Summary
В этой статье описывается метод для маркировки эмбрионального тимуса кожи и кровеносных сосудов.
Abstract
Создание функциональной сети кровеносных сосудов является неотъемлемой частью органогенеза, и необходим для оптимального функционирования органа. Например, в тимусе правильного формирования сосудистой и структурирование имеет важное значение для тимоцитов вступления в органе и зрелых Т-клеток с выходом на периферию. Пространственное расположение кровеносных сосудов в вилочковой железе зависит от сигналов от местных микросреды, а именно эпителиальных клеток тимуса (TEC). Некоторые недавние сообщения предполагают, что нарушение этих сигналов приводит к тимус 1,2 кровеносного сосуда дефектов. Предыдущие исследования описаны методы, используемые для обозначения новорожденных и взрослых тимуса сосудистой 1,2. Мы демонстрируем здесь технику для маркировки кровеносных сосудов в эмбриональный тимус. Этот метод сочетает в себе использование FITC-декстран или Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Лектин I (GSL 1 - isolectin B 4) лица инъекции вену и CD31 антител окрашивания для выявления сосудистых структур тимуса и PDGFR-β для обозначения тимуса периваскулярных мезенхимы 3-5. Возможность использования cryosections или vibratome разделы также предоставляется. Этот протокол может быть использован для идентификации тимуса сосудистых дефектов, которое имеет решающее значение для определения роли TEC полученных молекул в тимусе образование кровеносных сосудов. Как метод этикетках всей сосудистой сети, он также может быть использована для анализа сосудистой сети в различных органах и тканях по всему эмбриона в том числе кожи и сердца 6-10.
Protocol
1. Fluorescein помечены декстрана и GSL I-isolectin B 4 лица инъекции вену для обозначения эмбрионального сосудистую
- Подготовка FITC-декстрана (50ug/mL) в фосфатно-солевым буфером (PBS) или GSL 1 - isolectin B 4 (20ug/200uL) в PBS в 1,5 мл пробирку Эппендорфа и теплой до 37 ° C. Добавить 100 мкл акций 1,25 мм Быстрый зеленый / PBS для FITC-декстран решение (общий объем 1 мл) и 180uL акций 1,25 мм Быстрый зеленый / PBS, чтобы GSL 1 - isolectin B 4 (всего 200uL объем), так что решение заметно синий.
- Рассеките E14.5-E18.5 эмбриона и желточного мешка вместе, оставив аллантоисных стебля (пупочной артерии и вены) без изменений.
- Трансфер эмбрионов на блюде новый Петри (60 X 15 мм) и погрузить их в PBS при комнатной температуре.
- Позиция эмбриона обеспечить сагиттальной зрения головы / лица. Использование микро рассекает пинцетом аккуратно понять эмбриона на голову.
- Использование 30G иглу, вводят 50uL FITC-декстрана (50ug/mL) или GSL 1 - isolectin B 4 (20ug в 200uL PBS) в лице вену иглу указывая в направлении задней части головы.
- Когда краска видна в пупочной вены, удалить иглу и отдельных эмбриона от аллантоисных стебля (пупочной артерии и вены).
- После инъекции, позволяющие эмбриона остаться в PBS при комнатной температуре в течение 2-3 минут, так что краситель циркулирует по всему эмбриону.
2. Всего монтажа анализ кожи сосудистую
- После учета красителя циркулируют по всему эмбриона, удалять образцы кожи из регионов конечностей, спины и живота, и т.д. 8,9.
- Промыть образец кожи в холодное PBS, и зафиксировать в 4% PFA / PBS в течение 2 часов 8,9. Промыть 3 раза по 10 минут каждый в 4 мл ясно флакон с 2 мл холодного PBS.
- Место образец кожи на предметное стекло и добавляют 100 мкл монтаж средств массовой информации к каждому слайду и покровного стекла.
- Разрешить слайды сушить в темном месте хранения.
- Перейдите к шагу разделе "Image Acquisition '2.
3. Многоцветный маркировки тимуса и сердца сосуды и периваскулярные клетки для cryosections (Continue из раздела 1, шаг 7)
- Весь 'Flash заморозить »эмбриона в жидком азоте. Эмбрионы могут быть и хранили при температуре -80 ° С до анализа.
- Кроме того, рассекать из тимуса, промыть в 4 ° C PBS, и исправить в 2 мл 4% Параформальдегид (PFA) / PBS в течение 2 часов. Промыть 3 раза в течение 10 минут в холодной PBS, место thymi в октябре, и заморозить и хранить до использования при -80 ° C.
- Для cryosectioning, распространение октября на "блок" раздел и смонтировать эмбриона или расчлененные органов / тканей для секционирования.
- Вырезать замороженной ткани в 10 мкм разделы и собирать на слайдах.
- Fix разделы в ацетоне в течение 5-10 минут. Промыть 3 раза в холодной TBS.
- Блок в 10% сыворотки осла / TBS в камере влажности при комнатной температуре.
- Инкубируйте разделы в течение 1 часа, в течение ночи с 100 мкл первичных антител в камере влажности при температуре 4 ° C: в этом примере мы используем крысе анти-CD31 мыши (1:100) для обозначения эндотелия и антимышиного PDGFR-β (1:100) для обозначения периваскулярных клеток. Это полезно для покрытия слайдов с индивидуально нарезанные длинные парафильмом для того, чтобы антитела, равномерно распределены по разделу.
- После инкубации с первичными антителами, мыть разделах 3 раза в холодной TBS. Инкубируйте 100 мкл соответствующих вторичными антителами в течение 30 минут минимум.
- Промыть 3 раза в холодной TBS. Добавить 100 мкл монтаж средств массовой информации к каждому слайду и покровного стекла.
- Разрешить слайды сушить в темном месте хранения.
- Переходите к разделу 'Image Acquisition.
4. Многоцветный маркировки тимуса сосуды и периваскулярные клетки для vibratome разделах (Continue из раздела 1, шаг 7)
- Рассеките из тимуса долях от эмбриона и промыть в холодной PBS.
- Fix вилочковой железы в 4% PFA / PBS при комнатной температуре в течение 2 часов.
- Стирать в PBS-Triton X (0,15%) 3 раза, 10 минут и место thymi в небольшой пластиковый картридж и погрузить в 4% агарозном низкой расплава / PBS (~ 4 ° С). Вилочковой железы должно быть в контакте с нижней части картриджа.
- Разрешить агарозном закрепить на льду (3-5 минут). Используйте лезвие, чтобы отрезать избыточного агарозы. Добавить клей vibratome блоков и придерживаться образца блока.
- Добавить холодным ФСБ в водяной бане, пока vibratome образца и лезвия погружаются.
- Установить скорость и амплитуду (большой амплитудой и низкой средней скоростью идеально подходит для мягкой тимуса разделы). Амплитуда должна быть уменьшена, если разделы разбить из-за лишнего волнения.
- Вырезать 50 мкм разделов.
- Использование кисти, собирать секции в 24-ю лунками в холодном PBS.
- Блок секций в 500 мкл 10% осла сыворотки в PBS-Triton X (0,15%) в течение 30 минут.
- Инкубируйте разделы в течение 8 часов в ночь с первичным антителом, таких как анти-CD31 и анти-PDGFR-β, В закрытой 24-ю лунками.
- Промыть 3 раза PBS-Triton X (0,15%) по сравнению с всего 8 часов при температуре 4 ° C.
- Блок секций в 10% осла сыворотки в PBS-Triton X (0,15%) в течение 30 минут.
- Инкубируйте разделы в течение 8 часов в течение ночи при 4 ° С с соответствующими вторичными антителами.
- Промыть 3 раза PBS-Triton X (0,15%) по сравнению с всего 8 часов при температуре 4 ° C.
- Повторное исправление образцов в 4% PFA / PBS в течение 30 минут на льду.
- Промыть 3 раза PBS-Triton X (0,15%) в течение 30 минут на льду.
- Дегидрировать образцы через градуированные MeOH / ПБС-Тритон Х серии: 25% метанола, 50% метанола, 75% метанола и 100% метанола на 10 минут для каждого шага. Замените 100% метанола со свежим метанолом через 10 минут и выдержать в течение 1 часа при комнатной температуре.
- В стеклянном контейнере, смешайте Babb (бензиловый спирт: бензил бензоат) в соотношении 1:2. Комбинат Babb с метанолом для конечной концентрации 50% Babb и 50% метанола. Инкубируйте образца в Babb: MeOH в течение 10-15 минут.
- Передача образца стеклянный контейнер с 100% Babb и инкубировать в течение 10-15 минут или пока не рассеялся, при комнатной температуре.
- Заполните депрессии слайд (0,7 мм глубины) со свежим 100% Babb и передачи образцов в сторону. Добавить покровного стекла (№ 1,5) и печать с 2-3 слоя лака для ногтей. Разрешить лак для ногтей, чтобы укрепиться в темноте при комнатной температуре, затем хранить образцы при температуре 4 ° C.
Примечание: Слайды должны быть полностью запечатаны до конфокальной захвата изображений. Изображения должны быть приобретены в течение 12-24 часов, а флуоресцентные красители могут исчезать в Babb. - Переходите к разделу 'Image Acquisition.
5. Image Acquisition
- Изображение 10 мкм замороженных срезов с использованием конфокальной микроскопии План-Apochromat 20X/0.8 цель (512 х 512 пикселей) с 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B 4), 543 - и 633-нм линий лазера.
- Приобретать конфокальной г-сечения всей кожей монтировать и 50 мкм агарозном-срезы использования План-Apochromat 10X/0.4 цель (512 х 512 пикселей) с 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B 4), 543 -, и 633-нм линий. Последовательный Z-разделы должны быть собраны последовательно на 1-микронных для каждого соответствующего канала.
- Реконструкция серийный Z-разделы, используя Zeiss AxioVision 4.6 или другого программного обеспечения для анализа изображений.
6. Представитель Результаты:
Эффективная маркировка эмбриональных сосудистой имеет решающее значение для оценки дефектов кровеносных сосудов в эмбриональный мышей. На рисунке 1 показаны конкретные маркировки E16.5 тимуса кровеносных сосудов (1А-Б) и со-маркировки с CD31 (1B), в дополнение к окрашивание правого и левого желудочков (1E-F), соответственно. GSL I-isolectin B 4 протокола для cryosections, как описано в разделах 1, 3 и 5 был использован в этих экспериментах. Всего монтажа маркировка судна кожи кровью сети на E16.5 мышей, с использованием протоколов, описанных в разделах 1, 2 и 5 показан на рисунке 1С-D.
Рисунок 1 Legend. FITC GSL Я - isolectin B 4 лица инъекции вены в E16.5 эмбрионов мыши. a. Cryosection эмбрионального тимуса после инъекции. b. Слияние CD31 совместно маркировки с isolectin В 4. c. и d. Всего монтажа эмбриональной кожи сосудистую после инъекции. e. и f. Cryosection эмбрионального сердца e. (справа желудочка) f. (левый желудочек) после инъекции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Всего монтажа и PECAM-1 (CD31) пятен на разделы обычных методов маркировки сосудистую в эмбриональных мышей. Эти методы требуют использования прямых и / или непрямой иммунофлюоресценции, а также моющие средства permeabilize мыши ткани. Это оказывается весьма своевременным процесса. Здесь мы использовали FITC-декстран или isolectin B 4 лица инъекции вену непосредственно этикетке эмбриональной сосудистой сети, тем самым устраняя потребность в шагах антител маркировки. Кроме того, этот метод позволяет оценить функциональное состояние сосудистой сети, как «вытекающих» фенотипы будут выявлены с помощью этого метода, но не с помощью традиционных методов окрашивания антителами.
Мы проверили эффективность этого метода, анализируя разделы эмбриональных тимус, и сердце, а также тотальных кожи сосудистую вскоре после того, лица инъекции вену. Кроме того, мы запятнали тимуса разделы для CD31 следующие FITC-декстран или isolectin B 4 инъекции, чтобы продемонстрировать, что FITC специально этикетки эмбриональных сосудистых структур. Поэтому FITC-декстран или isolectin B 4 лица инъекции вену эмбрионы могут быть использованы для быстрой оценки сосудистой фенотипы в различных органах на протяжении развития. Кроме того, этот метод позволяет исследователям определить конкретное время в процессе разработки, в которых периферической сосудистой эмбриональных соединяется с органом интерес, через ангиогенез. Мы включили протокол антител маркировки, совместимого с этой FITC-декстран или isolectin B 4 протокола. Используя этот протокол, PDGFR-β, SMA-α, а также другие антитела, которые этикетке структурных компонентов кровеносных сосудов, могут быть использованы для дальнейшей оценки характера эмбриональных сосудистых дефектов.
Важные замечания: красителей, таких как Быстрый зеленый могут быть добавлены в FITC-dextran/GSL 1 - isolectin B 4 решения для визуализации смеси, как это вводится в вену лица. Вскоре после FITC-декстран инъекции, красителей можно наблюдать в пупочной вене и в кровеносные сосуды во всем желточного мешка и плаценты. На данный момент, пуповина должна быть удалена из эмбриона. В случае, если краска не обнаружен в аллантоисной стебля (пупочной артерии и вены) техникой вероятно, не удалось. Мы заметили, что если игла не напрямую ввести лицевой вены, FITC-декстран / Fluorescein помечены GSL 1 - isolectin B 4 накапливается в смежных областях лица. Мы также отметили, что FITC-декстран этикетках всей сосудистой сети, в то время как GSL 1 - isolectin B 4 этикетки самых эмбриональных сосудистых структур, но и не-сосудистых клеток в печени. Флуоресценции-рассекает микроскоп может быть использован для тестирования ли инъекция была успешной.
Мыши
C57Bl6 / J мышей были приобретены у лаборатории Джексона (Bar Harbor, ME). Эмбрионы были получены с помощью дикого типа, приуроченная вязки. Эксперименты были одобрены университетом Институциональные животных Грузии уходу и использованию комитета.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке гранта по номерам R01AI055001 и R01AI082127 из NIAID на NRM и SREB диссертации стипендий награду JLB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD150S-1G | |
| Fluorescein labeled GSL 1 - isolectin B4 | Vector Laboratories | FL-1201 | |
| Fast Green | MP Biomedicals | 195178 | |
| PFA | Fluka | 76240 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Optimal Cutting Temperature Compound (O.C.T. | VWR international | 25608-930 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-33 | |
| Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| rat anti-mouse CD31, | BD Biosciences | 558736 | |
| goat anti-mouse PDGFR-β | R&D Systems | AF1042 | |
| donkey anti-rat CD31 Alexa 647 (Invitrogen) | Biolegend | 102516 | |
| donkey anti-goat Alexa 594 (Invitrogen) | Invitrogen | A11058 | |
| Triton X -100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Low melt agarose/PBS | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Methanol | Fisher Scientific | A413-4 | |
| Benzyl Alcohol | Acros Organics | 148390010 | |
| Benzyl Benzoate | Acros Organics | 105860010 | |
| Depression slides | Fisher Scientific | S175201 | |
| Fluorogel | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Cover Glass (22X22)-1.5 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 152222 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Micro dissecting forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | |
| Parafilm No. OM992 | Fisher Scientific | 13-374-16 | |
| 12 and 24 well microplates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
| Superfrost/PlusMicroscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 4mL clear vials | National Scientific Company | B7800-2 |
References
- Cuddihy, A. R. VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus. Blood. 113, 2723-2731 (2009).
- Muller, S. M. Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).
- Muller, S. M. Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus. J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).
- Foster, K. Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus. J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).
- Liu, C. Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization. Blood. 108, 2531-2539 (2006).
- Lavine, K. J. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice. J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Murphy, P. A. Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).
