RNAi Mediated Gene Knockdown e Transgénese por microinjeção no Nematóides Necromenic Pristionchus pacificus</em
Summary
Em organismos modelo, transgenia pode manipular as funções dos genes, enquanto RNAi pode knockdown transcrições de mRNA específicas 1-2. Este protocolo visa ilustrar as técnicas necessárias para introduzir DNA transmitidas de maneira estável e transitórios RNA de filamento duplo para o nematóide necromenic<em> Pristionchus pacificus</em> Para estudos em biologia evolutiva, de desenvolvimento e comportamentais.
Abstract
Embora seja cada vez mais acessíveis para os organismos modelo emergente para obter genomas completamente seqüenciados, ainda mais em profundidade a função do gene e análises de expressão por RNA de interferência e transgênese estáveis permanecem limitados em muitas espécies, devido à anatomia e biologia celular molecular do organismo. Por exemplo, fora do grupo de Caenorhabditis coroa que inclui Caenorhabditis elegans 3, transmitidas de maneira estável em linhagens transgênicas não Caenorhabditis espécies não foram relatados neste filo especiosa (Nematoda), com exceção de Strongyloides stercoralis 4 e pacificus Pristionchus 5. Para facilitar a expansão do papel dos P. pacificus no estudo do desenvolvimento, evolução e comportamento 07/06, descrevemos aqui os métodos atuais de usar microinjeção para a tomada de animais transgênicos e gene knock down por RNAi. Como as gônadas de <em> C. elegans e mais outros nematóides, as gônadas de P. pacificus é sincicial e capaz de incorporar DNA e RNA para os oócitos, quando entregue por microinjeção direta. Ao contrário de C. elegans no entanto, a herança transgene estável e expressão somática em P. pacificus requer a adição de DNA genômico digerido com endonucleases auto complementares até os confins da transgenes alvo e marcadores coinjection 5. A adição de DNA genômico transportadora é similar à exigência de expressão do transgene em Strongyloides stercoralis 4 e nas células germinativas de C. elegans. No entanto, não está claro se o requisito específico para o DNA dos animais genômica própria é porque P. pacificus soma é muito eficiente para o silenciamento não-complexo multi-cópia genes ou que arrays extracromossómicos em P. pacificus requerem seqüências genômicas para a montagem cinetocoro adequada durante a mitose. A migração ventral do (dois braçosdidelfo) em gônadas hermafroditas complica ainda mais a capacidade de injetar tanto em gônadas worms individuais 8. Nós também demonstrar o uso de microinjeção para knockdown um mutante dominante (rolo, tu92) injetando double-stranded RNA (dsRNA) para as gônadas para obter não rolando F uma progênie. Ao contrário de C. elegans, mas como a maioria dos outros nematóides, P. pacificus PS312 não é receptivo a RNAi sistêmica através de alimentação e de imersão e, portanto, dsRNA deve ser administrado por microinjeção para as gônadas sincicial. No presente estudo, esperamos para descrever o processo de microinjeção necessárias para transformar um promotor Ppa-egl-4:: GFP repórter de fusão e knockdown um rolo dominante PRL-1 (tu92) mutante em um protocolo visualmente informativo.
Protocol
Discussion
Populações de P. pacificus são encontrados em estreita associação com espécies de escaravelho vários besouro todo o mundo e é um modelo intermediário entre o nematóide de vida livre e nematóides parasitas. A força do P. pacificus como um organismo modelo emergente reside na integração de seus mapas genéticos e físicos que promovem o mapeamento posicional de mutantes isolados de telas imparcial frente genética (ou seja, não apenas por genes candidatos previamente caracterizada…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores são muito gratos ao RJ Sommer e Wang X para obter ajuda com microinjeção, bem como comentários perspicaz dos revisores anônimos. Este trabalho é apoiado por NIH conceder SC2GM089602.
Materials
| Product: | Catalog #: | Supplier: |
|---|---|---|
| DMI3000 Injection microscope | DMI3000 | Leica |
| Microinjector manipulator (Direct drive) | Narashige BC-3 Ball joint | Tritech Research |
| Needle Puller | Narashige PC-10 | Tritech Research |
| MicroInjector™ All-Digital Multi-pressure System | Narashige MINJ-D | Tritech Research |
| GeneElute™Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit | G1N70 | Sigma |
| pJet Cloning Jet kit | K1231 | Fermentas |
| GeneJET plasmid Miniprep kit | K0502 | Fermentas |
| DNA Clean & Concentrator™ | D4005 | ZYMO Research |
| BLOCK-IT™ RNAi TOPO® transcription kit | K3500-01 & K3650-01 | Invitrogen |
| Difco™Agar Noble | DF0142-15-2 | Fisher Scientifi |
| Microscope cover glass (1.5 – 0.16 to 0.19mm thick; Size: 50 x 45mm) | 12-554-F | Fisher Scientific |
| Glass capillaries (filament) | 615000 | A-M systems |
| Paraffin Oil (Heavy) | O122-1 | Fisher Scientific |
| KH2PO4 | P386-500 | Fisher Scientific |
| Na2HPO4 | AC20651-5000 | Fisher Scientific |
| NaCl | BP3581 | Fisher Scientific |
| MgSO4 | M80-500 | Fisher Scientific |
References
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