 3 vezes, 10 minutos e thymi lugar em um cartucho de plástico pequeno e submergir em 4% baixo derreter agarose / PBS (~ 4 ° C). Timo deve estar em contato com a parte inferior do cartucho.
- Permitir agarose para solidificar em gelo (3-5 minutos). Use uma lâmina de barbear para cortar o excesso de agarose. Adicionar cola no bloco vibratome e aderir ao bloco de amostra.
- Adicionar frio PBS para vibratome banho-maria até que a amostra ea lâmina estão imersos.
- Definir a velocidade e amplitude (amplitude de alta e baixa velocidade moderada é ideal para o soft seções timo). A amplitude deve ser reduzida se as seções quebrar devido à agitação em excesso.
- Corte de 50 seções um.
- Usando um pincel, recolher seções em uma microplaca de 24 poços no frio PBS.
- Seções de bloco em 500 l de soro de burro de 10% em PBS-Triton X (0,15%) por 30 minutos.
- Seções incubar por 8 horas durante a noite com o anticorpo primário, tais como anti-CD31 e anti-PDGFR-β, Em uma coberta de microplacas de 24 poços.
- Lavar 3 vezes em PBS-Triton X (0,15%) sobre um total de 8 horas a 4 ° C.
- Seções de bloco no soro de burro de 10% em PBS-Triton X (0,15%) por 30 minutos.
- Incubar seções de oito horas durante a noite a 4 ° C com anticorpos secundários apropriado.
- Lavar 3 vezes em PBS-Triton X (0,15%) sobre um total de 8 horas a 4 ° C.
- Re-fix amostras em PFA 4% / PBS por 30 minutos no gelo.
- Lavar 3 vezes em PBS-Triton X (0,15%) mais de 30 minutos no gelo.
- Desidratar as amostras através de um classificado MeOH / PBS-Triton X série: 25% MeOH, MeOH 50%, 75% MeOH, MeOH e 100% menos 10 minutos para cada etapa. Substituir MeOH 100% com MeOH fresco depois de 10 minutos e incubar por 1 hora em temperatura ambiente.
- Em um recipiente de vidro, misture Babb (Benzyl Álcool: benzoato de benzila) em uma proporção de 1:2. Combine Babb com MeOH para uma concentração final de Babb 50% e MeOH 50%. Incubar a amostra em Babb: MeOH por 10-15 minutos.
- Transferência da amostra para um recipiente de vidro com 100% de Babb e incubar por 10-15 minutos ou até eliminado, em temperatura ambiente.
- Preencha deslize depressão (0,7 milímetros de profundidade) com Babb 100% frescos e de transferência de amostra para o lado. Adicionar tampa de vidro (n º 1.5) e selar com 2-3 camadas de unha polonês. Permitir unha polonês para endurecer no escuro à temperatura ambiente, em seguida, armazenar amostras a 4 ° C.
Nota: Os slides devem ser completamente selados antes da aquisição da imagem confocal. As imagens devem ser adquiridas dentro de 12-24 horas, como corantes fluorescentes podem desaparecer em Babb. - Vá para a seção "Aquisição de Imagem".
5. Aquisição de imagem
- Imagem 10 mM cortes congelados com um microscópio confocal utilizando o Plano de Apochromat-20X/0.8 objetivo (512 X 512 pixels) com 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B 4), 543 -, e as linhas 633-nm laser.
- Adquirir confocal z-seções da pele montagem inteira e 50 mm de agarose-embedded seções usando o Plano Apochromat-10X/0.4 objetivo (512 X 512 pixels) com 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B 4), 543 -, e 633 nm linhas laser. Série Z-seções devem ser coletadas sequencialmente em 1-micron para cada respectivo canal.
- Reconstruir série Z-seções usando Zeiss Axiovision 4.6 ou software de análise de imagem.
6. Resultados representativos:
Rotulagem eficiente da vasculatura embrionárias é fundamental para avaliar os defeitos dos vasos sanguíneos em ratos embrionárias. A Figura 1 mostra a rotulagem específica de E16.5 vasos sanguíneos timo (1A-B) e co-rotulagem com CD31 (1B), além da coloração dos ventrículos direito e esquerdo (1E-F), respectivamente. A GSL I-B 4 isolectin protocolo para criosecções conforme descrito nas seções 1, 3 e 5 foi usado nesses experimentos. Todo-mount rotulagem da rede navio pele sangue em ratos E16.5, utilizando os protocolos descritos nos pontos 1, 2 e 5 é mostrado na Figura 1C-D.
Figura 1 Legend. FITC GSL I - isolectin B 4 injeções em veia facial E16.5 embriões de camundongos. a. Cryosection do timo embrionárias após a injecção. b. direta de CD31 co-rotulagem com B isolectin 4. c. e d. Whole-mount da injeção embrionárias da pele vasculatura seguinte. e. e f. Cryosection embrionárias de coração e. (à direita ventrículo) f. (ventrículo esquerdo) após a injecção.
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Discussion
Todo o monte e PECAM-1 (CD31) coloração em cortes são os métodos convencionais para a rotulagem da vasculatura embrionárias em camundongos. Estes métodos requerem o uso de imunofluorescência direta e / ou indireta, e detergentes para permeabilizar o tecido mouse. Isso prova a ser um processo bastante oportuna. Aqui, nós empregamos FITC-dextran ou isolectin B 4 injeções veia facial diretamente rótulo a vasculatura embrionárias, eliminando a exigência de rotulagem passos de anticorpos. Além disso, este método permite a avaliação do estado funcional da vasculatura, como 'fuga' fenótipos será revelado por este método, mas não por métodos de coloração convencional de anticorpos.
Temos validado a eficiência desta técnica através da análise de seções timo embrionárias, e seu coração, bem como monta toda a vasculatura da pele logo após injeções veia facial. Além disso, temos manchado seções timo para CD31 seguintes FITC-dextran ou B isolectin 4 injeções para demonstrar que FITC especificamente rótulos embrionárias estruturas vasculares. Portanto FITC-dextran ou isolectin B 4 injeções veia facial em embriões podem ser utilizados para avaliar rapidamente fenótipos vasculares em vários órgãos ao longo do desenvolvimento. Além disso, este método permite aos pesquisadores determinar o tempo específico durante o desenvolvimento em que a vasculatura periférica embrionárias se conecta a um órgão de interesse, através de angiogênese. Nós incluímos um protocolo de rotulagem anticorpo que é compatível com esta FITC-dextran ou B isolectin quatro protocolo. Usando este protocolo, PDGFR β, α-SMA, e de outros anticorpos, que rótulo componentes estruturais dos vasos sanguíneos, podem ser empregadas para avaliar a natureza do embrião defeitos vascular.
Notas importantes: Um corante, como Verde Rápido pode ser adicionado ao 1 FITC-dextran/GSL - isolectin B 4 A solução para visualizar a mistura como é injetado na veia facial. Pouco depois de FITC-dextran injeção, o corante pode ser observado na veia umbilical e em vasos sanguíneos em todo o saco vitelino e da placenta. Neste ponto, o cordão umbilical deve ser removida do embrião. No caso de corante não é detectado no talo alantóide (artéria e veia umbilical) a técnica provavelmente falhou. Temos observado que, se a agulha não entrar diretamente na veia facial, FITC-dextran / Fluorescein rotulados GSL 1 - isolectin B 4 se acumula em áreas adjacentes da face. Temos observado também que FITC-dextran rótulos toda a vasculatura, enquanto GSL 1 - isolectin B 4 marcas mais embrionárias estruturas vasculares, mas também não-vascular células do fígado. Um microscópio de fluorescência de dissecação pode ser usado para testar se a injeção foi bem sucedida.
Camundongos
Camundongos C57BL6 / J foram comprados a partir de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Embriões foram gerados através de tipo selvagem, acasalamentos cronometrados. Experimentos foram aprovados pela University of Care da Geórgia animal Institucional e Comitê Use.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por números conceder R01AI055001 e R01AI082127 de NIAID a NRM e Award Fellowship SREB Dissertação de JLB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD150S-1G | |
| Fluorescein labeled GSL 1 - isolectin B4 | Vector Laboratories | FL-1201 | |
| Fast Green | MP Biomedicals | 195178 | |
| PFA | Fluka | 76240 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Optimal Cutting Temperature Compound (O.C.T. | VWR international | 25608-930 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-33 | |
| Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| rat anti-mouse CD31, | BD Biosciences | 558736 | |
| goat anti-mouse PDGFR-β | R&D Systems | AF1042 | |
| donkey anti-rat CD31 Alexa 647 (Invitrogen) | Biolegend | 102516 | |
| donkey anti-goat Alexa 594 (Invitrogen) | Invitrogen | A11058 | |
| Triton X -100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Low melt agarose/PBS | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Methanol | Fisher Scientific | A413-4 | |
| Benzyl Alcohol | Acros Organics | 148390010 | |
| Benzyl Benzoate | Acros Organics | 105860010 | |
| Depression slides | Fisher Scientific | S175201 | |
| Fluorogel | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Cover Glass (22X22)-1.5 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 152222 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Micro dissecting forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | |
| Parafilm No. OM992 | Fisher Scientific | 13-374-16 | |
| 12 and 24 well microplates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
| Superfrost/PlusMicroscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 4mL clear vials | National Scientific Company | B7800-2 |
References
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