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Biology

आरएनएआई जीन नॉकडाउन और Transgenesis मध्यस्थता Microinjection द्वारा Necromenic निमेटोड में Pristionchus pacificus Published: October 16, 2011 doi: 10.3791/3270
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1, 1
1Biology Department, California State University

Summary

मॉडल जीवों में, transgenesis जीन कार्यों में हेरफेर जबकि आरएनएआई विशिष्ट mRNA टेप 1-2 पछाड़ना सकते हैं कर सकते हैं. इस प्रोटोकॉल necromenic निमेटोड में stably प्रेषित डीएनए और क्षणिक डबल असहाय आरएनए परिचय की जरूरत तकनीक को वर्णन करना

Protocol

1. Transgenesis: डीएनए की तैयारी

  1. प्रमुख सह इंजेक्शन मार्कर: pRL3 [PPA - PRL 1 (tu92)]
    pRL3 प्लाज्मिड नेत्रहीन सफल परिवर्तन घटनाओं की पहचान करने के लिए एक प्रमुख सह इंजेक्शन मार्कर है. यह प्लाज्मिड PPA - PRL-1 जीन की एक प्रमुख उत्परिवर्ती (tu92) एलील निकट एसक्यूटी-1 सी में कोलेजन जीन से संबंधित के लिए encodes एलिगेंस और कीड़ा शरीर 1,5 अक्ष के साथ दक्षिणावर्त घुमा गतियों में wildtype sinusoidal हरकत बदल देती है . तब्दील जानवर बहुत लोकप्रिय प्रभावी चयन मार्कर rol 6 (su1006) सी. में इस्तेमाल किया करने के लिए इसी तरह की है पिछले 20 वर्षों के लिए एलिगेंस .
  2. टारगेट संवाददाता transgene: PPA EGL-4P: GFP
    ब्याज की एक जीन एक अनुक्रम 9 कोडन GFP transcriptionally या translationally जुड़ा हुआ हो सकता है. इस अध्ययन में, PPA EGL - 4promoter: GFP (EGL 4, cGMP निर्भर प्रोटीन kinase) उपयोग किया गया थाअगर एक 2 केबी अनुवाद की शुरुआत के अपस्ट्रीम टुकड़ा पी. में GFP अभिव्यक्ति प्रदान कर सकते हैं निर्धारित करने के लिए pacificus PS312. यह GFP वेक्टर संशोधित साथ एक GFP कोडन क्षेत्र शामिल हैं
    introns और बहुउद्देशीय PPA - आरपीएल 23 3 'UTR 5 टर्मिनेटर कृपया Xiaoyue वांग और Ralf जे Sommer (मैक्स प्लैंक इंस्टीट्यूट, Tuebingen, जर्मनी, यूरोपीय संघ) द्वारा उपलब्ध कराए गए.
  3. जीनोमिक डीएनए: PS312
    wildtype पी. के अलावा pacificus PS312 जीनोमिक डीएनए ट्रांसजेनिक एफ 1 उनके एफ 2 5 संतान जानवरों से विशेष रूप से स्थिर transgene विरासत, प्राप्त करने के लिए आवश्यक है. यह अभी तक कुछ नहीं है अगर जीनोमिक डीएनए दो (सह इंजेक्शन PRL-3 मार्कर और PPA EGL-4P: Gfp रिपोर्टर) transgenes के साथ जटिल अतिरिक्त गुणसूत्र सरणियों रूपों में स्थिर एफ 2 ट्रांसजेनिक लाइनों में मनाया उन लोगों के लिए समान सी. 3 एलिगेंस. हालांकि, आवश्यकता जीनोमिक डीएनए और transgenes करने के लिए समान cohesi साझाve overhangs जोरदार जटिल अतिरिक्त गुणसूत्र सरणियों उचित डीएनए संचरण (gDNA सिग्मा G1N10 किट का उपयोग कर तैयार) के लिए मेजबान कोशिकाओं को पहचान सकते हैं के गठन का सुझाव है.
  4. डीएनए पाचन
    : GFP डीएनए वेक्टर और चिपचिपा सह इंजेक्शन मार्कर pRL3 और gDNA PS312 के साथ संगत overhangs का उत्पादन: प्रतिबंध एंजाइमों के लिए PPA - EGL-4P linearize उपयोग किया जाता है. दोहन, नहीं vortexing द्वारा मिक्स. 37 पर एक घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस
pRL3 4 μg
10xbuffer 10 μl
PstI (10 यू μl /) 4 μl
DH 2 हे ~
कुल: 100 μL
PPA - EGL-4P: GFP 4 μg
10x बफर 10 μl
साली (10 यू μl /) 4 μl
DH 2 हे ~
कुल: 100 μl
gDNA PS312 10 μg
10x बफर 10 μl
Pst मैं और साल मैं (10 यू μl /) 8 μl
DH 2 हे ~
कुल: 100 μl

तालिका 1 प्रतिबंध एनजाइम डाइजेस्ट के लिए मिश्रण.

  1. डीएनए तेज़ी और तैयारी
    1. 1:10 सोडियम एसीटेट (3 एम NaCOOCH 3 5.2 पीएच) और 2.5X 100% इथेनॉल को पचा उत्पाद मात्रा में जोड़ें, 20 एनजी / glycogen के μl जोड़ने के लिए गोली आसान देखने .
    2. 4 में 15 मिनट के लिए 14,000 rpm पर अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
    3. Tippi द्वारा सतह पर तैरनेवाला निथारनाधीरे धीरे एनजी अपकेंद्रित्र ट्यूब उल्टा और फिर यह एक टिशू पेपर पर दोहन है, यकीन है कि गोली ट्यूब के नीचे कोने में सुरक्षित है और इथेनॉल के मुक्त बनाने.
    4. 75% इथेनॉल 1 मिलीलीटर जोड़ें.
    5. तत्काल 5 मिनट के लिए 14,000 rpm पर 4 में स्पिन डिग्री सेल्सियस
    6. धीरे अपकेंद्रित्र ट्यूब उल्टा ढोने और फिर यह एक टिशू पेपर पर दोहन लगता है कि यह गोली ट्यूब के नीचे कोने में सुरक्षित और इथेनॉल के मुक्त बनाने के द्वारा सतह पर तैरनेवाला निथारना.
    7. सूखी वैक्यूम अपकेंद्रित्र में 5 मिनट के लिए 14,000 rpm पर 25-30 पर ° गोली सी, जब तक सूखी और इथेनॉल के पूरी तरह मुक्त है.
    8. ते या बाँझ 2 DH हे 30 μl जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस के मिश्रण संक्षिप्त से पहले एक भंवर के साथ रातोंरात छोड़.
    9. तालिका 2 का वर्णन कैसे इंजेक्शन के लिए प्रत्येक शुद्ध डीएनए से इंजेक्शन मिश्रण बनाने के लिए.
    10. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर इंजेक्शन के लिए मिश्रण विगलन के बाद, नीचे 5 मिनट के लिए 14,000 rpm पर ट्यूब स्पिन मलबे कणों कि हो सकता है छुटकाराइंजेक्शन सुई रोकना.
आनुवंशिक सामग्री एकाग्रता
PPA - EGL-4P: GFP (Sali) > 5 / एनजी μl (0.1-10ng/μl)
pRL3 (PstI) >> 1 एनजी / μl
gDNA PS312 (+ PstI Sali) > 60 एनजी / μl
DH 2 हे ~
कुल: 30 μl

टेबल 2 PPA - PRL-1 इंजेक्शन मिश्रण

2. शाही सेना हस्तक्षेप: इन विट्रो डबल असहाय शाही सेना संश्लेषण में

  1. पीसीआर का प्रयोग करें ब्याज की जीन बढ़ाना. RHL091 5'-agtggatccGAAGGTCCATACGGGAGC-3 '(BamHI साइट) और RHL092 5'-tatctgcagGTGAGGAGTACCAGGAGAG-3' (PstI साइट) एक 464 बीपी जीनोमिक frag बढ़ाना इस्तेमाल किया गयाpRL3 PPA PRL-1 (tu92) एलील युक्त वेक्टर से जाहिर (3-466 स्थिति).
  2. BamHI और PstI साथ पीसीआर उत्पाद डाइजेस्ट.
  3. टुकड़ा / BamHI PstI pL4440 आरएनएआई खिला पचा ​​वेक्टर 2 कटी घमनी को बांधना.
  4. सक्षम कोशिकाओं में डाला सदिश रूपांतरण और उन्हें एम्पीसिलीन पौंड मीडिया प्लेटें (50 μg / एमएल) पर बढ़ती है.
  5. पीसीआर द्वारा सफलतापूर्वक डाला वेक्टर T7 प्राइमरों का उपयोग का चयन करें.
  6. T7 पीसीआर उत्पाद का प्रयोग करें flanked PRL-1 डबल असहाय शाही सेना dsRNA जीन युक्त) ब्लॉक आईटी आरएनएआई संश्लेषण किट (Invitrogen) का उपयोग .
  7. dsRNA एकाग्रता का सबसे अच्छा है अगर> 200 एनजी / μl, 1 इंजेक्शन के लिए μg / μl.
  8. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर इंजेक्शन के लिए मिश्रण विगलन के बाद, नीचे 5 मिनट के लिए 14,000 rpm पर ट्यूब स्पिन को मलबे कणों कि इंजेक्शन की सुई को रोकना कर सकते से छुटकारा.

3. Microinjection: और / या dsRNA transgenes के इंजेक्शन के लिए प्रोटोकॉल

  1. इंजेक्शन सुई
    1. तापमान: Narishige सुई (PC-10 # मॉडल) डांड़ी सेट करें:
      1. नीचे घुंडी मुड़ें "No.2 हीटर."
      2. "No.2 हीटर Adj" मुड़ें. पैनल जब तक घुंडी 55.0-60.0 पढ़ता डिग्री सेल्सियस लंबाई बदलती की पतली सुई टिप के लिए.
    2. नीचे घुंडी वापस चालू करने के लिए "चरण 1" (एक कदम में सुई खींचती).
    3. चेंबर में सुई लोड और यह सुरक्षित है सुनिश्चित करें.
    4. "आरंभ" बटन (लाल बटन) प्रेस और सुई सभी वजन (इस दो विपरीत दिशाओं में समान सुइयों करना चाहिए) के साथ खींच करने की अनुमति है.
    5. कक्ष और एक प्लास्टिक की संस्कृति चलायें-Doh द्वारा जगह में सुरक्षित सुइयों पर जमते से धूल को रोकने के थाली में दुकान से सुई निकालें.
  2. बढ़ते पैड
    1. एक 1.5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में, एच 2 ओ के 1 मिलीलीटर नोबल अग्रवाल की 0.02 ग्राम जोड़कर एक 2% नोबल अग्रवाल समाधान बनाने अगर 4 डिग्री सेल्सियस के लिए एक साल के लिए संग्रहीत किया जा सकता है.
    2. अच्छी तरह मिक्स औरएक गर्मी ब्लॉक> सी. ° 88 सेट में अगर पिघल
    3. 1 मिलीलीटर micropipette का प्रयोग, तरल 2% नोबल अग्रवाल के एक गिलास स्लाइड के मध्य के लिए ड्रॉप जगह (फिशर, 12 544 एफ).
    4. ड्रॉप के शीर्ष पर एक गिलास स्लाइड रखकर समतल.
    5. "ड्रॉप चरण" दोहराएँ जब तक वहाँ पाँच गिलास स्लाइड की एक परत है.
    6. कांच फिसलने से प्रत्येक गिलास स्लाइड निकालें एक अन्य बंद स्लाइड.
    7. ड्राई 70 पर एक वैक्यूम ओवन में कांच स्लाइड पर अगर पैड समतल ° सी (या कमरे के तापमान पर रातोंरात) के 4 घंटे के लिए रात भर के लिए.
    8. कई इंजेक्शन भविष्य के उपयोग के के लिए पैड और दुकान.
  3. उभयलिंगी gonads में Microinjection

चित्रा 1
चित्रा 1. पी. का एक योजनाबद्ध ड्राइंग pacificus शारीरिक रचना स्पष्ट nucleated कोशिकाओं महिला रोगाणु (oocytes) कोशिकाओं और ग्रे छायांकित हिस्सा हैं आंत है. केवल एक बाहर का पूर्वकाल जननपिंड दिखाया गया हैलेकिन नोटिस दो डिस्टल gonads मध्य शरीर के पास एक दूसरे के पीछे की ओर पार.

चित्रा 2
चित्रा 2. Microinjection की छवियाँ (ए) इंजेक्शन सुई टिप खींच केशिका टुकड़ा के अभी तक सही लाइन के साथ ध्यान में है . हल्के से कि किनारे करने के लिए सुई की नोक छू, सुई टिप जबकि अभी भी एक तेज बिंदु को बनाए रखना तोड़ना चाहिए. (बी) में सुई के शीर्ष आवेषण पहले इंजेक्शन के लिए पेट वक्रता बस के ऊपर जननपिंड. (सी) नीचे में सुई आवेषण दूसरे इंजेक्शन के लिए सिर्फ पेट वक्रता के नीचे जननपिंड.

    1. सुनिश्चित करें कि इसके विपरीत और डीआईसी कर्तन सेटिंग उभयलिंगी gonads देखने के लिए आदर्श है.
    2. खींच केशिका सुई में इंजेक्शन मिश्रण के 1.0-2.0 μl लोड.
    3. Microinjection जोड़तोड़ में सुई प्लेस, नाइट्रोजन टैंक के दबाव gauges आदर्श स्थितियों के लिए सेट किया जाना चाहिए (10-20 साईसेकंड के लिए 0.5-1).
    4. इसे छू एक बारीकी से खींच केशिका एक स्लाइड (2A आंकड़ा) पर रखा ट्यूब के किनारे करने के लिए थोड़ा सुई टिप तोड़ो.
      1. सुई ब्रेकर स्लाइड: एक खींच तेल की एक बूंद में एक गिलास स्लाइड पर रखा केशिका के thinnest हिस्सा
    5. एक बार सुई टूट गया है यह जगह एक निष्क्रिय स्थिति में जब आप पैड के लिए अपने कीड़ा लेने (पी. pacificus इंजेक्शन के लिए वे बाहर शुष्क पहले 5 मिनट के खिड़की और मरने) कर सकते हैं.
    6. एक J4 युवा वयस्क कीड़े के भरी थाली का उपयोग, पर्याप्त पैराफिन तेल (भारी) OP50 बैक्टीरियल लॉन में सभी कीड़े को कवर बस डालना.
    7. एक कीड़ा उठाओ और इंजेक्शन पैड पर जगह है.
    8. स्थिति सुई और योनी सुई (चित्र 2B, 2C) से दूर की दिशा में कीड़ा जननपिंड, माइक्रोस्कोप पर कृमि के साथ गिलास स्लाइड रखें.
    9. खुर्दबीन देखने की स्थिति में सुई लोअर.
    10. शीर्ष और एक ही फोकल हवाई जहाज़ (चित्रा 2B) में सुई जननपिंड स्थिति.
    11. कीड़ा धीरे प्रहार और इंजेक्शन मिश्रण में पंप, बाहर का सिरे की ओर अलग ooctyes एक सफल इंजेक्शन से संकेत मिलता है (transgene या dsRNA डिलीवरी अनुकूलन, आप इंजेक्शन पर जारी है कि जब तक यह डिस्टल के करीब है जननपिंड में विस्तार की एक लहर देखना चाहिए टिप).
    12. कम जननपिंड और दोहराने इंजेक्शन इंजेक्षन सुई का स्थान बदलें, लेकिन बाद से इस जननपिंड पेट oocytes के प्रसार नहीं देखा जाएगा के तहत है और इस प्रकार अधिक मुश्किल से हासिल (चित्रा 2C) है.
    13. सामान्य देख कीड़ा इंजेक्शन के बाद एक सफल इंजेक्शन इंगित करता है, वहाँ किसी भी क्षतिग्रस्त gonads नहीं होना चाहिए (योनी से बाहर फैला हुआ या शरीर गुहा के अंदर popped).
    14. निष्क्रिय स्थिति में सुई वापस प्लेस.
    15. कीड़ा बचाव करने के लिए तैयार करो.
    16. M9 बफर की एक (0.5 μl) ड्रॉप पैड जहां इंजेक्शन कीड़ा रखा गया है पर जोड़ें.
    17. अपने ले OP50 कुछ बैक्टीरिया का प्रयोग, OP50 साथ कीड़ा स्पर्श, और यह रहना चाहिए. डब्ल्यूई मुंह विंदुक प्रयोग नहीं करते.
    18. OP50 के 50 μl धब्बों के साथ वरीयता प्राप्त थाली पर कीड़ा प्लेस, 2-4 कीड़े ऐसे प्लेटों पर बचाया जा सकता है है.
  2. के बाद इंजेक्शन और Transgenesis के लिए संग्रहण स्क्रीनिंग
    1. स्टोर कीड़े 20 (0 पी) इंजेक्शन डिग्री सेल्सियस ~ 4 दिनों अंडे देना और 1 एफ बढ़ने के लिए .
    2. स्क्रीन चयनित फेनोटाइप (रोलिंग जानवरों के लिए PPA - PRL-1 प्रमुख मार्कर व्यक्त transgenesis खोज, के लिए स्क्रीन करने के लिए) के लिए चौथे दिन पर कीड़े.
    3. एकल स्वतंत्र एफ 1 उठाओ नई वरीयता प्राप्त थाली और स्टोर करने के लिए मनाया phenotype के साथ 25 में पशुओं डिग्री सेल्सियस, इस तापमान एफ 1 से स्थिर लाइनों के गठन को प्रोत्साहित करती है 'एस
    4. स्वतंत्र एफ 1 लाइनों से सिंगल 2 एफ. व्यक्तिगत एफ 2 लाइनों इसी तरह transgene संचरण दर है. हम अक्सर 15> प्राप्त F तब्दील एफ 1 जानवर प्रति 2 लाइनों.
    5. 25 डिग्री सेल्सियस पर बाद की पीढ़ियों स्टोर
    6. रोलर्स के संचरण दर आम तौर पर एफ 4 पीढ़ी के बाद लगातार बना रहता है, इस प्रकार यह इस समय के लिए लक्ष्य transgene की अभिव्यक्ति के स्तर (PPA - EGL-4P: GFP:) निर्धारित प्रत्येक व्यक्ति लाइन के लिए आवश्यक है. GFP अभिव्यक्ति प्रमुख रोलर phenotype के penetrance की हद तक के साथ नहीं सहसंबंधी सकता है.
  3. इंजेक्शन के बाद और आरएनएआई phenotypes के लिए संग्रहण स्क्रीनिंग
    1. स्टोर कीड़े 20 (0 पी) इंजेक्शन ° ~ 4 दिनों के लिए करना है और 1 एफ बढ़ने के लिए सी .
    2. स्क्रीन एफ चयनित फेनोटाइप (आरएनएआई पछाड़ना phenotype, व्याप्ति phenotypes कि लक्ष्य जीन गतिविधि की हानि के साथ जुड़ा हो सकता है, हमारे मामले में PPA PRL-1 phenotype के नुकसान के लिए खोज के लिए स्क्रीन करने के लिए) के लिए एक चौथे दिन पर कीड़े.
    3. हमारे अनुभव में, गैर रोलर पछाड़ना phenotype> 2 एफ के 97% में खो दिया है.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

पी "> 1 Transgenesis के नतीजे

सत्र 0 पी इंजेक्ट एफ 1 रोलर ट्रांसजेनिक 2 एफ% 2 एफ के बाद औसत% संचरण
1 60 2 (1 लाइन) 0%
(2 लाइन) 13% 		NA
13 ± 10%
2 40 1 * (3 लाइन) 0% NA
3 40 0 0% NA
4 40 1 (4 लाइन) 0% NA
5 20 0 0% NA
6 40 1 (5 लाइन) 26% 22 ± 10%
; सामग्री "> * एक पुरुष रोलर कि पार नहीं किया NA: लागू नहीं

: GFP (साल मैं पचा), (रोलर) pRL3 (पीएसटी मैं पचा), और gDNA PS312 (PstI और साली पचा): PPA - EGL-4P के साथ इंजेक्शन PS312 के 3 टेबल परिणाम.

चित्रा 3
चित्रा 3 (ए) wildtype (बी, सी) एक स्थिर एफ pRL3 4; PPA EGL-4P:: GFP ट्रांसजेनिक लाइन सिर न्यूरॉन GFP अभिव्यक्ति दिखा.

2. शाही सेना के हस्तक्षेप का परिणाम

चित्रा 4
चित्रा 4. शाही सेना PRL 1 म्यूटेंट "रोलिंग" हरकत की पूरी पछाड़ना दिखा. (ए) PRL-1 रोलर लाभ के समारोह tu92 उत्परिवर्ती इंजेक्शन. (बी) "खटखटाया से नीचे" PRL-1 उत्परिवर्ती एक्ज़िबिट सामान्य wildtype मुद्रा और हरकत. (सी) PRL-1 (नीचे) भी है और अब ख इंजेक्शनकी तुलना में ody PRL-1 उत्परिवर्ती (ऊपर). (डी) इंजेक्शन PRL 1 (नीचे) के अब शरीर भी wildtype PS312 (ऊपर) से अधिक लंबी है. अब शरीर phenotype rol 5 (एसक्यूटी-1) सी. के आरएनएआई पछाड़ना में भी मनाया गया एलिगेंस N2 (नहीं दिखाया डेटा है) .

रोल गैर रोल
एक PRL-1 dsRNA (200 एनजी / μl) 13 21
बी dsRNA PRL-1 (1000 / एनजी μl) 9 16
नियंत्रण 20 2

तालिका 4 PPA - PRL-1 dsRNA इंजेक्शन का सारांश. (ए) [dsRNA] = 200 एनजी / μl, (बी) [dsRNA] = 1000 एनजी / μl. पी = 0.0019 और फिशर सटीक टेस्ट, 200 और 1000 एनजी / μl इंजेक्शन के लिए दो - पुच्छ, क्रमशः द्वारा .041.

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Discussion

पी. pacificus आबादी विभिन्न scarab बीटल दुनिया भर में प्रजातियों के साथ निकट सहयोग में पाए जाते हैं और एक मॉडल निमेटोड मुक्त रहने और परजीवी नेमाटोड के बीच मध्यवर्ती है . पी. की ताकत एक उभरती हुई मॉडल जीव के रूप में pacificus अपनी आनुवंशिक और भौतिक नक्शे है कि निष्पक्ष आगे आनुवंशिक स्क्रीन से अलग म्यूटेंट के स्थितीय मानचित्रण को बढ़ावा देने के एकीकरण में निहित है (यानी सिर्फ उम्मीदवार पहले सी एलिगेंस में विशेषता जीन के लिए नहीं) 6,10. लेकिन सी. एलिगेंस आनुवंशिक तकनीक आसानी से पी. के लिए हस्तांतरणीय नहीं हैं आकारिकी अंग में महत्वपूर्ण मतभेद, प्राथमिक डीएनए दृश्यों, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से विदेशी डीएनए के जवाब के कारण pacificus. हमारे वर्तमान अध्ययन के विस्तार कैसे स्थिर रिपोर्टर पहले Schlager एट अल 5 के द्वारा वर्णित जीन शुरू करने के लिए और कैसे नीचे दस्तक करने के लिए आरएनएआई द्वारा एक ही प्रमुख रोलर उत्परिवर्ती में दिखाता है. हमारी प्रोटोकॉल पूर्व के.एन. अनुमान नहीं हैtransgenesis या सी. में आरएनएआई के owledge एलिगेंस.

एफ 1 परिवर्तन (~ 2%) इस अध्ययन में दिखाया गया है दर पिछले पी. में PRL-1 मार्कर का उपयोग कर परिणाम के लिए तुलनीय है pacificus (2-10%) 5, लेकिन एस में पाया दर से भी कम stercoralis (3-22%) 4. वहाँ अभी भी बहुत पी. में ट्रांसजेनिक प्रौद्योगिकी के सुधार के लिए संभावित pacificus. यहां तक कि (tu92) प्रमुख रोलर मार्कर PRL-1 मुताबिक़ का उपयोग आमतौर पर इस्तेमाल किया rol (su1006) सी. में एलील-6 एलिगेंस, पी. में transgenesis की प्रभावशीलता pacificus पहले सी. के लिए वर्णित उन लोगों की तुलना में काफी कम है मेलो और सह कार्यकर्ताओं 3, जिसमें कई ट्रांसजेनिक एफ 1 संतान विशेषज्ञ हाथों में इंजेक्शन जानवर प्रति प्राप्त किया जा सकता द्वारा एलिगेंस. कई कारकों के इस अंतर को समझा जा सकता है: (1) diakinesis में कम पी. में oocytes की संख्या pacificus महिला germline (एवेन्यूजननपिंड प्रति एक क्रोध) 8 mitotic जर्म कोशिकाओं का एक कम दर पी. में अर्धसूत्रीविभाजन में संक्रमण को प्रतिबिंबित कर सकते हैं pacificus सी. करने के लिए तुलना 11 एलिगेंस. इसलिए, कम oocytes डीएनए ले सकते हैं और प्रत्येक इंजेक्शन के बाद शाही सेना. समग्र कम द्विलिंग प्रति पी. में चिंता का आकार pacificus (200 ~) PS312 तुलना सी. एलिगेंस N2 (300 ~) भी ट्रांसजेनिक प्रति इंजेक्शन जानवर एफ 1 के कम संख्या बढ़ा सकता है. (2) एफ 1 से 2 एफ विदेशी डीएनए के प्रसारण के लिए इंजेक्शन मिश्रण में जीनोमिक डीएनए के लिए आवश्यकता सुझाव है कि एक मजबूत जीन का मुंह बंद तंत्र भी पी. में शामिल किया जा सकता है सी. में की तुलना में pacificus एलिगेंस. फिर भी पी. pacificus transgene अभिव्यक्ति के लिए एस में चरम जीन पाया मुंह बंद गुजरना प्रतीत नहीं होता stercoralis जो transgene अभिव्यक्ति में एफ 1 4 पशुओं के लिए सीमित है . वर्तमान में हम PPA EGL-4P की अभिव्यक्ति निस्र्पक हैं:एफ 6 पशुओं में GFP लाइनों. एक सरल विधि transgenesis की दरों में सुधार सह इंजेक्शन रोलर मार्कर (वर्तमान में 1 एनजी / pRL3 के μl 25-50 एनजी / pRF4 की सी एलिगेंस में μl तुलना में) की एकाग्रता बढ़ती जा रही है है.

आरएनएआई और transgenesis द्वारा organismal स्तर पर जीन समारोह में हेरफेर करने की क्षमता प्रौद्योगिकी के दोहरे स्तंभों कि सी. तरक्की कर रहे हैं कई अन्य मॉडल जीवों के ऊपर एलिगेंस . हमें उम्मीद है कि हमारे वर्तमान अध्ययन बहुत पी. बढ़ाने जाएगा pacificus transgenesis और आरएनएआई के लिए आसानी से सुलभ निर्देश प्रदान करके विकास और व्यवहार में आनुवांशिकी अध्ययन के लिए मॉडल .

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

लेखकों microinjection, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से गुमनाम समीक्षक से व्यावहारिक टिप्पणियों के साथ सहायता के लिए आरजे Sommer और एक्स वैंग बहुत आभारी हैं. इस काम NIH अनुदान SC2GM089602 द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMI3000 Injection microscope Leica Microsystems DMI3000
Microinjector manipulator (Direct drive) Tritech Research, Inc. Narashige BC-3 Ball joint
Needle Puller Tritech Research, Inc. Narashige PC-10
MicroInjector™ All-Digital Multi-pressure System Tritech Research, Inc. Narashige MINJ-D
GeneElute™Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit Sigma-Aldrich G1N70
pJet Cloning Jet kit Fermentas K1231
GeneJET plasmid Miniprep kit Fermentas K0502
DNA Clean & Concentrator™ Zymo Research Corp. D4005
BLOCK-IT™ RNAi TOPO® transcription kit Invitrogen K3500-01 & K3650-01
Difco™Agar Noble Fisher Scientific DF0142-15-2
Microscope cover glass (1.5 - 0.16 to 0.19mm thick; Size: 50 x 45mm) Fisher Scientific 12-554-F
Glass capillaries (filament) A-M Systems 615000
Paraffin Oil (Heavy) Fisher Scientific O122-1
KH2PO4 Fisher Scientific P386-500
Na2HPO4 Fisher Scientific AC20651-5000
NaCl Fisher Scientific BP3581
MgSO4 Fisher Scientific M80-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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विकास जीवविज्ञान 56 अंक शाही सेना हस्तक्षेप Pristionchus pacificus microinjection transgenesis, व्यवहार जीन अभिव्यक्ति
आरएनएआई जीन नॉकडाउन और Transgenesis मध्यस्थता Microinjection द्वारा Necromenic निमेटोड में<em> Pristionchus pacificus</em
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Cinkornpumin, J. K., Hong, R. L.… More

Cinkornpumin, J. K., Hong, R. L. RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus. J. Vis. Exp. (56), e3270, doi:10.3791/3270 (2011).

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