Summary
Dit document beschrijft de dissectie procedure, instrumentale setup, en de experimentele omstandigheden tijdens de optische in kaart brengen van de transmembraan potentiaal (Vm) en intracellulair calcium van voorbijgaande aard (CAT) in intacte geïsoleerde Langendorff doorbloed muis harten.
Abstract
De muis hart is een populair model voor cardiovasculaire studies te wijten aan het bestaan van goedkope technologie voor genetische manipulatie in deze soort. Hart-en fysiologische fenotypering van de muis hart kan eenvoudig worden gedaan met behulp van fluorescentie beeldvorming in dienst verschillende sondes voor transmembraan potentiaal (V m), calcium transiënten (CAT), en andere parameters. Excitatie-contractie koppeling wordt gekenmerkt door een actiepotentiaal en intracellulair calcium dynamiek, daarom is het uitermate belangrijk om tegelijkertijd zowel de kaart V m en Cat vanaf dezelfde locatie op het hart 1-4. Gelijktijdige optische afbeelding van Langendorff doorbloed muis harten heeft de potentie om mechanismen die ten grondslag liggen aan hartfalen, hartritmestoornissen, metabole ziekten en andere hart-en vaatziekten toe te lichten. Visualisatie van activering, kan geleidingssnelheid, actiepotentiaal duur en andere parameters in een groot aantal sites niet worden bereikt met cellulair niveau onderzoek, maar is goed opgelost door het in kaart brengen van optische 1,5,6. In deze paper presenteren we de instrumentatie setup en experimentele omstandigheden voor het gelijktijdig optische in kaart brengen van V m en Kat in de muis harten met een hoge spatio-temporele resolutie met behulp van state-of-the-art CMOS-imaging-technologie. Consistente optische opnamen verkregen met deze methode te illustreren dat de gelijktijdige optische in kaart brengen van Langendorff geperfuseerde muis harten is haalbaar en betrouwbaar is.
Protocol
1. Geavanceerde bereiding van de stam oplossingen
- Bereid twee voorraad oplossingen van de oplossing Tyrode's (16x), van te voren in gedeïoniseerd water en ze op te slaan 4 ° C:
- Stock I (119,872 g / L NaCl, 3,056 g / L CaCl 2 (2H 2 O), 5,6 g / L KCl, 2,6274 g / L NaH 2 PO 4, 3,408 g / L MgCl 2 (6H 2 O), (Fisher wetenschappelijke, Fair Lawn, NJ));
- Stock II (26,88 g / L NaHCO3, (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)).
- Bereid voorraad oplossingen van fluorescerende kleurstoffen. Om te voorkomen dat herhaaldelijk bevriezen en ontdooien, slaan we 30 ul fracties van beide kleurstoffen bij -20 ° C, wat voldoende is voor een experiment:
- Voltage-gevoelige kleurstof RH237 (Invitrogen, Carlsbad, CA) stock-oplossing, 1,25 mg / ml oplossing in dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma, St. Louis, MO);
- Calcium indicator Rhod-2AM (Invitrogen, Carlsbad, CA) stock-oplossing, 1 mg / ml oplossing in DMSO.
- Bereid excitatie-contractie ontkoppelrail blebbistatin stockoplossing (Tocris Bioscience, St. Louis, MO, 2 mg / ml oplossing in DMSO) vooraf en opslaan van de opgeloste blebbistatin bij 4 ° C.
2. Bereid perfusie-oplossingen en experimentele opstelling 7
- Vers voor te bereiden 2L Tyrode de oplossing (128.2mM NaCl, 1,3 mm CaCl 2 (2H 2 O), 4.7mM KCl, MgCl 1.05mM 2 (6H 2 O), 1.19mM NaH 2 PO 4, 20mm NaHCO 3, 11,1 mm D-Glucose in gedeïoniseerd water, pH = 7,35 ± 0,05). Als voorraad oplossing wordt gebruikt om 2L oplossing Tyrode's (voldoende voor een experiment) te nemen 1750 ml gedeïoniseerd water en meng in 125 ml op voorraad I, 125 ml van Stock II, en 4g van glucose.
- Zet de twee pompen van de perfusie-systemen. Stel de peristaltische pomp (Peri-Star, WPI, Sarasota, USA) die wordt gebruikt voor retrograde perfusie tot 40 ml / min. Stel de andere peristaltische pomp (Cole-Parmer Masterflex Peristalic Pomp L / S, Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, Illinois) die wordt gebruikt voor superfusie en om het perfusaat terug te keren naar de holding reservoir tot 80 ml / min.
- Was de perfusie-systeem met 70% ethanol gedurende 30 minuten en dan met 2L gedeïoniseerd water.
- Zodra alle gedemineraliseerd water wordt afgevoerd uit de kamer, circuleren van de Tyrode de oplossing en het door een 5-um filter (Millipore, Billerica, MA, USA) passeren. Warm het perfusaat tot +37 ° C met een watermantel en circulatiepomp (ThermoNESLAB EX7, Newtown, USA) en zuurstof het perfusaat door borrelen O 2 / CO 2 (95% / 5%) gas in de oplossing. Monitor de pH van de oplossing met een pH-meter (Oakton Instruments, Vernon Hills, IL) en pas de snelheid van O 2 / CO 2 borrelen om de pH te houden op 7,35 ± 0,05. Blijven volgen pH en temperatuur tijdens het experiment.
- De dubbele optische kaart brengen apparaat bestaat uit twee Micam Ultima-L CMOS-camera's (SciMedia, Costa Mesa, CA), die een hoge ruimtelijke (100x100 pixels, 230 ± 20 micrometer per pixel) en temporele (1,000-3,000 frames / sec) resolutie. Fix een band-pass filter (590 ± 15 nm, Thorlabs, Newton, NJ) in de voorkant van de aangewezen calcium beeldcamera, terwijl, een lange-pass filter (> 700 nm, Thorlabs, Newton, NJ) moet worden geplaatst in voorkant van de aangewezen spanning beeldvorming camera. De camera's zijn loodrecht aan elkaar opgesteld door een houder, die een dichroïsche spiegel (635 nm cutoff, Omega Optical, Brattleboro, VT) bevat. Direct onder de dubbele camera houder is er een lens (Nikon NIKKOR 55 mm 1:1.4 235.052), die de emissie licht richt zich vanuit het hart op de dichroïsche spiegel. De werkafstand is ongeveer 3cm.
De excitatie licht wordt gegenereerd door een halogeenlamp (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT, SciMedia, Costa Mesa, CA) en wordt doorgegeven door middel van een warmte-filter, sluitertijd, en de band-pass filter (520 ± 45 nm). Een flexibele lichtgeleider stuurt de band-pass gefilterd licht op de voorbereiding, en een sluitertijd wordt gebruikt om ervoor te zorgen dat de voorbereiding wordt blootgesteld aan het licht alleen tijdens de beeldacquisitie om te voorkomen dat fotobleken van de kleurstoffen. - Bereid Ag / AgCl 2 elektroden voor stimulatie en detectie van te voren en installeer ze in de kamer voorafgaand aan het plaatsen het hart. Zorg ervoor dat de versterkers en filters worden aangepast aan geschikte niveaus.
3. Oogst de muis hart, canule, en stel Langendorff perfusie
- Verdoven van de muis met ketamine / xylazine (ketamin, 80mg/kg lichaamsgewicht, xylazine, 10 mg / kg lichaamsgewicht) en heparine (100 eenheden) door intraperitoneale injectie. Verzekeren passend niveau van de anesthesie door het gebrek aan pijn reflex.
- Na een tussentijdse borstbeen incisie, snel verwijdert u het hart en in zuurstofrijk was (95% O 2, 5% CO 2), een constante temperatuur (37 ± 1 ° C) Tyrode's oplossing.
- Met behulp van een dissectiemicroscoop, Snel identificeren van de aorta en maak een schone dwars door de stijgende aorta onder het rechter a. subclavia. Een korte deel van de aorta wordt vervolgens gekoppeld aan een op maat gemaakte 21-gauge canule met een uitlopende tip. 4-0 zwart gevlochten zijden hechtmateriaal (chirurgische Specialties Corporation, Reading, PA) wordt gebruikt om het hart vast op de canule. Na cannulatie, is het hart retrogradely perfusie en superfused met de oplossing Tyrode's. De retrograde perfusie snelheid wordt aangepast in het bereik van 2-5 ml / min aan de aorta druk tussen de 60 en 80 mmHg (Pressure transducer, World precisie-instrumenten Inc (WPI), Sarasota, USA te houden; Bridge versterker TBM4M, WPI, Sarasota, USA).
- Nadat het hart is gecanuleerde, zijn de longen, thymus, en vetweefsel vervolgens ontleed en verwijderd.
- De geïsoleerde hart is gespeld (Fine Science Tools) aan de top naar de bodem van de perfusie kamer (Sylgard gecoat) te streamen-geïnduceerde beweging te voorkomen. De rechter-en linker atrium aanhangsels zijn ook uitgerekt en vastgezet (Fine Science Tools, Inc, Foster City, CA) op de bodem van de kamer, die maximale oppervlakte zorgt voor optische metingen van de atria.
Heel belangrijk! Een klein siliconen buisje wordt ingebracht in de linker ventrikel via de longaders en gefixeerd door zijden hechtdraad naar het nabijgelegen bindweefsel. Dit voorkomt oplossing congestie en verzuring van het perfusaat gevangen in de linker ventrikel, wat vooral belangrijk is na de onderdrukking van ventriculaire contracties met een excitatie-contractie ontkoppelrail (zie deel 4 stap 19). - Een op maat gemaakte elektrode wordt geplaatst op het oppervlak van het hart naar de pacing prikkels, die wordt gegenereerd door Master-8 (AMP Instruments Ltd, Jeruzalem, Israël) of PowerLab 26T (AD Instruments, Sydney, Australië) gedrag.
- Een klein afdekglas is gefixeerd op het oppervlak van de oplossing over het hart om bewegingsartefacten te verminderen van de trillende oplossing.
- Focus van de excitatie licht op het hart. Daarnaast is de afstand tussen de dubbele camera apparatuur en het hart, zodat een maximale resolutie zal worden verkregen.
- Schakel alle lichten in de kamer en beginnen elektrische opnamen met behulp van PowerLab 26T.
4. Load voltage en calcium gevoelige kleurstoffen en excitatie-contractie ontkoppelrail
- Warm-up 0,6 ml blebbistatin. Mix 0,5 ml van de blebbistatin met het perfusaat op het bedrijf reservoir. Verdun de resterende 0,1 ml blebbistatin in 1 ml van de oplossing Tyrode en langzaam te injecteren (over een periode van 20 minuten) via een drug-poort in de buurt van de canule. Let op als blebbistatin geleidelijk vermindert de bewegingsartefacten.
- Verdun 30 pi van de spanning gevoelige kleurstof RH237 voorraad oplossing in een 1 ml Tyrode en langzaam over 5-7 minuten te injecteren in dezelfde injectie poort als blebbistatin.
- 30 pi calcium indicator Rhod-2 AM is 1:1 gemengd met Pluronic F127 (Invitrogen, Carlsbad, CA, 20% oplossing in DMSO) en vervolgens verdund in een oplossing mL Tyrode en langzaam toegepast over 5-10 min via dezelfde injectiepoort .
- Wacht op 5-10 minuten voor blebbistatin en kleurstoffen aan de celmembraan en cytosol te bereiken. Ga verder met het protocol wanneer er beweging volledig wordt onderdrukt.
- Permanent toezicht op ECG-opnamen over het gehele procedure om de normale elektrische functie van het hart verzekeren.
- Beginnen fluorescentiesignaal opnamen met de SciMedia aangepaste software (SciMedia, Costa Mesa, CA).
5. Representatieve resultaten:
Figuur 1. Experimentele opstelling voor de perfusie, de elektrische en optische opnames in kaart brengen.
EM = emissie; Lp = longpass
Figuur 2. Experimentele voorbereiding en het signaal voorbeelden opgenomen tijdens ventriculaire pacing. Links: ECG-signalen worden verzameld van Ag / AgCl 2 disk elektroden (Top) en een voorbeeld van S1S1 stimulatie protocol wordt getoond (Bottom). Center: Langendorff muis hart voorbereiding. Rechts: Representatieve optische actiepotentialen en calcium voorbijgaande signalen van atria (Top) en de ventrikels (Onder) worden getoond. De gele pijl (Top) wijst op het fluorescerende signaal verstrooiing afkomstig uit de hartkamers, die wordt gezien in de atriale opnames.
LV = linker ventrikel; RV = Rechts ventrikel; LA = links atrium; RA = rechts atrium
Figuur 3. Vertegenwoordiger optische opnames van V m en kat uit de ventrikels van een wild-type muis het hart. A. De experimentele voorbereiding met een reeks van gelijkmatig verdeelde locaties gemarkeerd door zwarte stippen waarvan de optische-opnames zijn te zien in (C). B. Voorbeeld tracing van V m en CaT vanaf een centrale locatie op de matrix (zie kader in (C)). C. V m (blauw) en CAT (rood) uit de reeks van gelijkmatig verdeelde locaties. Signalen waren weggegooid 3x3.
Figuur 4. Activering kaart en geleiding. A. Een voorbeeld activering kaart uit een wild-type muis hart met dwarse (T) en longitudinaal (L) richtingen aangegeven met witte pijlen. B. V m signalen (Top) en dV / dt (Onder) die overeenkomen met de drie punten te zien in A (T1, T2, T3, L1, L2, L3).
Figuur 5. Action potentieel en calcium voorbijgaande duur analyse. A. Actie mogelijke duur bij 80% repolarisatie (APD80) en calcium voorbijgaande duur op 80% ontspanning (CaD80) kaarten zijn vanaf een hart onder controle condities (links) en na 30 nM isoproterenol applicatie (rechts). De geel / groene kleur in de ventrikels (rechts) geeft aan isoproterenol verkort APD80 en CaD80. B. Voorbeeld traces van APD80 en CaD80 van de wild-type muis ventrikels (Top) en atria (onder).
Discussion
In dit experiment hebben we wijzigde de Langendorff perfusie methode door het toevoegen van een klein siliconen buisje, wat vooral belangrijk is na de onderdrukking van ventriculaire contracties met een excitatie-contractie ontkoppelrail. Het silicium buis wordt gebruikt om de oplossing congestie, verzuring van de perfusie-oplossing, en de ontwikkeling van ischemie in de linker ventrikel te voorkomen. De muis hart is zeer gevoelig voor onderkoeling, dus, de temperatuur verschillen tussen het hart zal leiden tot kunstmatige verschillen in actiepotentiaal duur. Bijgevolg werd een verwarmingssysteem geïmplementeerd in de perfusie kamer in om een constante temperatuur van 37 ° C te behouden tijdens het geheel van het experiment 8. Aangezien een Langendorff model niet behouden innervatie van het hart, moet men overwegen om neurotransmitters aan het perfusaat om fysiologische sympathische en parasympathische toon 9 te onderzoeken. Naast de retrograde perfusie, toevoeging van superfusie van het hart helpt bij het handhaven geschikte milieu-parameters, zoals pH en temperatuur. In deze methode, was het Langendorff perfusie hart horizontaal geplaatst. Een verticale Langendorff perfusie setup kan ook worden gebruikt 10, maar kan resulteren in iets andere cardiale mechanica 11. Naast de CMOS-camera's, alternatieve detectors zijn ook beschikbaar en kan worden toegepast in kaart V m en CaT tegelijk 12.
Toepassing van de CMOS-camera's van hoge spatio-temporele resolutie verzekert de juistheid van de opnames, maar optisch in kaart brengen van signalen niet van een enkele cel. Integendeel, elk fluorescent signaal komt uit honderden of duizenden cellen, afhankelijk van de optische vergroting. De veel grotere ventriculaire fluorescentie kan vervormen atriale signalen door optische verstrooiing, daarom een zorgvuldige interpretatie van de opgenomen signalen optisch is vereist. Een andere beperking van de muis voorbereiding is het signaal vervorming en ruis veroorzaakt door de kromming van het oppervlak als gevolg van de geringe omvang van het hart 13. Geleidingssnelheid metingen kunnen worden veranderd niet alleen van de kromming van de muis hart, maar ook uit elektrode polariteit en virtuele elektroden. Om dit te bereiken nauwkeurigheid voor geleidingssnelheid, activering anisotropie, en repolarisatie kaarten, de juiste focus van de camera aan het oppervlak van het hart is essentieel.
Bij deze methode kan real-time ECG-opnamen een aanvulling op de optisch onderzoek van de cardiale elektrofysiologie. Voltage-gevoelige kleurstof (RH237) en calcium indicator (Rhod-2AM) worden gebruikt in het protocol vanwege hun snelle respons, vergelijkbaar excitatie, en onderscheiden emissiespectra 3,7. Er zijn alternatieve combinaties van kleurstoffen die kunnen worden gebruikt tot en met V m en CaT andere dan de RH237 en Rhod-2AM 3 te meten. Een nieuwe voltage-gevoelige kleurstof, PGHI, met een grote Stoke's shift (> 200nm) bleek beter V m en CAT-signalen als gevolg van de grotere scheiding van de emissie golflengtes tussen PGHI en Rhod-2AM 14 mogelijk te maken. Toekomstige verbeteringen kunnen zich richten op het verkennen van nieuwe fluorescerende probes, de ontwikkeling van nieuwe beeldvormende detectoren, en verbeterde beeldverwerking software. Hogere resolutie en nieuwe optische beeldvormingsmodaliteiten voor 3D optische kaarten zijn ook belangrijk de toekomstige richting van de optische kaart brengen 5.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
NIH subsidie R01 HL085369.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | |
| RH237 | Invitrogen | S1109 | |
| Rhod-2AM | Invitrogen | R1244 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| PowerLab 26T |  ADInstruments |
References
- Efimov, I. R., Rendt, J. M., Salama, G. Optical maps of intracellular [Ca2+]i transients and action-potentials from the surface of perfused guinea-pig hearts. Circulation. 90, 1-1 (1994).
- Efimov, I. R. Optical mapping of repolarization and refractoriness from intact hearts. Circulation. 90, 1469-1480 (1994).
- Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. J Physiol. 529, 171-188 (2000).
- Pruvot, E. J. Role of calcium cycling versus restitution in the mechanism of repolarization alternans. Circ Res. 94, 1083-1090 (2004).
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G.
- Fast, V. G. Recording action potential using voltage sensitive dyes. Practical methods in cardiovascular research. Dhein, S., Delmoar, M. , Springer. New York. 233-255 (2005).
- Glukhov, A. V. Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. , (2009).
- Baker, L. C. Enhanced dispersion of repolarization and refractoriness in transgenic mouse hearts promotes reentrant ventricular tachycardia. Circ Res. 86, 396-407 (2000).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacol Res. 41, 613-627 (2000).
- Efimov, I. R. Virtual electrode polarization in the far field: implications for external defibrillation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 279, 1055-1070 (2000).
- Hammouda, M., Kinosita, R. The coronary circulation in the isolated heart. J Physiol. 61, 615-628 (1926).
- Salama, G., Hwang, S. M. Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts. Curr Protoc Cytom. 12, 17-17 (2009).
- Lou, Q. Quantitative panoramic imaging of epicardial electrical activity. Ann Biomed Eng. 36, 1649-1658 (2008).
- Salama, G. Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart. J Membr Biol. 208, 125-140 (2005).
