RNAi는 Necromenic 선충류의 Microinjection에 의해 유전자 최저 및 Transgenesis을 중재 Pristionchus pacificus</em
Summary
RNAi는 특정 mRNA의 성적 1-2 최저 수있을 때 모델 생물에서 transgenesis는 유전자 기능을 조작할 수 있습니다. 이 프로토콜은 necromenic 선충류에 안정적으로 전송 DNA와 과도를 두 번 좌초 RNA를 소개하는 데 필요한 기술을 설명하는 것을 목표로<em> Pristionchus pacificus</em> 진화 발달, 행동 생물학의 연구.
Abstract
그것은 RNA 간섭하고 안정적인 transgenesis에 의해 유전자의 기능과 표현 분석 – 깊이에서 추가, 완전히 합성 genomes를 얻을 특정 해부와 유기체의 분자 세포 생물학으로 인해 많은 종류에 제한 남아 있습니다.하는 새로운 모델 생물에 대해 점점 더 저렴한 있지만 예를 들어, 안정되지 않은 Caenorhabditis 종의 유전자 변형 라인을 전송 Caenorhabditis elegans 3 포함 왕관 그룹 Caenorhabditis 외부 Strongyloides stercoralis 4 Pristionchus pacificus 5를 제외하고,이 그럴듯한 문 (Nematoda)에보고되지 않았습니다. P.의 역할 확대를 촉진하기 위해 개발, 진화, 그리고 행동 6-7의 연구 pacificus, 우리는 여기에 유전자 변형 동물과 gene RNAi에 의해 아래로 노크를 만드는 microinjection을 사용하는 현재의 방법을 설명합니다. 의 생식선과 마찬가지로 <em> C. elegans와 대부분의 다른 nematodes, P.의 생식선 pacificus은 syncitial 직접 microinjection에 의해 전달되는 oocytes에 DNA와 RNA를 통합이 가능합니다. C. 달리 P.의 elegans 그러나 안정 transgene 상속 및 체세포 표현 pacificus은 대상 transgenes 및 coinjection 마커 5 끝까지 보완 endonucleases와 소화 자기 게놈의 DNA를 추가할 필요합니다. 캐리어 게놈의 DNA의 Strongyloides stercoralis 또한 4와 C의 배아 세포에서 transgene 표현에 대한 요구 사항과 비슷합니다 elegans. 동물들의 자신의 게놈의 DNA에 대한 특정 요구 사항이있는 경우 그러나, 그것은 명확하지 않기 때문에 P. pacificus 소마이 아닌 복잡한 다중 복사 유전자를 입을 또는 매우 효율적입니다 P.에 extrachromosomal 배열 pacificus은 유사 분열하는 동안 적절한 kinetochore 조립에 대한 게놈 시퀀스가 필요합니다. 두 무장 (의 복부 마이 그 레이션광고에 나온것에 didelphic) 생식선 추가 개별 웜 8 양쪽 생식선을 삽입하는 능력을 복잡. 우리는 또한 최저의 비 롤링 F 1 자손을 얻기 위해 생식선에 두 번 좌초 RNA (dsRNA)를 주사하여 지배적인 돌연변이 (롤러, tu92)에 microinjection의 사용을 보여줍니다. C. 달리 elegans지만, 대부분의 다른 nematodes처럼, P. pacificus PS312은 먹이와 몸으로 따라서 dsRNA가 syncitial 생식선에 microinjection에 의해 관리되어야합니다 통해 체계적 RNAi에 수용하지 않습니다. 현재이 연구에서 우리는 PPA – egl – 4 모터를 변환하는 데 필요한 microinjection 과정을 설명하도록하겠습니다 : : GFP에 융합 기자와 최저의 지배 롤러 prl – 1 (tu92) 시각 정보를 프로토콜에 돌연변이.
Protocol
Discussion
P. pacificus의 인구는 전세계 다양한 풍뎅이 딱정벌레의 종들과 긴밀한 연관에서 발견 무료 생활 기생 nematodes 사이의 중간 모델 선충류집니다. P.의 강도 새로운 모델 유기체로 pacificus은 불편 앞으로 유전 화면에서 격리 돌연변이의 위치 매핑을 증진의 유전자와 물리적지도의 통합에 누우면 (즉,뿐만 아니라 이전에 C. elegans의 특징 후보 유전자에 대한) 6,10. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 microinjection뿐만 아니라 익명의 검토에서 통찰력의 의견과 도움을 RJ 서머와 X 왕 매우 감사하고 있습니다. 이 작품은 NIH 부여 SC2GM089602에 의해 지원됩니다.
Materials
| Product: | Catalog #: | Supplier: |
|---|---|---|
| DMI3000 Injection microscope | DMI3000 | Leica |
| Microinjector manipulator (Direct drive) | Narashige BC-3 Ball joint | Tritech Research |
| Needle Puller | Narashige PC-10 | Tritech Research |
| MicroInjector™ All-Digital Multi-pressure System | Narashige MINJ-D | Tritech Research |
| GeneElute™Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit | G1N70 | Sigma |
| pJet Cloning Jet kit | K1231 | Fermentas |
| GeneJET plasmid Miniprep kit | K0502 | Fermentas |
| DNA Clean & Concentrator™ | D4005 | ZYMO Research |
| BLOCK-IT™ RNAi TOPO® transcription kit | K3500-01 & K3650-01 | Invitrogen |
| Difco™Agar Noble | DF0142-15-2 | Fisher Scientifi |
| Microscope cover glass (1.5 – 0.16 to 0.19mm thick; Size: 50 x 45mm) | 12-554-F | Fisher Scientific |
| Glass capillaries (filament) | 615000 | A-M systems |
| Paraffin Oil (Heavy) | O122-1 | Fisher Scientific |
| KH2PO4 | P386-500 | Fisher Scientific |
| Na2HPO4 | AC20651-5000 | Fisher Scientific |
| NaCl | BP3581 | Fisher Scientific |
| MgSO4 | M80-500 | Fisher Scientific |
References
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