RNAi Mediated Gene Knockdown en Transgenese door micro-injectie in de Necromenic Nematode Pristionchus pacificus</em
Summary
In model organismen, kan transgenese manipuleren genfuncties terwijl RNAi kan knockdown specifieke mRNA-transcripten 1-2. Dit protocol heeft tot doel illustratie van de technieken die nodig zijn om stabiel overgedragen DNA en van voorbijgaande aard dubbelstrengs RNA te brengen in de necromenic nematode<em> Pristionchus pacificus</em> Voor studies in de evolutionaire, ontwikkelings-en gedragsbiologie.
Abstract
Hoewel het meer en meer betaalbaar voor de opkomende modelorganismen volledig gesequenced genoom te verkrijgen, verdere diepgaande genfunctie en expressie analyses van RNA-interferentie en stabiele transgenese blijven beperkt in vele soorten te wijten aan de bijzondere anatomie en moleculaire cellulaire biologie van het organisme. Zo hebben buiten de kroon groep Caenorhabditis Caenorhabditis elegans, dat 3, stabiel overgedragen transgene lijnen in niet-Caenorhabditis soort omvat niet gemeld in dit misleidende phylum (Nematoda), met uitzondering van de Strongyloides stercoralis 4 en Pristionchus pacificus 5. Ter vergemakkelijking van de groeiende rol van P. pacificus in de studie van de ontwikkeling, evolutie en gedrag 6-7, beschrijven we hier de huidige methoden om micro-injectie te gebruiken voor het maken van transgene dieren en gen die door RNAi kloppen. Net als de geslachtsklieren van <em> C. elegans en de meeste andere nematoden, de gonaden van P. pacificus is syncitial en in staat van het opnemen van DNA en RNA in de eicellen bij aflevering door directe micro-injectie. In tegenstelling tot C. elegans echter, stabiele transgene erfenis en somatische uitdrukking in P. pacificus vereist de toevoeging van zelf genomisch DNA gedigereerd met endonucleasen complementair zijn aan de uiteinden van target transgenen en coinjection markers 5. De toevoeging van drager genomisch DNA is gelijk aan de eis voor transgenexpressie in Strongyloides stercoralis 4 en in de geslachtscellen van C. elegans. Het is echter niet duidelijk of de specifieke vereisten van de dieren 'eigen genoom DNA is, omdat P. pacificus soma is zeer efficiënt bij zwijgen niet-complexe multi-copy genen of die extrachromosomaal arrays in P. pacificus nodig genomische sequenties voor de goede kinetochoor de montage tijdens de mitose. De ventrale migratie van de twee-armige (didelphic) gonaden in hermafrodieten bemoeilijkt verder de mogelijkheid om zowel gonaden injecteren in de individuele wormen 8. We tonen ook aan het gebruik van micro-injectie om knockdown een dominante mutant (roller, tu92), door het injecteren van double-stranded RNA (dsRNA) in de geslachtsklieren om niet-rolling F 1 nakomelingen te verkrijgen. In tegenstelling tot C. elegans, maar zoals de meeste andere nematoden, P. pacificus PS312 is niet ontvankelijk voor systemische RNAi via voeding en het weken en daarom dsRNA moet worden toegediend door micro-injectie in de syncitial geslachtsklieren. In deze huidige studie, hopen we de micro-injectie proces nodig is om een PPA-EGL-4 promotor te transformeren beschrijven:: GFP fusie verslaggever en knockdown een dominante rol PRL-1 (tu92) mutant in een visueel informatieve protocol.
Protocol
Discussion
P. pacificus populaties zijn te vinden in nauwe samenwerking met verschillende scarabee soorten wereldwijd en is een model nematode intermediair tussen de vrij levende en parasitaire nematoden. De kracht van de P. pacificus als een opkomende modelorganisme lag in de integratie van de genetische en fysische kaarten die positionele in kaart brengen van mutanten geïsoleerd van onpartijdige vooruit genetische screens te bevorderen (dus niet alleen voor de kandidaat-genen die eerder gekenmerkt in …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn zeer dankbaar voor RJ Sommer en X Wang voor hulp bij micro-injectie, maar ook inzicht opmerkingen van de anonieme recensenten. Dit werk wordt ondersteund door NIH subsidie SC2GM089602.
Materials
| Product: | Catalog #: | Supplier: |
|---|---|---|
| DMI3000 Injection microscope | DMI3000 | Leica |
| Microinjector manipulator (Direct drive) | Narashige BC-3 Ball joint | Tritech Research |
| Needle Puller | Narashige PC-10 | Tritech Research |
| MicroInjector™ All-Digital Multi-pressure System | Narashige MINJ-D | Tritech Research |
| GeneElute™Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit | G1N70 | Sigma |
| pJet Cloning Jet kit | K1231 | Fermentas |
| GeneJET plasmid Miniprep kit | K0502 | Fermentas |
| DNA Clean & Concentrator™ | D4005 | ZYMO Research |
| BLOCK-IT™ RNAi TOPO® transcription kit | K3500-01 & K3650-01 | Invitrogen |
| Difco™Agar Noble | DF0142-15-2 | Fisher Scientifi |
| Microscope cover glass (1.5 – 0.16 to 0.19mm thick; Size: 50 x 45mm) | 12-554-F | Fisher Scientific |
| Glass capillaries (filament) | 615000 | A-M systems |
| Paraffin Oil (Heavy) | O122-1 | Fisher Scientific |
| KH2PO4 | P386-500 | Fisher Scientific |
| Na2HPO4 | AC20651-5000 | Fisher Scientific |
| NaCl | BP3581 | Fisher Scientific |
| MgSO4 | M80-500 | Fisher Scientific |
References
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Ahringer, J. Reverse Genetics. Wormbook. , (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Junio, A. J., Li, X., Massery, H. C., Nolan, T. J., Lamitina, S. T., Sundaram, M. V., Lok, J. B. Strongyloides stercoralis: cell- and tissue-specific transgene expression and co-transformation with vector constructs incorporating a common multifunctional 3′ UTR. Exp. Parasitology. 118, 253-265 (2008).
- Schlager, B., Wang, X., Braach, G., Sommer, R. J. Molecular cloning of a dominant roller mutant and establishment of DNA-mediated transformation in the nematode Pristionchus pacificus. Genesis. 47, 300-304 (2009).
- Hong, R. L., Sommer, R. J. Pristionchus pacificus: a well-rounded nematode. Bioessays. 28, 651-659 (2006).
- Hong, R. L., Sommer, R. J. Chemoattraction in Pristionchus nematodes and implications for insect recognition. Curr. Biol. 16, 2359-2365 (2006).
- Rudel, D., Riebesell, M., Sommer, R. J. Gonadogenesis in Pristionchus pacificus and organ evolution: development, adult morphology and cell-cell interactions in the hermaphrodite gonad. Dev. Biol. 277, 200-221 (2005).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 11, 802-805 (1994).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293-e2293 (2011).
- Evans, T. C. Transformation and Microinjection. Wormbook. , (2006).
