Summary
Эта статья подробно процедура вскрытия, инструментальная установка, и экспериментальных условиях при оптическом отображение трансмембранного потенциала (ВМ) и внутриклеточного кальция переходных (КПП) в интактных изолированных Langendorff перфузии мыши сердца.
Abstract
Мышь сердце популярной моделью развития сердечно-сосудистых исследований из-за наличия недорогих технологий для генной инженерии у этого вида. Сердечно-сосудистые физиологических Фенотипирование мыши сердца можно легко сделать с помощью флуоресцентной визуализации с использованием различных зондов для трансмембранного потенциала (V м), кальция переходных (КПП), и другие параметры. Возбуждение-сжатия связи характеризуется потенциала действия и внутриклеточной динамики кальций, поэтому крайне важно, чтобы обе карты V м и кот одновременно с того же места на сердце 1-4. Одновременное отображение из оптических Langendorff перфузии сердца мыши имеет потенциал для выяснения механизмов, лежащих сердечной недостаточности, аритмии, нарушение обмена веществ, и других сердечных заболеваний. Визуализация активации, скорости проведения, продолжительность потенциала действия и других параметров на множество сайтов не может быть достигнута из ячеистого расследования уровне, но хорошо решается оптическим отображением 1,5,6. В этой статье мы представляем установку приборов и экспериментальных условий для одновременного оптического отображение V м и КПП в мыши сердца с высоким пространственно-временным разрешением использования государством в самых современных КМОП-технологий визуализации. В соответствии оптических записей, полученных с помощью этого метода показывают, что одновременное отображение оптических Langendorff перфузии сердца мыши является возможным и надежным.
Protocol
1. Расширенный подготовке исходных растворов
- Приготовьте два растворы решения Тирода (16x) заранее в деионизованной воде и хранить их при температуре 4 ° C:
- Сток I (119,872 г / л NaCl, 3,056 г / л CaCl 2 (2H 2 O), 5,6 г / л KCl, 2,6274 г / л NaH 2 PO 4, 3,408 г / л MgCl 2 (6H 2 O), (Fisher Научные, Fair Lawn, NJ));
- Со II (26,88 г / л NaHCO 3, (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)).
- Подготовка растворы флуоресцентных красителей. Чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания, мы сохраняем 30 мкл аликвоты и красителей при температуре -20 ° С, что вполне достаточно для одного эксперимента:
- Напряжение чувствительных красителей RH237 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) маточного раствора, 1,25 мг / мл раствора в диметилсульфоксид (ДМСО, Sigma, Сент-Луис, Миссури);
- Кальций индикатор Rhod-2 утра (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) маточного раствора, 1 мг / мл раствора в ДМСО.
- Подготовка возбуждение-сокращение разобщающий агент blebbistatin маточного раствора (Tocris Bioscience, Сент-Луис, Миссури, 2 мг / мл раствора в ДМСО) заранее и хранить растворенный blebbistatin при 4 ° C.
2. Подготовка перфузии решений и экспериментальной установки 7
- Недавно подготовить решение 2L Тирода (128.2mM NaCl, 1,3 мм CaCl 2 (2H 2 O), 4.7mM KCl, 1,05 мм MgCl 2 (6H 2 O), 1.19mM NaH 2 PO 4, 20 мМ NaHCO 3, 11.1mM D-глюкозы в деионизованной воде, рН = 7,35 ± 0,05). Если исходный раствор, который используется, чтобы сделать 2L решения Тирода (достаточно для одного эксперимента) принимать 1750 мл деионизированной воды и перемешать в 125 мл на месте я, 125 мл фондового II, и 4 г глюкозы.
- Включите двух насосов перфузии систем. Установить перистальтического насоса (Peri-Star, WPI, Сарасота, США), который используется для ретроградной перфузии до 40 мл / мин. Установите другие перистальтического насоса (Cole-Parmer Masterflex Peristalic насоса L / S, Коул-Parmer Instrument Company, Вернон Хиллс, штат Иллинойс), которая используется для superfusion и вернуться обратно в перфузат проведения водохранилища до 80 мл / мин.
- Вымойте перфузии системе с 70% этанолом в течение 30 минут, а затем с 2 л деионизированной воды.
- После того как все деионизированной воды из камеры откачивается, распространить решение Тирода и передать его через 5-мкм фильтр (Millipore, Billerica, штат Массачусетс, США). Теплый перфузат до +37 ° С с водяной рубашкой и циркулятор (ThermoNESLAB EX7, Newtown, США) и кислородом перфузат барботированием O 2 / CO 2 (95% / 5%) газа в раствор. Монитор рН раствора с рН-метра (Oakton Instruments, Вернон Хиллс, штат Иллинойс) и настроить скорость O 2 / CO 2 пузырящийся держать рН 7,35 ± 0,05. Продолжить мониторинг рН и температуры в ходе эксперимента.
- Двойной оптической аппаратуры отображения состоит из двух MICAM Ultima-L CMOS-камер (SciMedia, Коста Меса, Калифорния), которые имеют высокое пространственное (100x100 пикселей, 230 ± 20 мкм на пиксель) и временные (1000-3000 кадров / сек) разрешением. Fix полосовой фильтр (590 ± 15 нм, Thorlabs, Ньютон, штат Нью-Джерси) перед назначенным камера кальция, в то время, долго фильтр (> 700 нм, Thorlabs, Ньютон, штат Нью-Джерси) должен быть расположен в Перед назначенным камера напряжения. Камеры расположены перпендикулярно друг с другом держателе, который содержит дихроичных зеркал (635 нм отсечки, Омега Оптические, Brattleboro, VT). Непосредственно под двойной держатель камеры есть объектив (Nikon NIKKOR 55 мм 1:1,4 235052), которая фокусируется излучение света, идущего от сердца на дихроичных зеркал. Рабочее расстояние около 3 см.
Возбуждающего света генерируется галогенная лампа (Newport Oriel Instruments, Стратфорде, штат Коннектикут; SciMedia, Коста Меса, Калифорния) и пропускается через фильтр тепла, затвор, и полосовой фильтр (520 ± 45 нм). Гибкий световод направляет полосовой фильтр свет на подготовку, а затвора используется, чтобы гарантировать, что препарат подвергается воздействию света только во время получения изображения, чтобы избежать фотообесцвечивания красителей. - Подготовка Ag / AgCl 2 электродов для стимуляции и зондирования заранее и установить их в камере до размещения сердце. Убедитесь, что усилители и фильтры настроены на соответствующих уровнях.
3. Урожай мыши сердце, иглу, а также создать Langendorff перфузии
- Обезболить мышь с кетамином / ксилазина (кетамин, 80mg/kg массы тела; ксилазина, 10 мг / кг массы тела) и гепарин (100 единиц) по внутрибрюшинного введения. Обеспечение необходимого уровня анестезии из-за отсутствия боли рефлекс.
- После середины грудины разрез, быстро удалить сердца и промыть его в кислород (95% O 2, 5% СО 2), с постоянной температурой (37 ± 1 ° C) раствор Тирода.
- Использование рассекает микроскопом, Быстро идентифицировать аорты и сделать чистый срез по восходящей аорты ниже правой подключичной артерии. Короткий участок аорты затем прикрепляется к заказу 21 калибра канюли с вспыхнул чаевые. 4-0 черный плетеный шелк для наложения швов (Хирургическое Корпорация Специальности, Reading, PA) используется для исправления сердца на канюлю. После катетеризации, сердце ретроградно перфузии и superfused с решением Тирода. Ретроградной перфузии скорость регулируется в диапазоне от 2-5 мл / мин держать аортального давления между 60 и 80 мм рт.ст. (Датчики давления, Всемирный точных приборов Inc (WPI), Сарасота, США; моста Усилитель TBM4M, WPI, Sarasota, США).
- После сердце канюлированные, легких, вилочковой железы, а жировая ткань, затем расчленены и удалены.
- Изолированного сердца закреплен (Fine Инструменты наук) на вершине на дно камеры перфузии (Sylgard покрытием), чтобы предотвратить поток вызванных движением. Правое и левое предсердия придатков также растягивается и возлагали (Fine инструменты Наука, Inc, Foster City, CA) в нижней части камеры, что обеспечивает максимальную площадь поверхности для оптических измерений предсердий.
Очень важно! Трубочку кремния вставляется в левый желудочек через легочные вены и фиксируется шелковых шва на близлежащие соединительной ткани. Это предотвращает перегрузку решение и подкисление перфузат в ловушке левого желудочка, что особенно важно после подавления желудочковых сокращений с возбуждением-сжатия разобщающий агент (см. часть 4 шаг 19). - Заказ электрод помещается на поверхности сердца для проведения стимуляции стимуляции, который генерируется мастер-8 (AMP Ltd инструменты, Иерусалим, Израиль) или PowerLab 26Т (AD инструменты, Сидней, Австралия).
- Небольшая стеклянная крышка фиксируется на поверхности раствора через сердце, чтобы уменьшить движение артефакт из вибрирующих решение.
- Фокус возбуждающего света на сердце. Кроме того, настроить расстояние между аппаратом двойного камеры и сердце, чтобы максимальное разрешение будет получено.
- Выключите все освещение в комнате и начать электрической записи на основе PowerLab 26Т.
4. Напряжение нагрузки и кальций чувствительной красителей и возбуждение-сокращение разобщающий агент
- Разминка 0,6 мл blebbistatin. Смешать 0,5 мл blebbistatin с перфузат в проведении водохранилище. Развести оставшиеся 0,1 мл blebbistatin в 1 мл раствора Тирода и медленно вводить его (в течение 20-минутного периода) с помощью наркотиков порт расположен вблизи канюли. Соблюдайте, как blebbistatin постепенно уменьшает движение артефакт.
- Развести 30 мкл напряжения чувствительного красителя RH237 маточного раствора в растворе 1 мл Тирода и медленно вводят в течение 5-7 минут в тот же порт, как инъекции blebbistatin.
- 30 мкл индикатора кальция Rhod-2 АМ 1:01 смешивается с Pluronic F127 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, 20% раствор в ДМСО), а затем разводят в 1 мл раствора Тирода и медленно применяться в течение 5-10 мин через тот же порт инъекции .
- Подождите 5-10 минут для blebbistatin и красителей для достижения клеточной мембране и цитозоле. Продолжить с протоколом, когда движение полностью подавлены.
- Непрерывный мониторинг ЭКГ в течение всей процедуры для обеспечения нормальной электрической функции сердца.
- Приступить к записи флуоресцентный сигнал, используя SciMedia заказного программного обеспечения (SciMedia, Коста Меса, Калифорния).
5. Представитель результаты:
Рисунок 1. Экспериментальная установка для перфузии, электрические и оптические записи карт.
EM = выбросов; Lp = longpass
Рисунок 2. Экспериментальная подготовка и сигнал примеры записаны во время стимуляции желудочков. Слева: ЭКГ сигналы собираются из Ag / AgCl электродов 2 диска (вверху) и пример S1S1 стимуляции протокол показано на рисунке (внизу). Центр: Langendorff мыши сердце подготовки. Справа: представитель оптических потенциалов действия и кальция переходные сигналы от предсердий (вверху) и желудочков (внизу) показаны. Желтая стрелка (Топ) указывает на флуоресцентные рассеяния сигнала, поступающего от желудочков, которая проявляется в предсердии записей.
LV = левого желудочка; RV = Правый желудочек; LA = левое предсердие; RA = правого предсердия
Рисунок 3. Представителю оптические записи V м и кот из желудочков сердца мышей дикого типа. А. экспериментального препарата с массивом равномерно расположенных местах отмечены черными точками, оптические записи можно увидеть на (С). Б. Пример отслеживания V м и Кэт центре города, на массив (см. вставку яП (С)). С. V м (синий) и CAT (красный) из массива равномерно распределенных точках. Сигналы были binned 3x3.
Рисунок 4. Карту активации и проводимости. А. карте пример активации от диких сердцем мыши типа с поперечной (Т) и продольных (L) направлениях, указанных белыми стрелками. Б. В. м сигналов (вверху) и DV / DT (нижняя), соответствующие трем точкам видно (T1, T2, T3, L1, L2, L3).
Рисунок 5. Потенциальных действий и кальция анализа переходных процессов длительностью. А. Меры потенциальную продолжительность на уровне 80% реполяризации (APD80) и кальция переходных длительности на 80% релаксации (CaD80) карты показаны со сердца под контролем условиях (слева) и после 30 нМ изопротеренол приложения (справа). Желтый / зеленый цвет в желудочки (правый) означает, изопротеренол сокращен APD80 и CaD80. Б. Пример начертаний APD80 и CaD80 от дикого типа мышь желудочков (вверху) и предсердий (внизу).
Discussion
В этом эксперименте мы изменили метод Langendorff перфузии, добавив небольшую трубку кремния, что особенно важно после подавления желудочковых сокращений с возбуждением-сжатия разобщающий агент. Трубки кремния используется для предотвращения заторов решение, подкисление перфузии раствора и развития ишемии в левый желудочек. Мышь сердце очень чувствительны к гипотермии, таким образом, колебания температуры через сердце приведет искусственного различия в длительности потенциала действия. Следовательно, система отопления была реализована в перфузионной камере, чтобы поддерживать постоянную температуру 37 ° С в течение полноту эксперимента 8. Так как модель Langendorff не сохраняет иннервации сердца, необходимо рассмотреть вопрос о включении нейротрансмиттеров в перфузат с целью изучения физиологических симпатической и парасимпатической тон 9. Кроме того ретроградной перфузии, добавление superfusion сердца помогает поддерживать подходящие параметры окружающей среды, таких как рН и температура. В этом методе, Langendorff перфузии сердце горизонтально расположенные. Вертикальной установки перфузии Langendorff также может быть использован 10, но может привести к несколько иной сердечной механике 11. В дополнение к CMOS-камер, альтернативных детекторов, также доступны и могут быть применены к карте V м и кот одновременно 12.
Применение камер CMOS высокой пространственно-временное разрешение обеспечивает точность записей, однако оптические сигналы отображение не из одной ячейки. Скорее, каждый флуоресцентный сигнал поступает из сотен или тысяч клеток, в зависимости от оптического увеличения. Гораздо больше желудочка флуоресценции может исказить предсердий сигналов оптического рассеяния, поэтому осторожной интерпретации оптически регистрируемых сигналов не требуется. Другим ограничением мыши препарата искажения сигнала и шума индуцированных кривизна поверхности из-за небольшого размера сердца 13. Измерения скорости проведения могут быть изменены не только от кривизны мыши сердца, но и от полярности электрода и виртуальных электродов. Для достижения точности для скорости проведения, активизации анизотропии и реполяризации карт, правильная фокусировка камеры на поверхности сердца имеет важное значение.
В этом методе реального времени записи ЭКГ может дополнить оптического исследования сердечной электрофизиологии. Напряжение чувствительных красителя (RH237) и кальция индикатор (Rhod-2 утра) используются в протокол из-за их быстрой реакции, подобные возбуждения, и различные спектры излучения 3,7. Существуют альтернативные комбинации красителей, которые могут быть использованы для измерения V м и CaT кроме RH237 и Rhod-2 утра 3. Роман напряжения чувствительной краситель, PGHI, с большим сдвигом Стокса (> 200 нм) был найден, чтобы лучше V м и CaT сигналы из-за большего разделения длин волн излучения между PGHI и Rhod-2 утра 14. Дальнейшее совершенствование может сосредоточиться на изучении новых флуоресцентных зондов, разработка новых детекторов изображений, а также усовершенствованное программное обеспечение для обработки изображений. Более высокое разрешение и новых оптических условий для 3D визуализации оптических отображение также важны будущие направления оптических отображение 5.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
NIH гранты R01 HL085369.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | |
| RH237 | Invitrogen | S1109 | |
| Rhod-2AM | Invitrogen | R1244 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| PowerLab 26T |  ADInstruments |
References
- Efimov, I. R., Rendt, J. M., Salama, G. Optical maps of intracellular [Ca2+]i transients and action-potentials from the surface of perfused guinea-pig hearts. Circulation. 90, 1-1 (1994).
- Efimov, I. R. Optical mapping of repolarization and refractoriness from intact hearts. Circulation. 90, 1469-1480 (1994).
- Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. J Physiol. 529, 171-188 (2000).
- Pruvot, E. J. Role of calcium cycling versus restitution in the mechanism of repolarization alternans. Circ Res. 94, 1083-1090 (2004).
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G.
- Fast, V. G. Recording action potential using voltage sensitive dyes. Practical methods in cardiovascular research. Dhein, S., Delmoar, M. , Springer. New York. 233-255 (2005).
- Glukhov, A. V. Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. , (2009).
- Baker, L. C. Enhanced dispersion of repolarization and refractoriness in transgenic mouse hearts promotes reentrant ventricular tachycardia. Circ Res. 86, 396-407 (2000).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacol Res. 41, 613-627 (2000).
- Efimov, I. R. Virtual electrode polarization in the far field: implications for external defibrillation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 279, 1055-1070 (2000).
- Hammouda, M., Kinosita, R. The coronary circulation in the isolated heart. J Physiol. 61, 615-628 (1926).
- Salama, G., Hwang, S. M. Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts. Curr Protoc Cytom. 12, 17-17 (2009).
- Lou, Q. Quantitative panoramic imaging of epicardial electrical activity. Ann Biomed Eng. 36, 1649-1658 (2008).
- Salama, G. Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart. J Membr Biol. 208, 125-140 (2005).
