RNAi mediada por derribo de genes y transgénesis por microinyección en el nematodo Necromenic Pristionchus pacificus</em
Summary
En organismos modelo, la transgénesis pueden manipular las funciones de genes, mientras que el ARNi puede caída transcripciones de ARNm específico de 1-2. Este protocolo tiene como objetivo ilustrar las técnicas necesarias para introducir ADN transmitido de forma estable y transitoria de ARN de doble cadena en el nemátodo necromenic<em> Pristionchus pacificus</em> Para los estudios de la biología evolutiva, de desarrollo y comportamiento.
Abstract
A pesar de que es cada vez más asequibles para los organismos modelo emergente para obtener genomas secuenciados completamente, más a fondo la función de genes y análisis de expresión de ARN de interferencia y la transgénesis estable siguen siendo limitados en muchas especies debido a la anatomía particular y la biología molecular celular del organismo. Por ejemplo, en las afueras de la corona Caenorhabditis grupo que incluye Caenorhabditis elegans 3, de forma estable de transmisión en las líneas transgénicas no Caenorhabditis especies no han sido reportados en este phylum engañosa (Nematoda), con la excepción de Strongyloides stercoralis 4 y 5 Pristionchus pacificus. Para facilitar la ampliación del papel de P. pacificus en el estudio del desarrollo, la evolución y el comportamiento de 6-7, se describe aquí los métodos actuales para el uso de microinyección para la fabricación de animales transgénicos y knock por RNAi. Al igual que las gónadas de los <em> C. elegans y la mayoría de otros nematodos, las gónadas de P. pacificus es sincitial y capaz de incorporar el ADN y ARN en los ovocitos cuando se entrega por microinyección directa. A diferencia de C. elegans Sin embargo, la herencia del transgén estable y la expresión somática en P. pacificus requiere la adición de ADN genómico digerido con endonucleasas auto complementario a los extremos de los transgenes blanco y marcadores coinyección 5. La adición de ADN genómico de transporte es similar a la necesidad de expresión del transgen en Strongyloides stercoralis 4 y en las células germinales de C. elegans. Sin embargo, no está claro si el requisito específico de ADN de los animales genómica propia se debe a P. pacificus soma es muy eficiente en el silenciamiento no complejos multi-copia genes o conjuntos de extracromosómico en P. pacificus requieren secuencias genómicas para el montaje adecuado cinetocoro durante la mitosis. La migración ventral de la (de dos brazosdidelphic) en las gónadas hermafroditas complica aún más la capacidad de inyectar ambas gónadas en los gusanos individual 8. También demostrar el uso de microinyección para derribar un mutante dominante (rodillo, tu92) mediante la inyección de ARN de doble cadena (dsRNA) en las gónadas para obtener información no rodar progenie F 1. A diferencia de C. elegans, pero como la mayoría de otros nematodos, P. pacificus PS312 no es receptiva a RNAi sistémico a través de la alimentación y el remojo y por lo tanto dsRNA debe ser administrado por microinyección en las gónadas sincitial. En este estudio, esperamos que para describir el proceso de microinyección necesarias para transformar un promotor PPA-EGL-4:: reportero GFP fusión y caída de un rodillo dominante prl-1 (tu92) mutante en un protocolo informativo visual.
Protocol
Discussion
Las poblaciones de P. pacificus se encuentran en estrecha relación con varias especies de escarabajo en todo el mundo y es un modelo intermedio entre los nematodos de vida libre y nematodos parásitos. La fuerza de la P. pacificus como un organismo modelo emergente radica en la integración de sus mapas genéticos y físicos que promuevan la asignación de posición de los mutantes aislados imparcial pantallas adelante genéticos (es decir, no sólo por los genes candidatos previamen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores están muy agradecidos a RJ Sommer y Wang X para obtener ayuda con microinyección, así como de las perspicaces observaciones de los revisores anónimos. Este trabajo es apoyado por el NIH subvención SC2GM089602.
Materials
| Product: | Catalog #: | Supplier: |
|---|---|---|
| DMI3000 Injection microscope | DMI3000 | Leica |
| Microinjector manipulator (Direct drive) | Narashige BC-3 Ball joint | Tritech Research |
| Needle Puller | Narashige PC-10 | Tritech Research |
| MicroInjector™ All-Digital Multi-pressure System | Narashige MINJ-D | Tritech Research |
| GeneElute™Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit | G1N70 | Sigma |
| pJet Cloning Jet kit | K1231 | Fermentas |
| GeneJET plasmid Miniprep kit | K0502 | Fermentas |
| DNA Clean & Concentrator™ | D4005 | ZYMO Research |
| BLOCK-IT™ RNAi TOPO® transcription kit | K3500-01 & K3650-01 | Invitrogen |
| Difco™Agar Noble | DF0142-15-2 | Fisher Scientifi |
| Microscope cover glass (1.5 – 0.16 to 0.19mm thick; Size: 50 x 45mm) | 12-554-F | Fisher Scientific |
| Glass capillaries (filament) | 615000 | A-M systems |
| Paraffin Oil (Heavy) | O122-1 | Fisher Scientific |
| KH2PO4 | P386-500 | Fisher Scientific |
| Na2HPO4 | AC20651-5000 | Fisher Scientific |
| NaCl | BP3581 | Fisher Scientific |
| MgSO4 | M80-500 | Fisher Scientific |
References
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