Summary
Natural killer cellen zijn een kleine populatie van lymfocyten. Hier laten we zien hoe deze cellen uit menselijk bloed te isoleren door negatieve selectie, met behulp van een kit van StemCell Technologies. De verkregen cellen zijn levensvatbaar en onaangetast door antilichamen, en dus klaar om te worden gebruikt voor een aantal procedures.
Abstract
Natural killer (NK) cellen zijn grote granulaire cytotoxische lymfocyten die behoren tot het aangeboren immuunsysteem en spelen belangrijke rollen in de strijd tegen kanker en infecties, maar zijn ook betrokken bij de vroege stadia van de zwangerschap en afstoting van transplantaten. Deze cellen zijn aanwezig in het perifere bloed, waaruit zij kunnen worden geïsoleerd. Cellen kunnen worden geïsoleerd met behulp van positieve of negatieve selectie. Voor de positieve selectie gebruiken we antilichamen gericht op een oppervlak marker alleen aanwezig op de cellen van belang dat de voor de negatieve selectie gebruiken we cocktails van antilichamen gericht aan het oppervlak markeringen aanwezig zijn op alle cellen, maar de cellen van belang. Deze laatste techniek heeft het voordeel van het verlaten van de cellen van renteloze van antilichamen, waardoor het risico van ongewenste cel activering of differenciation. In deze video-protocol waarin we laten zien hoe NK-cellen uit menselijk bloed gescheiden door negatieve selectie, het gebruik van de RosetteSep kit van StemCell technologieën. De procedure heeft betrekking op het verkrijgen van humaan perifeer bloed (minder dan een Institutional Review Board goedgekeurde protocol bij de proefpersonen te beschermen) en te mengen met een cocktail van antilichamen die zich binden aan markers afwezig op NK-cellen, maar aanwezig is op alle andere mononucleaire cellen aanwezig in de perifere bloed (bijvoorbeeld T-lymfocyten, monocyten ...). De antilichamen aanwezig zijn in de cocktail zijn geconjugeerd aan antilichamen gericht tegen A op erytrocyten glycophorin. Alle ongewenste cellen en rode bloedcellen zal dan ook worden gevangen in de complexen. De mix van bloed en antilichaam cocktail wordt dan verdund, overlayed op een Histopaque helling, en gecentrifugeerd. NK-cellen (> 80% zuiver) kunnen worden afgehaald op het grensvlak tussen de Histopaque en de verdunde plasma. Vergelijkbare cocktails zijn beschikbaar voor de verrijking van andere celpopulaties, zoals het humaan T-lymfocyten.
Protocol
Een gedetailleerd protocol is inbegrepen bij elke Rosette september isolatie cocktail en is online beschikbaar op de website van een StemCell technologieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De cellen geïsoleerd met behulp van deze techniek kan verder worden opgesplitst in verschillende populaties met behulp van andere celscheiding kits.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rosette Sep cocktail for human NK cells | Reagent | Stem Cell Technologies | 15065 | |
| PBS, steile, 1x | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14040-058 | |
| Fetal calf serum (FCS, FBS) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 16140-071 | |
| Histopaque-1077 | Reagent | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| PBS supplemented with 2% FCS and Histopaque solutions must be brought to room temperature before the begining of the procedure. | ||||
References
- Procedures and instruction manuals. , http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx Forthcoming.
