Summary
इस कागज विच्छेदन की प्रक्रिया का विवरण, वाद्य सेटअप, transmembrane (VM) बरकरार पृथक Langendorff में और intracellular क्षणिक कैल्शियम (कैट) क्षमता ऑप्टिकल मानचित्रण के दौरान और प्रयोगात्मक शर्तों माउस दिल perfused.
Abstract
माउस दिल हृदय इस प्रजाति में जेनेटिक इंजीनियरिंग के लिए कम लागत प्रौद्योगिकी के अस्तित्व के कारण अध्ययन के लिए एक लोकप्रिय मॉडल है. माउस दिल के हृदय शारीरिक phenotyping प्रतिदीप्ति इमेजिंग का उपयोग transmembrane क्षमता के लिए विभिन्न जांच (वी मीटर), कैल्शियम (कैट), यात्रियों और अन्य मानकों को रोजगार आसानी से किया जा सकता है. उत्तेजना - संकुचन युग्मन कार्रवाई क्षमता और intracellular कैल्शियम की गतिशीलता के द्वारा विशेषता है, इसलिए यह महत्वपूर्ण है दोनों वी मीटर और कैट 1-4 दिल पर एक ही स्थान से एक साथ नक्शा. Langendorff से एक साथ ऑप्टिकल मानचित्रण perfused माउस दिल संभावित दिल की विफलता, अतालता, चयापचय रोग, और अन्य हृदय रोग के अंतर्निहित तंत्र स्पष्ट है. सक्रियण के विज़ुअलाइज़ेशन, चालन वेग, कार्रवाई संभावित अवधि, और साइटों की एक असंख्य अन्य पैरामीटर के सेलुलर स्तर की जांच से हासिल नहीं कर सकते हैं लेकिन अच्छी तरह से ऑप्टिकल 1,5,6 मानचित्रण द्वारा हल है. इस पत्र में हम माउस दिलों में एक साथ ऑप्टिकल वी मीटर और बिल्ली के उच्च spatio-अस्थायी राज्य के कला CMOS इमेजिंग तकनीक का उपयोग संकल्प के साथ मानचित्रण के लिए मौजूद इंस्ट्रूमेंटेशन सेटअप और प्रयोगात्मक शर्तों अनुरूप ऑप्टिकल इस विधि के साथ प्राप्त की रिकॉर्डिंग वर्णन Langendorff perfused माउस दिलों की है कि एक साथ ऑप्टिकल मानचित्रण दोनों संभव और विश्वसनीय है.
Protocol
1. शेयर समाधान के उन्नत तैयारी
- विआयनीकृत जल में अग्रिम में दो Tyrode समाधान (16x) के शेयर समाधान तैयार है और उन्हें 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस:
- शेयर मैं (119.872 छ / एल NaCl, 3.056 छ / एल 2 CaCl (2H 2 हे), 5.6 छ / एल KCl, 2.6274 छ / एल 2 नाह पीओ 4, 3.408 छ / एल 2 MgCl (6 2 हे), (फिशर वैज्ञानिक, फेयर लॉन न्यू जर्सी,));
- स्टॉक द्वितीय (26.88 छ / एल NaHCO3, (फिशर साइंटिफिक, फेयर लॉन, न्यू जर्सी)).
- फ्लोरोसेंट रंजक के शेयर समाधान तैयार. दोहराया ठंड और विगलन से बचने के लिए, हम ° -20 सी, जो एक प्रयोग के लिए पर्याप्त है पर दोनों रंगों के 30 μl aliquots की दुकान:
- वोल्ट के प्रति संवेदनशील डाई RH237 (Invitrogen, Carlsbad, CA) शेयर समाधान डाइमिथाइल sulfoxide में 1.25 मिलीग्राम / एमएल समाधान (DMSO, सिग्मा, सेंट लुइस, MO);
- कैल्शियम सूचक Rhod 02:00 (Invitrogen, Carlsbad, CA) शेयर समाधान, 1 मिलीग्राम / एमएल समाधान DMSO में.
- उत्तेजना - संकुचन uncoupler blebbistatin शेयर समाधान तैयार (बायोसाइंस Tocris, सेंट लुइस, MO, 2 मिलीग्राम / एमएल समाधान DMSO में) अग्रिम में और 4 में भंग blebbistatin दुकान डिग्री सेल्सियस
2. छिड़काव समाधान और प्रयोगात्मक सेटअप 7 तैयार
- हौसले 2L है Tyrode समाधान तैयार (128.2mM NaCl, 1.3mm 2 CaCl (2H 2 हे), 4.7mM KCl, 1.05mM MgCl 2 (6 2 हे), 1.19mM 2 नाह पीओ 4, 20mm 3 NaHCO, 11.1mM डी ग्लुकोज विआयनीकृत जल, पीएच में = 7.35 ± 0.05). अगर शेयर समाधान Tyrode (एक प्रयोग के लिए पर्याप्त) समाधान के शेयर मैं, स्टॉक द्वितीय के 125 एमएल के 125 एमएल में विआयनीकृत पानी और मिश्रण के 1750 एमएल ले, और ग्लूकोज की 4g के 2L बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है.
- छिड़काव प्रणाली के दो पंप पर मुड़ें. कि 40 एमएल / मिनट के लिए प्रतिगामी छिड़काव के लिए प्रयोग किया जाता है क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप (पेरी - स्टार, थोक मूल्य सूचकांक, Sarasota, संयुक्त राज्य अमरीका) सेट. अन्य क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप (कोल-Parmer Masterflex Peristalic पम्प एल / एस, साधन कोल-Parmer कंपनी, Vernon हिल्स, इलिनोइस) है कि superfusion के लिए प्रयोग किया जाता है सेट और perfusate वापस जोत जलाशय 80 एमएल / मिनट लौटने.
- 30 मिनट और 2L विआयनीकृत जल के साथ तो के लिए 70% इथेनॉल के साथ छिड़काव प्रणाली धो लें.
- एक बार सभी विआयनीकृत जल चैम्बर से खाली है, Tyrode समाधान प्रसारित और यह एक 5-सुक्ष्ममापी फिल्टर (Millipore, Billerica, MA, संयुक्त राज्य अमरीका) के माध्यम से पारित. 37 के लिए perfusate गर्म ° सी के साथ एक पानी की जैकेट और फैलानेवाला (EX7 ThermoNESLAB, Newtown, संयुक्त राज्य अमेरिका) समाधान में 2 हे / सीओ 2 गैस (95% / 5%) बुदबुदाती द्वारा और आक्सीजन के साथ मिलना perfusate. एक pH मीटर (Oakton उपकरण, Vernon हिल्स, आईएल) के साथ मॉनिटर समाधान के पीएच और 2 हे / 2 बुदबुदाती सीओ की दर को समायोजित करने के लिए 7.35 ± 0.05 पर पीएच रखना. प्रयोग के दौरान निगरानी pH और तापमान जारी रखें.
- दोहरी ऑप्टिकल मानचित्रण तंत्र दो MiCAM चरम एल CMOS कैमरों (SciMedia, कोस्टा Mesa, CA) है कि उच्च स्थानिक (100x100 पिक्सेल, 230 ± पिक्सेल प्रति 20 सुक्ष्ममापी) और लौकिक संकल्प (1,000-3,000 फ्रेम / सेक) के होते हैं. नामित कैल्शियम इमेजिंग कैमरे के सामने में एक बैंड पास फिल्टर (590 ± 15 एनएम, Thorlabs, न्यूटन, NJ) फिक्स, जबकि, एक लंबे पास फिल्टर (> 700 एनएम, Thorlabs, न्यूटन, न्यू जर्सी) में तैनात किया जा आवश्यकता नामित वोल्टेज इमेजिंग कैमरे के सामने. कैमरों एक धारक है, जो एक dichroic दर्पण (635 एनएम cutoff, ओमेगा ऑप्टिकल, Brattleboro, VT) शामिल द्वारा एक दूसरे से सीधा व्यवस्था कर रहे हैं. दोहरी कैमरा धारक नीचे तुरंत वहाँ एक (Nikon NIKKOR 55 मिमी 1:1.4 235,052) लेंस, जो उत्सर्जन प्रकाश ध्यान केंद्रित dichroic दर्पण पर दिल से आ रहा है. काम दूरी लगभग 3cm है.
उत्तेजना प्रकाश एक हलोजन दीपक (न्यूपोर्ट गढ़ा उपकरण, स्ट्रैटफ़ोर्ड, सीटी, SciMedia, कोस्टा Mesa, CA के) द्वारा उत्पन्न की है और एक गर्मी फिल्टर, शटर, और बैंड पास फिल्टर (520 ± 45 एनएम) के माध्यम से पारित कर दिया है. एक लचीला प्रकाश गाइड निर्देश बैंड पास तैयारी पर फ़िल्टर्ड प्रकाश, और एक शटर करने के लिए सुनिश्चित करें कि तैयारी छवि अधिग्रहण के दौरान ही प्रकाश के रंगों की photobleaching से बचने के लिए संपर्क में है प्रयोग किया जाता है. - पेसिंग और अग्रिम में संवेदन के लिए एजी / AgCl 2 इलेक्ट्रोड तैयार है और उन्हें पहले दिल रखने के लिए कक्ष में स्थापित है. सुनिश्चित करें कि एम्पलीफायरों और फिल्टर उपयुक्त स्तर को समायोजित कर रहे हैं.
3. माउस दिल हार्वेस्ट, cannulate, और Langendorff छिड़काव सेट
- Anesthetize और intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा हेपरिन (100 इकाइयों), ketamine / xylazine (xylazine, 10 bodyweight मिलीग्राम / किग्रा ketamin, 80mg/kg bodyweight) के साथ माउस. दर्द प्रतिवर्त की कमी के द्वारा संज्ञाहरण के उचित स्तर का आश्वासन.
- मध्य sternal चीरा के बाद, जल्दी दिल को हटाने और यह oxygenated में धो (95% 2 हे, 5% सीओ 2) के लिए, लगातार तापमान (37 ± 1 ° सी) Tyrode समाधान.
- एक विदारक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोगतेजी से महाधमनी पहचान करने और सही अवजत्रुकी धमनी नीचे आरोही महाधमनी भर में एक साफ काट कर. महाधमनी का एक संक्षिप्त अनुभाग तो एक कस्टम से जुड़ा हुआ है एक flared टिप के साथ 21 गेज प्रवेशनी बना दिया. 4-0 काले लट रेशम सीवन (सर्जिकल विशेषता निगम, पढ़ना, फिलीस्तीनी अथॉरिटी) प्रवेशनी पर दिल को ठीक करने के लिए प्रयोग किया जाता है. केन्युलेशन के बाद, दिल प्रतिगमनपूर्वक और perfused Tyrode समाधान के साथ superfused. ब्रिज प्रवर्धक TBM4M, थोक मूल्य सूचकांक, Sarasota, प्रतिगामी छिड़काव दर 2-5 एमएल / मिनट महाधमनी दबाव के बीच 60 और 80 mmHg (दबाव transducer, विश्व परिशुद्धता उपकरण इंक (डब्ल्यूपीआई), Sarasota, संयुक्त राज्य अमरीका रखने की सीमा में समायोजित किया जाता है संयुक्त राज्य अमरीका).
- बाद दिल cannulated है, फेफड़ों, थाइमस, और वसा ऊतकों और फिर dissected हटा रहे हैं.
- पृथक दिल (ललित विज्ञान उपकरण) छिड़काव कक्ष के नीचे करने के लिए सुप्रीम (Sylgard लेपित) धारा प्रेरित आंदोलन को रोकने पर टिकी है. सही और बाएं आलिंद उपांग भी फैला रहे हैं और कक्ष है, जो atria ऑप्टिकल मापन के लिए अधिक से अधिक सतह क्षेत्र प्रदान करता है के नीचे करने के लिए टिकी (ललित विज्ञान उपकरण, इंक, फोस्टर शहर, सीए).
बहुत महत्वपूर्ण है एक छोटे सिलिकॉन ट्यूब बाएं वेंट्रिकल में फुफ्फुसीय नसों के माध्यम से डाला जाता है और रेशम सीवन द्वारा पास के संयोजी ऊतक करने के लिए तय! . यह समाधान और बाएं वेंट्रिकल है, जो एक uncoupler उत्तेजना - संकुचन के साथ निलय संकुचन के दमन के बाद विशेष रूप से महत्वपूर्ण है (भाग 4 19 कदम देखें) में फंस perfusate की भीड़ अम्लीकरण रोकता है. - एक कस्टम बनाया इलेक्ट्रोड दिल की सतह पर रखा गया है पेसिंग stimulations, जो मास्टर (एएमपी उपकरण लिमिटेड, यरूशलेम, इजराइल)-8 या PowerLab 26T (ई. उपकरण, सिडनी, ऑस्ट्रेलिया) के द्वारा उत्पन्न होता है आचरण.
- एक छोटा सा कवर गिलास हिल समाधान से गति artifact के कम दिल पर समाधान की सतह पर तय हो गई है.
- उत्तेजना प्रकाश दिल पर ध्यान दें. इसके अलावा, दोहरी कैमरा तंत्र और हृदय इतना है कि अधिकतम संकल्प प्राप्त हो जाएगा के बीच की दूरी समायोजित करें.
- बंद कमरे में सभी रोशनी चालू करने और बिजली PowerLab 26T का उपयोग कर रिकॉर्डिंग शुरू.
4. लोड वोल्टेज और कैल्शियम संवेदनशील रंगों और उत्तेजना - संकुचन uncoupler
- वार्म अप blebbistatin की 0.6 एमएल. पकड़े जलाशय में perfusate साथ blebbistatin के 0.5 एमएल मिक्स. Tyrode समाधान के 1 एमएल में blebbistatin की शेष 0.1 एमएल पतला और धीरे धीरे यह एक दवा प्रवेशनी के निकट स्थित पोर्ट के माध्यम से (एक 20 मिनट की अवधि से अधिक) इंजेक्षन. निरीक्षण के रूप में blebbistatin धीरे धीरे गति artifact के कम कर देता है.
- वोल्टेज संवेदनशील डाई RH237 1 एमएल Tyrode समाधान में शेयर समाधान के 30 μL पतला और धीरे धीरे blebbistatin रूप में एक ही इंजेक्शन पोर्ट में 5-7 मिनट से अधिक इंजेक्षन.
- 30 μL कैल्शियम सूचक Rhod-2 AM 01:01 Pluronic F127 (Invitrogen, Carlsbad, CA, DMSO में 20% समाधान) के साथ मिलाया और फिर 1 एमएल Tyrode समाधान में पतला और धीरे धीरे एक ही इंजेक्शन बंदरगाह के माध्यम से 5-10 मिनट पर लागू है .
- Blebbistatin और कोशिका झिल्ली और cytosol तक पहुँचने के लिए रंजक के लिए 5-10 मिनट के लिए रुको. प्रोटोकॉल जब गति पूरी तरह से दबा दिया है के साथ जारी रखें.
- लगातार मॉनिटर पूरी प्रक्रिया पर ईसीजी रिकॉर्डिंग दिल की सामान्य विद्युत समारोह को आश्वस्त करने के लिए.
- फ्लोरोसेंट संकेत SciMedia कस्टम सॉफ्टवेयर (SciMedia, कोस्टा Mesa, CA) का उपयोग करते हुए रिकॉर्डिंग शुरू करो.
5. प्रतिनिधि परिणाम:
चित्रा 1 छिड़काव, बिजली रिकॉर्डिंग और ऑप्टिकल मानचित्रण के लिए प्रायोगिक सेटअप .
EM = उत्सर्जन, एल.पी. = longpass
चित्रा 2 प्रायोगिक तैयारी और संकेत उदाहरण वेंट्रिकुलर पेसिंग के दौरान दर्ज की. वाम: ईसीजी संकेत / एजी AgCl 2 डिस्क (शीर्ष) इलेक्ट्रोड और S1S1 उत्तेजना प्रोटोकॉल का एक उदाहरण दिखाया (नीचे) से एकत्र कर रहे हैं. केंद्र: Langendorff माउस दिल तैयारी. अधिकार: प्रतिनिधि ऑप्टिकल कार्रवाई क्षमता और (शीर्ष) आलिंद और निलय (नीचे) से कैल्शियम क्षणिक संकेतों से पता चला रहे हैं. पीले तीर (शीर्ष) फ्लोरोसेंट संकेत निलय, जो atrial रिकॉर्डिंग में देखा जाता है से आ रही है बिखरने के लिए अंक.
एल.वी. = बाएं वेंट्रिकल; आर.वी. अधिकार = निलय, ला = छोड़ दिया atrium, आरए = सही atrium
चित्रा 3 वी मीटर और एक जंगली प्रकार माउस दिल की निलय से बिल्ली के प्रतिनिधि ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग. ए काले डॉट्स ऑप्टिकल जिनकी रिकॉर्डिंग (सी) में देखा जा सकता है के द्वारा समान रूप से स्थान चिह्नित स्थानों की एक सरणी के साथ प्रयोगात्मक तैयारी. मैं सरणी पर एक केंद्रीय स्थान से बी उदाहरण वी मीटर और कैट की अनुरेखण (देखें बॉक्सn (सी)). सी. वी मीटर (नीला) और कैट (लाल) के समान रूप से स्थान स्थानों की सरणी से . सिग्नल 3x3 binned थे.
चित्रा 4 सक्रियकरण नक्शा और प्रवाहकत्त्व. अनुप्रस्थ (टी) और अनुदैर्ध्य (एल) सफेद तीर द्वारा संकेत दिशाओं के साथ एक जंगली प्रकार माउस दिल से एक उदाहरण सक्रियण नक्शा. बी वी मीटर (शीर्ष) संकेतों और DV / dt (नीचे) तीन अंक में देखा करने के लिए इसी ए (T1, टी 2, T3, L1, L2, L3).
5 चित्रा लड़ाई की क्षमता और कैल्शियम क्षणिक अवधि विश्लेषण. 80% (APD80) 80% छूट (CaD80) और कैल्शियम क्षणिक अवधि repolarization ए कार्रवाई संभावित अवधि के नक्शे नियंत्रण की शर्तों के तहत एक दिल (बाएं) और 30 एनएम isoproterenol आवेदन (सही) के बाद से दिखाए जाते हैं. निलय में पीले / हरे रंग (अधिकार) यह इंगित करता है isoproterenol APD80 और CaD80 छोटा. जंगली प्रकार माउस (ऊपर) ventricles और atria (नीचे) से बी उदाहरण APD80 और CaD80 के tracings.
Discussion
इस प्रयोग में हम एक छोटे से सिलिकॉन ट्यूब, जो एक uncoupler उत्तेजना - संकुचन के साथ निलय संकुचन के दमन के बाद विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जोड़कर Langendorff छिड़काव विधि संशोधित. सिलिकॉन ट्यूब समाधान भीड़, छिड़काव समाधान के अम्लीकरण, और ischemia के बाएं वेंट्रिकल में विकास को रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है. माउस दिल बहुत हाइपोथर्मिया के प्रति संवेदनशील है, इस प्रकार, दिल भर में तापमान भिन्नरूपों कार्रवाई संभावित durations में कृत्रिम मतभेद का कारण होगा. नतीजतन, एक हीटिंग सिस्टम छिड़काव कक्ष में लागू किया गया था, के क्रम में आठ प्रयोग की सम्पूर्णता के दौरान 37 डिग्री सेल्सियस के एक निरंतर तापमान बनाए रखने. के बाद से एक Langendorff मॉडल दिल की स्फूर्तिदान नहीं रख करता है, एक perfusate के लिए न्यूरोट्रांसमीटर जोड़ने पर विचार के क्रम में शारीरिक सहानुभूति और parasympathetic 9 टोन की जांच की जरूरत है. प्रतिगामी छिड़काव के अलावा, दिल की superfusion के अलावा pH और तापमान के रूप में में उपयुक्त पर्यावरणीय मानकों को बनाए रखने में मदद करता है. इस विधि में, Langendorff perfused दिल क्षैतिज रखा गया था. एक ऊर्ध्वाधर Langendorff छिड़काव सेटअप भी 10 इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन थोड़ा अलग हृदय 11 यांत्रिकी में परिणाम हो सकता है. CMOS कैमरों के अलावा, वैकल्पिक डिटेक्टरों भी उपलब्ध हैं और नक्शा वी मीटर और एक साथ कैट 12 के लिए लागू किया जा सकता.
Spatio-अस्थायी उच्च संकल्प CMOS कैमरों के आवेदन रिकॉर्डिंग की सटीकता का आश्वासन दिया है, तथापि, ऑप्टिकल मानचित्रण संकेतों को किसी एकल कक्ष से नहीं हैं. बल्कि, प्रत्येक फ्लोरोसेंट संकेत कोशिकाओं के सैकड़ों या हजारों से आता है, ऑप्टिकल बढ़ाई पर निर्भर करता है. बहुत बड़ा निलय प्रतिदीप्ति ऑप्टिकल बिखरने से atrial संकेतों को विकृत कर सकते हैं, इसलिए, ऑप्टिकली दर्ज संकेतों के सावधान व्याख्या की आवश्यकता है. माउस की तैयारी के संकेत विरूपण और शोर 13 दिल के छोटे आकार के कारण सतह वक्रता द्वारा प्रेरित एक और सीमा है. चालन वेग माप माउस दिल की वक्रता से न केवल लेकिन यह भी इलेक्ट्रोड polarity और आभासी इलेक्ट्रोड से बदला जा सकता है. चालन वेग, सक्रियण anisotropy, और repolarization नक्शे के लिए सटीकता प्राप्त करने के लिए, कैमरे के दिल की सतह पर ध्यान केंद्रित सही आवश्यक है.
इस विधि में, वास्तविक समय ईसीजी रिकॉर्डिंग ऑप्टिकल हृदय इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी की जांच के पूरक कर सकते हैं. वोल्ट के प्रति संवेदनशील (RH237) डाई और कैल्शियम सूचक (Rhod - 02:00) प्रोटोकॉल, इसी तरह की उत्तेजना, और उनके तेजी से प्रतिक्रिया की वजह से अलग उत्सर्जन स्पेक्ट्रा 3,7 में उपयोग किया जाता है. रंजक है कि वी मीटर और RH237 की तुलना में अन्य बिल्ली और Rhod - 02:00 3 मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के वैकल्पिक संयोजन कर रहे हैं. एक उपन्यास वोल्टेज के प्रति संवेदनशील डाई, एक बड़े स्टोक बदलाव (200nm>) के साथ PGHI, बेहतर वी और PGHI और Rhod - 2:00 14 के बीच उत्सर्जन तरंगदैर्य की अधिक से अधिक जुदाई की वजह से मीटर CaT संकेतों की अनुमति पाया गया था. भविष्य सुधार उपन्यास फ्लोरोसेंट जांच, नया इमेजिंग डिटेक्टरों के विकास, और बेहतर छवि संसाधन सॉफ्टवेयर की खोज पर ध्यान केंद्रित कर सकते हैं. उच्च संकल्प और उपन्यास ऑप्टिकल 3 डी मानचित्रण के लिए ऑप्टिकल इमेजिंग रूपात्मकता भी कर रहे हैं ऑप्टिकल 5 मानचित्रण महत्वपूर्ण भविष्य दिशाओं हैं.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
एनआईएच HL085369 R01 अनुदान.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | |
| RH237 | Invitrogen | S1109 | |
| Rhod-2AM | Invitrogen | R1244 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| PowerLab 26T |  ADInstruments |
References
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