Summary
En este artículo se describe un método para el etiquetado de la piel embrionaria y los vasos sanguíneos del timo.
Abstract
El establecimiento de una red de vasos sanguíneos funcionales es una parte esencial de la organogénesis, y es necesario para la función del órgano óptimo. Por ejemplo, en la formación de la vasculatura del timo y el patrón adecuado es esencial para la entrada en el órgano de timocitos y células T maduras salida a la periferia. La disposición espacial de los vasos sanguíneos en el timo depende de señales del microambiente local, es decir, las células epiteliales del timo (TEC). Varios informes recientes sugieren que la interrupción de las señales de estos resultados en un recipiente de 1,2 defectos timo sangre. Estudios previos han descrito técnicas que se utilizan para etiquetar los 1,2 timo vasculatura neonatal y de adultos. Se demuestra aquí una técnica para el etiquetado de los vasos sanguíneos en el timo embrionario. Este método combina el uso de FITC-dextrano o Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lectina I (GSL 1 - isolectina B 4) inyecciones faciales vena y CD31 tinción de anticuerpos para identificar las estructuras vasculares del timo y PDGFR-β a la etiqueta del timo mesénquima perivascular 3-5. La opción de utilizar cryosections o secciones vibratome también se proporciona. Este protocolo se puede utilizar para identificar el timo defectos vasculares, lo cual es crítico para la definición de los roles de TEC-moléculas derivadas del timo en la formación de vasos sanguíneos. Como el método de las etiquetas de todo el sistema vascular, también puede ser utilizado para analizar las redes vasculares en múltiples órganos y tejidos en todo el embrión, incluyendo la piel y el corazón de 6-10.
Protocol
1. Fluoresceína dextrano y GSL I-isolectina B 4 inyecciones vena facial para etiquetar vasculatura embrionaria
- Prepare FITC-dextrano (50ug/mL) en tampón fosfato salino (PBS) o GSL 1 - isolectina B 4 (20ug/200uL) en PBS en un tubo Eppendorf 1,5 ml y calentar a 37 º C. Añadir 100uL de acciones de 1,25 Fast Green / PBS a la solución de FITC-dextrano (volumen total de 1 ml) y 180uL de acciones de 1,25 Fast Green / PBS a la GSL 1 - isolectina B 4 (200uL volumen total), por lo que la solución es visiblemente azul.
- Diseccionar E14.5 E18.5-embriones y el saco vitelino juntos, dejando el tallo alantoideo (arteria y vena umbilical) se mantienen intactas.
- Transferencia de embriones a un nuevo plato de petri (60 x 15 mm) y sumérgelas en PBS a temperatura ambiente.
- La posición del embrión para proporcionar una vista sagital de la cabeza / cara. El uso de micro pinza de disección para agarrar suavemente el embrión en la cabeza.
- Utilizando una aguja 30G, se inyectan 50 ul FITC-dextrano (50ug/mL) o GSL 1 - isolectina B 4 (20ug en 200uL PBS) en la vena facial, apuntando la aguja hacia la parte posterior de la cabeza.
- Cuando el medio de contraste es visible en la vena umbilical, retire la aguja y por separado el embrión del tallo alantoideo (arteria umbilical y la vena).
- Después de las inyecciones, permiten embrión a permanecer en PBS a temperatura ambiente durante 2-3 minutos para que el colorante circula por todo el embrión.
2. Todo el montaje análisis de la vascularización cutánea
- Después de permitir que el medio de contraste a circular por todo el embrión, extraer muestras de la piel de las regiones de las extremidades, espalda y estómago, etc 8,9.
- Lavar la piel de la muestra en PBS frío, y fijar en el 4% PFA / PBS durante 2 horas 8,9. Lavar 3 veces durante 10 minutos cada uno en un vial de 4 ml claro con 2 ml de PBS frío.
- Coloque la muestra de piel en un microscopio de diapositivas y añadir 100 ml de montaje de los medios de comunicación en cada diapositiva y una cubierta de vidrio.
- Permitir que se sequen en un área de almacenamiento en la oscuridad.
- Continúe con el Paso sección 'Adquisición de imágenes "2.
3. Multi-color etiquetado de timo y los vasos sanguíneos del corazón y las células perivasculares de cryosections (Continúa de la Sección 1, Paso 7)
- Embrión de todo 'Flash congelar en nitrógeno líquido. Los embriones se pueden y se almacenan a -80 ° C hasta su análisis.
- Por otra parte, diseccionar el timo, el enjuague en PBS 4 ° C, y fijar en 2 ml de paraformaldehído al 4% (PFA) / PBS durante 2 horas. Lavar 3 veces durante 10 minutos en PBS frío, lugar thymi en octubre, y congelar y almacenar hasta su uso a -80 ° C.
- Para muestras criostáticas, se extendió en octubre 'block' y una sección de montaje en el embrión o los órganos diseccionados / tejidos para el corte.
- Cortar el tejido congelado en 10 micras de espesor y se acumulan en las diapositivas.
- Fix secciones en acetona durante 5-10 minutos. Lavar 3 veces en TBS frío.
- Bloque en el burro 10% de suero / TBS en una cámara húmeda a temperatura ambiente.
- Incubar las secciones de una hora durante la noche-con 100 l de anticuerpos primarios en una cámara húmeda a 4 ° C: en este ejemplo, el uso de rata anti-CD31 de ratón (1:100) al endotelio etiqueta, y de cabra anti-ratón PDGFR-β (1:100) para marcar a las células perivasculares. Es útil para cubrir las diapositivas individualmente cortar tiras Parafilm para asegurarse de que el anticuerpo se extienda uniformemente por toda la sección.
- Después de la incubación con el anticuerpo primario, lave las secciones 3 veces en TBS frío. Incubar con 100 l de anticuerpos secundarios apropiados durante 30 minutos como mínimo.
- Lavar 3 veces en TBS frío. Añadir 100 ml de montaje de los medios de comunicación en cada diapositiva y una cubierta de vidrio.
- Permitir que se sequen en un área de almacenamiento en la oscuridad.
- Pase a la sección 'Adquisición de imágenes ".
4. Multi-color de etiquetado de la vasculatura del timo y células perivasculares de las secciones vibratome (Continúa de la Sección 1, Paso 7)
- Diseccionar los lóbulos del timo del embrión y enjuague con PBS frío.
- Fix timo en el 4% PFA / PBS a temperatura ambiente durante 2 horas.
- Se lavan con PBS-Triton X (0,15%) 3 veces, 10 minutos y thymi lugar en un cartucho de plástico y se sumergen en el 4% de baja fusión de agarosa / PBS (~ 4 ° C). El timo debe estar en contacto con la parte inferior del cartucho.
- Permitir agarosa para solidificar en el hielo (3-5 minutos). Use una hoja de afeitar para cortar el exceso de agarosa. Añadir cola en el bloque de vibratome y adherirse al bloque de la muestra.
- Añadir PBS frío a baño de agua vibratome hasta que la muestra y la hoja están inmersos.
- Ajustar la velocidad y la amplitud (de gran amplitud y baja velocidad moderada es ideal para suaves secciones del timo). La amplitud debe ser reducida si las secciones romper debido a la agitación en exceso.
- Corte secciones de 50 um.
- Usando un pincel, recoger las secciones en una microplaca de 24 pocillos en PBS frío.
- Secciones de bloque en 500 l de suero de burro del 10% en PBS-Triton X (0,15%) durante 30 minutos.
- Secciones se incuban durante 8 horas o toda la noche con el anticuerpo primario, tales como anti-CD31 y anti-PDGFR β-, En una cubierta de 24 pocillos de microplacas.
- Lavar 3 veces con PBS-Triton X (0,15%) sobre un total de 8 horas a 4 ° C.
- Secciones de bloque en el suero de burro del 10% en PBS-Triton X (0,15%) durante 30 minutos.
- Incubar las secciones de 8 horas a la noche a 4 ° C con anticuerpos secundarios apropiados.
- Lavar 3 veces con PBS-Triton X (0,15%) sobre un total de 8 horas a 4 ° C.
- Fijar de nuevo las muestras en el 4% PFA / PBS durante 30 minutos en hielo.
- Lavar 3 veces con PBS-Triton X (0,15%) más de 30 minutos en hielo.
- Deshidratar las muestras a través de una gradual MeOH / PBS Triton X-series: 25% MeOH, 50% MeOH, 75% MeOH, MeOH y 100% a los 10 minutos para cada paso. Reemplazar el 100% de MeOH con MeOH fresco después de 10 minutos y se incuba durante 1 hora a temperatura ambiente.
- En un recipiente de vidrio, mezclar Babb (alcohol bencílico: benzoato de bencilo) en una proporción de 1:2. Combine Babb con MeOH para una concentración final del 50% Babb y el 50% MeOH. Incubar la muestra en Babb: MeOH durante 10-15 minutos.
- Transferir la muestra a un recipiente de vidrio con 100% Babb y se incuba durante 10-15 minutos o hasta que sean borrados, a temperatura ambiente.
- Llena de diapositivas depresión (0,7 mm de profundidad) con Babb fresca 100% y de transferencia de muestras a un lado. Añadir cubierta de vidrio (No. 1.5) y el sello con 2-3 capas de esmalte de uñas. Permita que el esmalte de uñas para endurecer en la oscuridad a temperatura ambiente, luego almacenar la muestra a 4 ° C.
Nota: Las diapositivas deben estar completamente cerrados antes de la adquisición de la imagen confocal. Las imágenes deben ser adquiridas en 12-24 horas, como los tintes fluorescentes pueden desaparecer en Babb. - Pase a la sección 'Adquisición de imágenes ".
5. De adquisición de imágenes
- Imagen 10 micras secciones congeladas con un microscopio confocal con el Plan-Apochromat 20X/0.8 objetivo (512 x 512 píxeles) con 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectina B 4), 543 - y 633-nm líneas láser.
- Adquirir confocal z-secciones de la piel y montaje de todo 50 micras de agarosa embebido en secciones con el Plan-Apochromat 10X/0.4 objetivo (512 x 512 píxeles) con 488 - (FITC-dextran/GSL 1 - isolectina B 4), 543 -, y 633-nm líneas láser. De serie Z-secciones deben ser recogidos de forma secuencial en un micrones para cada canal correspondiente.
- Reconstruir serie Z-secciones usando Zeiss Axiovision 4,6 u otro software de análisis de imagen.
6. Los resultados representativos:
Etiquetado de la eficiencia de la vasculatura embrionarias es crucial para la evaluación de los defectos de los vasos sanguíneos en embriones de ratones. La figura 1 muestra un etiquetado específico de los vasos sanguíneos del timo E16.5 (1A-B) y el etiquetado de cooperación con CD31 (1B), además de la tinción de los ventrículos derecho e izquierdo (1E-F), respectivamente. El GSL I-isolectina B 4 protocolo para cryosections como se describe en las secciones 1, 3 y 5 se utilizó en estos experimentos. Todo el montaje de etiquetado de la red de vasos sanguíneos en la piel E16.5 ratones, utilizando los protocolos descritos en las secciones 1, 2 y 5 se muestra en la Figura 1C-D.
Figura 1 Leyenda. FITC GSL I - isolectina B 4 inyecciones en la vena facial E16.5 embriones de ratón. criosección a. de timo embrionario después de la inyección. b. Fusión de CD31 co-etiquetado con isolectina B 4. c. y d. Todo el montaje de la inyección de la piel embrionaria vasculatura siguiente. e. y f. criosección de corazón embrionarias e. (derecha ventrículo) f. (ventrículo izquierdo) después de la inyección.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Todo el montaje y PECAM-1 (CD31) en las secciones de tinción son los métodos convencionales para el etiquetado de la vasculatura en embriones de ratones. Estos métodos requieren el uso de la inmunofluorescencia directa y / o indirecta, y los detergentes para permeabilizar los tejidos del ratón. Este resulta ser un proceso más oportuna. En este caso, hemos empleado FITC-dextrano o isolectina B 4 inyecciones vena facial para etiquetar directamente la vasculatura embrionaria, eliminando así la necesidad de medidas de etiquetado de anticuerpos. Además, este método permite la evaluación del estado funcional de la vasculatura, como "fugas" fenotipos se dará a conocer mediante este método, pero no por los métodos convencionales de tinción de anticuerpos.
Hemos validado la eficacia de esta técnica mediante el análisis de las secciones del timo embrionario, y el corazón, así como montajes de toda la vasculatura la piel poco después de las inyecciones de la vena facial. Además, se han manchado las secciones de timo para CD31 siguientes FITC-dextrano o isolectina B 4 inyecciones para demostrar que FITC específicamente las etiquetas embrionarias estructuras vasculares. Por lo tanto FITC-dextrano o isolectina B 4 inyecciones en la vena facial embriones pueden ser utilizados para evaluar con rapidez los fenotipos vasculares en múltiples órganos durante el desarrollo. Además, este método permite a los investigadores para determinar el tiempo específico durante el desarrollo en el que la vasculatura periférica embrionarias se conecta a un órgano de interés, a través de la angiogénesis. Hemos incluido un protocolo de etiquetado anticuerpo que es compatible con este FITC-dextrano o isolectina protocolo B 4. El uso de este protocolo, PDGFR-β, α-SMA, y otros anticuerpos, que etiqueta los componentes estructurales de los vasos sanguíneos, pueden ser empleados para evaluar más a fondo la naturaleza de embriones defectos vasculares.
Notas importantes: un medio de contraste, tales como Fast Green se puede agregar a la FITC-dextran/GSL 1 - isolectina B 4 solución con el fin de visualizar la mezcla se inyecta en la vena facial. Poco después de FITC-dextrano inyección, el medio de contraste se puede observar en la vena umbilical y en los vasos sanguíneos a través del saco vitelino y la placenta. En este punto, el cordón umbilical debe ser removido del embrión. En el caso de que el colorante no se detecta en el tallo alantoideo (arteria y vena umbilical) la técnica probablemente no. Hemos observado que si la aguja no entran directamente en la vena facial, FITC-dextrano / fluoresceína GSL 1 - isolectina B 4 se acumula en las zonas adyacentes de la cara. También hemos observado que el FITC-dextrano etiquetas de todo el sistema vascular, mientras que GSL 1 - isolectina B 4 etiquetas de las estructuras vasculares más embrionarias, sino también no-vascular las células del hígado. Un microscopio de fluorescencia, la disección puede ser utilizado para comprobar si la inyección se ha realizado correctamente.
Ratones
Ratones C57BL6 / J fueron adquiridos de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Los embriones fueron generados a través de tipo salvaje, los apareamientos tiempo. Los experimentos fueron aprobados por la Universidad de animal de Atención Institucional de Georgia y el empleo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por los números de concesión y R01AI055001 R01AI082127 del NIAID para MRN y Tesis SREB Beca de JLB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FITC-dextran | Sigma-Aldrich | FD150S-1G | |
| Fluorescein labeled GSL 1 - isolectin B4 | Vector Laboratories | FL-1201 | |
| Fast Green | MP Biomedicals | 195178 | |
| PFA | Fluka | 76240 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Optimal Cutting Temperature Compound (O.C.T. | VWR international | 25608-930 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-33 | |
| Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 | |
| rat anti-mouse CD31, | BD Biosciences | 558736 | |
| goat anti-mouse PDGFR-β | R&D Systems | AF1042 | |
| donkey anti-rat CD31 Alexa 647 (Invitrogen) | Biolegend | 102516 | |
| donkey anti-goat Alexa 594 (Invitrogen) | Invitrogen | A11058 | |
| Triton X -100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Low melt agarose/PBS | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Methanol | Fisher Scientific | A413-4 | |
| Benzyl Alcohol | Acros Organics | 148390010 | |
| Benzyl Benzoate | Acros Organics | 105860010 | |
| Depression slides | Fisher Scientific | S175201 | |
| Fluorogel | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Cover Glass (22X22)-1.5 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 152222 | |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Micro dissecting forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5135 | |
| Parafilm No. OM992 | Fisher Scientific | 13-374-16 | |
| 12 and 24 well microplates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F | |
| Superfrost/PlusMicroscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 4mL clear vials | National Scientific Company | B7800-2 |
References
- Cuddihy, A. R. VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus. Blood. 113, 2723-2731 (2009).
- Muller, S. M. Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102, 10587-10592 (2005).
- Muller, S. M. Neural crest origin of perivascular mesenchyme in the adult thymus. J. Immunol. 180, 5344-5351 (2008).
- Foster, K. Contribution of neural crest-derived cells in the embryonic and adult thymus. J. Immunol. 180, 3183-3189 (2008).
- Liu, C. Coordination between CCR7- and CCR9-mediated chemokine signals in prevascular fetal thymus colonization. Blood. 108, 2531-2539 (2006).
- Lavine, K. J. Fibroblast growth factor signals regulate a wave of Hedgehog activation that is essential for coronary vascular development. Genes Dev. 20, 1651-1666 (2006).
- Lavine, K. J., Kovacs, A., Ornitz, D. M. Hedgehog signaling is critical for maintenance of the adult coronary vasculature in mice. J. Clin Invest. 118, 2404-2414 (2008).
- Mukouyama, Y. S., Gerber, H. P., Ferrara, N., Gu, C., Anderson, D. J. Peripheral nerve-derived VEGF promotes arterial differentiation via neuropilin 1-mediated positive feedback. Development. 132, 941-952 (2005).
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Murphy, P. A. Endothelial Notch4 signaling induces hallmarks of brain arteriovenous malformations in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 10901-10906 (2008).
