Summary
Les cellules tueuses naturelles sont une petite population de lymphocytes. Ici, nous montrons comment isoler ces cellules du sang humain par une sélection négative, en utilisant un kit de StemCell Technologies. Les cellules obtenues sont viables et épargnée par les anticorps, et donc prêt à être utilisé pour un certain nombre de procédures.
Abstract
Natural killer (NK) sont de grands lymphocytes cytotoxiques granulaires qui appartiennent au système immunitaire inné et jouent un rôle majeur dans la lutte contre le cancer et les infections, mais sont également impliqués dans les premiers stades de la grossesse et le rejet de greffe. Ces cellules sont présentes dans le sang périphérique, d'où ils peuvent être isolés. Les cellules peuvent être isolées en utilisant la sélection positive ou négative. Pour la sélection positive, nous utilisons des anticorps dirigés contre un marqueur de surface présents uniquement sur les cellules d'intérêt alors que pour la sélection négative, nous utilisons des cocktails d'anticorps ciblés pour des marqueurs de surface présents sur toutes les cellules, mais les cellules d'intérêt. Cette dernière technique présente l'avantage de laisser les cellules d'intérêt exempt d'anticorps, réduisant ainsi le risque d'activation des cellules indésirables ou de différenciation. Dans cette vidéo-protocole, nous démontrons comment séparer les cellules NK du sang humain par une sélection négative, en utilisant le kit de RosetteSep StemCell Technologies. La procédure consiste à obtenir du sang périphérique humain (sous une revue institutionnelle approuvée par le conseil protocole pour protéger les sujets humains) et le mélanger avec un cocktail d'anticorps qui se lient à des marqueurs absents sur les cellules NK, mais présent sur toutes les autres cellules mononucléaires périphériques présents dans le sang (par exemple, les lymphocytes T, les monocytes ...). Les anticorps présents dans le cocktail sont conjugués à des anticorps dirigés contre la glycophorine A érythrocytes de suite. Toutes les cellules non désirées et les globules rouges seront donc pris au piège dans les complexes. Le mélange de sang et un cocktail d'anticorps est ensuite diluée, superposé sur un gradient Histopaque, et centrifugé. Les cellules NK (> 80% pur) peuvent être collectées à l'interface entre les Histopaque et le plasma dilué. Cocktails similaires sont disponibles pour l'enrichissement des autres populations cellulaires, telles que les lymphocytes T humains.
Protocol
Un protocole détaillé est inclus avec chaque cocktail Rosette isolement Sep et est disponible en ligne sur le site StemCell technologies 1.
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Discussion
Les cellules isolées en utilisant cette technique peut encore être séparées en différentes populations en utilisant d'autres kits de séparation des cellules.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Rosette Sep cocktail for human NK cells | Reagent | Stem Cell Technologies | 15065 | |
| PBS, steile, 1x | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14040-058 | |
| Fetal calf serum (FCS, FBS) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 16140-071 | |
| Histopaque-1077 | Reagent | Sigma-Aldrich | 10771 | |
| PBS supplemented with 2% FCS and Histopaque solutions must be brought to room temperature before the begining of the procedure. | ||||
References
- Procedures and instruction manuals. , http://www.stemcell.com/technical/technicalrsproc.aspx Forthcoming.
