RNAi mediata Knockdown Gene e Transgenesi dalla microiniezione nel nematode Necromenic Pristionchus pacificus</em
Summary
In organismi modello, transgenesi in grado di manipolare le funzioni del gene, mentre RNAi può knockdown trascritti di mRNA specifico 1-2. Questo protocollo si propone di illustrare le tecniche necessarie per introdurre in modo stabile il DNA trasmessi e transitori di RNA a doppio filamento nel nematode necromenic<em> Pristionchus pacificus</em> Per gli studi in biologia evolutiva dello sviluppo, e comportamentali.
Abstract
Anche se è sempre più accessibili per gli organismi modello emergente di ottenere genomi completamente sequenziati, approfondita la funzione del gene e analisi di espressione di RNA interference e transgenesi stabile rimanere limitata in molte specie a causa della particolare anatomia e biologia cellulare molecolare dell'organismo. Per esempio, al di fuori del Caenorhabditis gruppo corona che comprende Caenorhabditis elegans 3, stabilmente trasmesse in linee transgeniche non Caenorhabditis specie non sono stati riportati in questo phylum specioso (Nematodi), con l'eccezione di Strongyloides stercoralis Pristionchus pacificus 4 e 5. Per facilitare il ruolo crescente del P. pacificus nello studio di sviluppo, l'evoluzione e il comportamento 6-7, si descrivono qui i metodi attuali di utilizzare microiniezione per la produzione degli animali transgenici e gene abbattere da RNAi. Come le gonadi di <em> C. elegans e la maggior parte di altri nematodi, le gonadi di P. pacificus è syncitial e capace di incorporare DNA e RNA in ovociti al momento della consegna da microiniezione diretta. A differenza di C. elegans tuttavia, l'ereditarietà transgene stabile e di espressione somatica in P. pacificus richiede l'aggiunta di DNA genomico digerito con endonucleasi di sé complementari alle estremità dei transgeni bersaglio e marcatori co-iniezione 5. L'aggiunta di DNA genomico vettore è analoga a quella prescritta per l'espressione del transgene in Strongyloides stercoralis 4 e nelle cellule germinali di C. elegans. Tuttavia, non è chiaro se il requisito specifico per il DNA genomico proprio gli animali 'è perché P. pacificus soma è molto efficiente a tacere non complessi multi-copia dei geni o che gli array extracromosomico in P. pacificus richiedono sequenze genomiche per l'assemblaggio cinetocoro corretto durante la mitosi. La migrazione ventrale dei due bracci (didelphic) gonadi in ermafroditi complica ulteriormente la possibilità di iniettare in entrambe le gonadi vermi individuale 8. Abbiamo anche dimostrare l'uso di microiniezione per knockdown un mutante dominante (rullo, tu92) iniettando RNA a doppio filamento (dsRNA) nelle gonadi di ottenere non rotolamento F 1 progenie. A differenza di C. elegans, ma come la maggior parte di altri nematodi, P. pacificus PS312 non è ricettivo a sistemico RNAi attraverso l'alimentazione e ammollo e quindi dsRNA deve essere somministrato con microiniezione nelle gonadi syncitial. In questo studio, speriamo di descrivere il processo di microiniezione necessari per trasformare un PPA-EGL-4 promotore:: reporter di fusione GFP e knockdown un rullo dominante PRL-1 (tu92) mutante in un protocollo visivamente informativo.
Protocol
Discussion
P. popolazioni pacificus si trovano in stretta associazione con varie specie scarabeo tutto il mondo ed è un nematode modello intermedio tra il vivere libero e nematodi parassiti. La forza del P. pacificus come organismo modello emergente laici nella integrazione delle sue mappe genetiche e fisiche che promuovono la mappatura della posizione di mutanti isolati da imparziali schermi in avanti genetico (cioè non solo per geni candidati precedentemente caratterizzato in C. elegans)…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono molto grati a RJ Sommer e X Wang per l'assistenza con microiniezione, così come i commenti penetranti dal revisori anonimi. Questo lavoro è supportato dal NIH concedere SC2GM089602.
Materials
| Product: | Catalog #: | Supplier: |
|---|---|---|
| DMI3000 Injection microscope | DMI3000 | Leica |
| Microinjector manipulator (Direct drive) | Narashige BC-3 Ball joint | Tritech Research |
| Needle Puller | Narashige PC-10 | Tritech Research |
| MicroInjector™ All-Digital Multi-pressure System | Narashige MINJ-D | Tritech Research |
| GeneElute™Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit | G1N70 | Sigma |
| pJet Cloning Jet kit | K1231 | Fermentas |
| GeneJET plasmid Miniprep kit | K0502 | Fermentas |
| DNA Clean & Concentrator™ | D4005 | ZYMO Research |
| BLOCK-IT™ RNAi TOPO® transcription kit | K3500-01 & K3650-01 | Invitrogen |
| Difco™Agar Noble | DF0142-15-2 | Fisher Scientifi |
| Microscope cover glass (1.5 – 0.16 to 0.19mm thick; Size: 50 x 45mm) | 12-554-F | Fisher Scientific |
| Glass capillaries (filament) | 615000 | A-M systems |
| Paraffin Oil (Heavy) | O122-1 | Fisher Scientific |
| KH2PO4 | P386-500 | Fisher Scientific |
| Na2HPO4 | AC20651-5000 | Fisher Scientific |
| NaCl | BP3581 | Fisher Scientific |
| MgSO4 | M80-500 | Fisher Scientific |
References
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