Summary
Detta dokument beskrivs de dissektion förfarande, instrumentell inställning, och experimentella förhållanden under optiska kartläggningen av transmembrana potential (VM) och intracellulär kalcium övergående (CAT) i intakta isolerade Langendorff perfusion musen hjärtan.
Abstract
Musen Hjärtat är en populär modell för hjärt-studierna på grund av förekomsten av låg kostnad teknik för genteknik i denna art. Hjärt fysiologiska fenotypning av musen hjärtat kan enkelt göras med hjälp av fluorescens avbildning anställa olika prober för transmembrana potential (V m), kalcium transienter (CAT) och andra parametrar. Excitation-kontraktion koppling kännetecknas av aktionspotentialen och intracellulär kalcium dynamik, och därför är det oerhört viktigt att kartlägga både V m och katt samtidigt från samma plats på hjärtat 1-4. Samtidig optiska kartläggning från Langendorff perfusion musen hjärtan har potential att klarlägga mekanismerna bakom hjärtsvikt, arytmier, metaboliska sjukdomar, och andra hjärtsjukdomar. Visualisering av aktivering, kan överledning hastighet, durationen av aktionspotentialen, och andra parametrar i en myriad av platser inte uppnås från cellnivå undersökningen men är väl lösas genom optisk kartläggning 1,5,6. I detta paper presenterar vi instrumentering installation och experimentella förhållanden för samtidig optiska kartläggning av V m och katt i mus hjärtan med hög tid och rum upplösning med hjälp av state-of-the-art CMOS-teknik. Konsekvent optiska inspelningar erhålls med denna metod visar att samtidig optiska kartläggning av Langendorff perfusion mus hjärtan är både möjlig och tillförlitlig.
Protocol
1. Avancerad beredning av stamlösningar
- Bered två stamlösningar av Tyrode lösning (16x) i förväg i avjoniserat vatten och förvara dem vid 4 ° C:
- Lager I (119,872 g / L NaCl, 3,056 g / L CaCl 2 (2H 2 O), 5,6 g / L KCl, 2,6274 g / L NaH 2 PO 4, 3,408 g / L MgCl 2 (6H 2 O), (Fisher Vetenskapliga, Fair Lawn, NJ));
- Stock II (26,88 g / L NaHCO3 (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ)).
- Bered stamlösningar av fluorescerande färgämnen. För att undvika upprepad frysning och upptining, lagrar vi 30 l alikvoter av både färgämnen vid -20 ° C, vilket är tillräckligt för ett experiment:
- Spänningskänsliga dye RH237 (Invitrogen, Carlsbad, CA) stamlösning, 1,25 mg / ml lösning i dimetylsulfoxid (DMSO, Sigma, St Louis, MO);
- Kalcium indikator Rhod-2:00 (Invitrogen, Carlsbad, CA) stamlösning, 1 mg / ml lösning i DMSO.
- Förbered excitation-kontraktion uncoupler lösning blebbistatin lager (Tocris Bioscience, St Louis, MO, 2 mg / ml lösning i DMSO) i förväg och lagra den upplösta blebbistatin vid 4 ° C.
2. Förbered perfusion lösningar och experiment 7
- Färskt förbereda 2L Tyrode lösning (128.2mM NaCl, 1.3mm CaCl 2 (2H 2 O), 4.7mm KCl, 1.05mM MgCl 2 (6H 2 O), 1.19mM NaH 2 PO 4, 20mm NaHCO 3, 11,1 mm D-glukos i avjoniserat vatten, pH = 7,35 ± 0,05). Om stamlösning används för att göra 2L av Tyrode lösning (tillräckligt för ett experiment) tar 1750 ml avjoniserat vatten och blanda med 125 ml Stock I, 125 ml Stock II, och 4g av glukos.
- Slå på två pumpar i perfusion systemen. Ställ peristaltiska pumpen (Peri-Star, WPI, Sarasota, USA) som används för retrograd perfusion till 40 ml / min. Ställ den andra peristaltiska pumpen (Cole-Parmer Masterflex Peristalic Pump L / S, Cole-Parmer Instrument Company, Vernon Hills, Illinois) som används för superfusion och att återvända perfusatet tillbaka till anläggningen reservoaren till 80 ml / min.
- Tvätta perfusionen systemet med 70% etanol i 30 min och sedan med 2L avjoniserat vatten.
- När alla avjoniserat vatten är evakueras från kammare, cirkulerar Tyrode lösning och passera den genom en 5-ìm filter (Millipore, Billerica, MA, USA). Varm perfusatet till 37 ° C med en vattenmantlad och cirkulationspumpen (ThermoNESLAB EX7, Newtown, USA) och syresätta perfusatet av skumbildning O 2 / CO 2 (95% / 5%) av gas i lösningen. Övervaka lösningens pH med en pH-mätare (Oakton Instrument, Vernon Hills, IL) och justera graden av O 2 / CO 2 bubblande att hålla pH-värdet på 7,35 ± 0,05. Fortsätta att övervaka pH och temperatur under experimentet.
- Den dubbla optiska kartläggning Utrustningen består av två MiCAM Ultima-L CMOS-kameror (SciMedia, Costa Mesa, CA) som har hög rumslig (100x100 pixlar, 230 ± 20 mikrometer per pixel) och tidsmässiga (1,000-3,000 bilder / sek) upplösning. Fäst ett bandpassfilter (590 ± 15 nm, Thorlabs, Newton, NJ) framför de utsedda kalcium kamera, medan, en lång-pass filter (> 700 nm, Thorlabs, Newton, NJ) måste placeras i framför den utsedda spänningen kamera. Kamerorna är placerade vinkelrätt mot varandra med en hållare, som innehåller en dikroisk spegel (635 nm cutoff, Omega Optisk, Brattleboro, VT). Direkt under den dubbla kamera hållaren finns en objektiv (Nikon Nikkor 55 mm 1:1.4 235.052), som fokuserar utsläpp ljus som kommer från hjärtat på dikroiskt spegeln. Arbetstiden är ungefär 3 cm.
Det excitation ljuset genereras av en halogenlampa (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT, SciMedia, Costa Mesa, CA) och leds genom en värme-filter, slutare och bandpassfilter (520 ± 45 nm). En flexibel ljusledare riktar bandpass-filtrerat ljus på förberedelser, och en slutare används för att säkerställa att preparatet utsätts för ljus endast under bildtagning att undvika fotoblekning av färgämnen. - Förbered Ag / AgCl 2 elektroder för stimulering och avkänning i förväg och installera dem i kammaren innan de släpps hjärtat. Se till att förstärkare och filter är anpassade till lämpliga nivåer.
3. Harvest musen hjärtat, cannulate och konfigurera Langendorff perfusion
- Bedöva musen med ketamin / xylazin (ketamin, 80mg/kg kroppsvikt, xylazin, 10 mg / kg kroppsvikt) och heparin (100 enheter) efter intraperitoneal injektion. Se till lämplig nivå av anestesi av bristen av smärta reflex.
- Efter mitten av sternala snitt, snabbt ta bort hjärtat och tvätta den i syresatt (95% O 2, 5% CO 2), konstant temperatur (37 ± 1 ° C) Tyrode lösning.
- Med hjälp av en dissekera mikroskop, Snabbt identifiera kroppspulsådern och göra en ren skär över aorta ascendens under höger subclavia. En kort del av aorta bifogas sedan en skräddarsydd 21-gauge kanyl med utsvängda spets. 4-0 svart flätad silke suturer (kirurgiska specialiteter Corporation, Reading, PA) används för att fixera hjärtat på kanylen. Efter kanylering, är hjärtat retrogradely perfusion och superfused med Tyrode lösning. Den bakåtsträvande perfusionshastighet justeras i intervallet 2-5 ml / min för att hålla aorta trycket mellan 60 och 80 mmHg (Tryckgivare, World precisionsinstrument Inc (WPI), Sarasota, USA; Bridge Förstärkare TBM4M, WPI, Sarasota, USA).
- När hjärtat är kanylerade är lunga, bräss, och fettvävnad sedan dissekeras och tas bort.
- De isolerade hjärta är låst (Fine Science Tools) i toppen till botten av perfusion kammaren (Sylgard belagd) för att förhindra ström-inducerad rörelse. Höger och vänster förmak bihang är också sträcks och fästs (Fine Science Tools, Inc, Foster City, CA) till botten av kammaren, vilket ger maximal yta för optiska mätningar av förmaken.
Mycket viktigt! En liten silikon slang sätts in i vänster kammare genom lungorna vener och fastställs av silke sutur till närliggande bindväv. Detta förhindrar lösningen trängsel och försurning av perfusatet fångade i vänster kammare, vilket är särskilt viktigt efter undertryckandet av ventrikulära kontraktioner med en excitation-kontraktion uncoupler (se del 4 steg 19). - En skräddarsydd elektrod placeras på ytan av hjärtat att genomföra pacing stimuli, som genereras av Master-8 (AMP Instruments Ltd, Jerusalem, Israel) eller PowerLab 26T (AD Instrument, Sydney, Australien).
- En liten skyddsglas är fast på ytan av lösningen över hjärtat för att minska rörelseartefakt från vibrerande lösningen.
- Fokusera excitation ljus på hjärtat. Dessutom, justera avståndet mellan dubbla kamera apparater och hjärtat så att maximal upplösning kommer att erhållas.
- Stäng av alla lampor i rummet och börja elektriska inspelningar med PowerLab 26T.
4. Ladda spänning och kalcium känsliga färgämnen och excitation-kontraktion uncoupler
- Uppvärmningstid 0,6 mL blebbistatin. Blanda 0,5 ml av blebbistatin med perfusatet i innehavet reservoaren. Späd resterande 0,1 mL blebbistatin i 1 ml Tyrode lösning och injicera långsamt det (under en 20 minuters period) genom en drog-port ligger nära kanylen. Observera som blebbistatin gradvis minskar rörelseartefakt.
- Späd 30 mikroliter av spänningskänsliga färgämne RH237 stamlösning i 1 ml Tyrode lösning och injicera långsamt under 5-7 minuter in i samma injektion port som blebbistatin.
- 30 mikroliter kalcium indikator Rhod-2 AM är 01:01 blandas med Pluronic F127 (Invitrogen, Carlsbad, CA, 20% lösning i DMSO) och därefter spädas med 1 ml Tyrode lösning och långsamt appliceras över 5-10 min genom samma injektionsport .
- Vänta 50-10 minuter för blebbistatin och färgämnen för att nå cellmembranet och cytosolen. Fortsätt med det protokoll när rörelse är helt undertryckt.
- Kontinuerligt övervaka EKG-inspelningar över hela förfarandet för att säkerställa normala elektriska funktion i hjärtat.
- Påbörja fluorescerande signal inspelningar med SciMedia anpassade programvaran (SciMedia, Costa Mesa, CA).
5. Representativa resultat:
Figur 1. Experimentuppställning för perfusion, elektriska inspelningar och optiska kartläggning.
EM = utsläpp; Lp = longpass
Figur 2. Experimentella förberedelse och exempel signal registrerats under ventrikulär pacing. Vänster: EKG-signaler samlas in från Ag / AgCl 2 disk elektroder (överst) och ett exempel på S1S1 stimulering protokoll visas (underst). Center: Langendorff mus hjärta beredning. Höger: Representant optisk aktionspotentialer och kalcium transienta signaler från förmaken (överst) och kammare (längst ned) visas. Den gula pilen (Top) pekar på fluorescerande signal spridningen kommer från kamrarna, vilket ses i förmaksflimmer inspelningar.
LV = vänster kammare, RV = Höger kammare, LA = vänster förmak, RA = höger förmak
Figur 3. Representant optiska inspelningar av V m och katt från kamrarna i en vild typ mus hjärta. A. Den experimentella preparat med en mängd jämnt fördelade platser markerade med svarta prickar, vars optiska inspelningar kan ses i (C). B. Exempel spårning av V m och katt från en central plats på matrisen (se rutan in (C)). C. V m (blå) och CAT (röd) från mängd jämnt fördelade platser. Signaler var binned 3x3.
Figur 4. Aktivering karta och ledning. A. Ett exempel aktivering karta från en vild typ mus hjärta med tvärgående (T) och longitudinella (L) anvisningar som markeras med vita pilar. B. V m signaler (överst) och dV / dt (längst ned) motsvarande de tre punkterna som ses i A (T1, T2, T3, L1, L2, L3).
Figur 5. Aktionspotential och kalcium övergående tid analys. A. aktionspotentialens duration på 80% repolarisering (APD80) och kalcium övergående varaktighet på 80% avslappning (80 CAD) kartor visas från ett hjärta under kontroll förhållanden (vänster) och efter 30 Nm isoproterenol ansökan (höger). Den gula / gröna färgen i kamrarna (höger) visar isoproterenol förkortas APD80 och 80 CAD. B. Exempel tracings av APD80 och 80 CAD från naturen ventriklarna typ mus (överst) och förmak (längst ned).
Discussion
I detta experiment har vi ändrat Langendorff perfusionen metoden genom att lägga till ett litet silikon slang, vilket är särskilt viktigt efter undertryckandet av ventrikulära kontraktioner med en excitation-kontraktion uncoupler. Kisel röret används för att förhindra lösning trängsel, försurning av perfusion lösningen, och utveckling av ischemi i vänster kammare. Musen Hjärtat är mycket känsligt för hypotermi, och därför kommer temperaturvariationer över hjärtat orsaken artificiella skillnader i löptider aktionspotential. Följaktligen var ett värmesystem genomförs i perfusionen kammaren för att hålla en konstant temperatur på 37 ° C under hela det experiment 8. Eftersom en Langendorff modellen inte behåller innervation av hjärta, måste man överväga att lägga signalsubstanser till perfusatet för att undersöka fysiologiska sympatiska och parasympatiska tonen 9. Förutom retrograd perfusion, hjälper tillägg av superfusion hos hjärtat att upprätthålla lämpliga miljöparametrar som pH och temperatur. I denna metod var Langendorff perfusion hjärtat horisontellt placerad. En vertikal Langendorff perfusion inställning kan också användas för 10, men kan resultera i något olika hjärt mekanik 11. Förutom CMOS-kameror, alternativt detektorer är också tillgängliga och kan användas för att kartlägga V m och CAT samtidigt 12.
Tillämpning av CMOS-kameror av hög tid och rum upplösning säkerställer riktigheten i inspelningarna, men optiska kartläggning signaler är inte från en enda cell. Istället kommer varje fluorescerande signal från hundratals eller tusentals celler, beroende på optisk förstoring. Den betydligt större ventrikulära fluorescens kan snedvrida förmaksflimmer signaler genom optiska spridning, och därför är försiktig tolkning av optiskt inspelade signaler som krävs. En annan begränsning av musen preparatet är signalen distorsion och brus som orsakas av krökning av ytan på grund av den begränsade storleken på hjärtat 13. Conduction hastighet mätningar kan ändras inte bara från krökning av musen hjärta men också från elektroden polaritet och virtuella elektroder. För att uppnå noggrannhet för ledning hastighet, aktivering anisotropi och kartor repolarisering, korrekt fokusering av kameran på ytan av hjärtat är viktigt.
I denna metod kan i realtid EKG-registreringar komplettera optiska undersökning av hjärtats elektrofysiologi. Spänningskänsliga färgämne (RH237) och kalcium indikator (Rhod-2:00) används i protokollet på grund av deras snabba svar, liknande excitation, och distinkta emissionsspektra 3,7. Det finns alternativa kombinationer av färger som kan användas för att mäta V m och CAT än RH237 och Rhod-2:00 3. En roman spänningskänsliga färg, PGHI, med en stor Stoke arbetspass (> 200 sjömil) konstaterades att möjliggöra en bättre V m och signaler CAT på grund av ökad separation av utsläpp våglängder mellan PGHI och Rhod-2:00 14. Framtida förbättringar kan fokusera på att utforska nya fluorescerande prober, utveckling av nya avbildning detektorer, och förbättrade bildbehandlingsprogram. Högre upplösning och nya optiska metoder bildhantering för 3D optisk kartläggning är också viktiga framtida inriktningar av optiska kartläggning 5.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
NIH bidrag R01 HL085369.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-1 | |
| CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S217-500 | |
| MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific | M33-500 | |
| NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific | S369-500 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-3 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Blebbistatin | Tocris Bioscience | 1760 | |
| RH237 | Invitrogen | S1109 | |
| Rhod-2AM | Invitrogen | R1244 | |
| Pluronic F127 | Invitrogen | P3000MP | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| PowerLab 26T |  ADInstruments |
References
- Efimov, I. R., Rendt, J. M., Salama, G. Optical maps of intracellular [Ca2+]i transients and action-potentials from the surface of perfused guinea-pig hearts. Circulation. 90, 1-1 (1994).
- Efimov, I. R. Optical mapping of repolarization and refractoriness from intact hearts. Circulation. 90, 1469-1480 (1994).
- Choi, B. R., Salama, G. Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans. J Physiol. 529, 171-188 (2000).
- Pruvot, E. J. Role of calcium cycling versus restitution in the mechanism of repolarization alternans. Circ Res. 94, 1083-1090 (2004).
- Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. Optical imaging of the heart. Circ Res. 95, 21-33 (2004).
- Fast, V. G. Recording action potential using voltage sensitive dyes. Practical methods in cardiovascular research. Dhein, S., Delmoar, M. , Springer. New York. 233-255 (2005).
- Glukhov, A. V. Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. , (2009).
- Baker, L. C. Enhanced dispersion of repolarization and refractoriness in transgenic mouse hearts promotes reentrant ventricular tachycardia. Circ Res. 86, 396-407 (2000).
- Sutherland, F. J., Hearse, D. J. The isolated blood and perfusion fluid perfused heart. Pharmacol Res. 41, 613-627 (2000).
- Efimov, I. R. Virtual electrode polarization in the far field: implications for external defibrillation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 279, 1055-1070 (2000).
- Hammouda, M., Kinosita, R. The coronary circulation in the isolated heart. J Physiol. 61, 615-628 (1926).
- Salama, G., Hwang, S. M. Simultaneous optical mapping of intracellular free calcium and action potentials from Langendorff perfused hearts. Curr Protoc Cytom. 12, 17-17 (2009).
- Lou, Q. Quantitative panoramic imaging of epicardial electrical activity. Ann Biomed Eng. 36, 1649-1658 (2008).
- Salama, G. Properties of new, long-wavelength, voltage-sensitive dyes in the heart. J Membr Biol. 208, 125-140 (2005).
