आइस कैप विधि एक 96 अच्छी तरह प्लेटें और गैर विध्वंस फसल जड़ ऊतक में प्रत्येक अंकुर से पौधों को विकसित करने के लिए अनुमति देता है. इस रूट ऊतकों से निकाली डीएनए जीनोटाइपिंग प्रतिक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हमने पाया है कि आइस कैप के लिए अच्छी तरह से काम करता है<em> Arabidopsis thaliana</em>, टमाटर, चावल और seedlings.
It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named “Ice-Cap” because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.
आइस कैप यहाँ प्रस्तुत पद्धति एक वैज्ञानिक के लिए सैकड़ों या भी हजारों एक ही दिन में अलग – अलग पौधों की से ऊतकों के नमूनों को इकट्ठा करने और कुशलता से उन नमूनों से जीनोटाइपिंग प्रतिक्रियाओं में उपयोग के लिए जीनोमिक डीएनए निकालने में सक्षम बनाता है. एक व्यक्ति वैज्ञानिक seedlings के हजारों करने के लिए समय की एक छोटी अवधि में जीनोटाइप की क्षमता देकर, आइस कैप विधि आनुवंशिक प्रयोगों है कि अन्यथा प्रदर्शन करने के लिए व्यावहारिक नहीं होगा की एक संख्या की सुविधा की क्षमता है. कई उदाहरण नीचे प्रदान की जाती हैं.
iTILLING के पीछे विचार यह एक अल्पकालिक उत्परिवर्ती जनसंख्या है, जो टिकाऊ उत्परिवर्ती पारंपरिक tilling परियोजनाओं के लिए बनाई गई आबादी के विपरीत में खड़ा है उपज है. ITILLING के लिए, 50 से 100 आइस कैप ब्लॉक में एक bulked M2 आबादी से बीज बोया जाता है, और डीएनए आइस कैप विधि का उपयोग करने के लिए निकाला जाता है Arabidopsis seedlings तो 4 में रखा जाता है. डिग्री सेल्सियस जबकि उत्परिवर्तन स्क्रीनिंग डीएनए आइस कैप का उपयोग किया जाता है preps. टमाटर seedlings 12 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत कर रहे हैं. एक बार seedlings को ले जाने के लिए वांछित म्यूटेशन की पहचान की गई है, वे आइस कैप प्लेटों से बरामद कर रहे हैं और मिट्टी को हस्तांतरित. iTILLING स्क्रीन करने के लिए एक पूरे समुदाय अनुसंधान के लिए एक लंबे समय से स्थायी उत्परिवर्ती जनसंख्या प्रदान करने के लिए इरादा नहीं है. इसके बजाय, iTILLING एक रणनीति प्रदान करता है जिसके द्वाराएक वैज्ञानिक जीन की एक मुट्ठी में परिवर्तन के लिए एक कस्टम उत्परिवर्ती जनसंख्या जल्दी स्क्रीन, कुशलतापूर्वक, और एक अपेक्षाकृत कम लागत पर कर सकते हैं.
हम आइस कैप के लिए बढ़ रही है और जीनोटाइपिंग Arabidopsis, टमाटर, चावल, और के लिए एक प्रभावी तरीका हो पाया है. हमें उम्मीद है कि पौधों की अन्य प्रजातियां भी आइस कैप के लिए उत्तरदायी होना चाहिए. प्रजातियों की विविधता है कि आइस कैप द्वारा समायोजित किया जा सकता है पर एक सीमा के बीज के आकार है. काफी छोटे बीज के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं में फिट के साथ ही पौधों को इसके वर्तमान विन्यास में आइस कैप के साथ संगत हो जाएगा.
The authors have nothing to disclose.
यह काम राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या MCB-+०४४७७५०) से एक अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
GenoGrinder | Spex/CertiPrep, Metuchen, NJ | 2000 Geno/Grinder | Machine for shaking Root Plates for DNA extraction |
ABgene Thermo-Sealer | ABgene USA | AB-0384 | Manual heat sealing machine used to Root Plates prior to tissue disruption |
Centrifuge equipped with swinging microplate carriers | Beckman Coulter | Allegra 25R | Any centrifuge with swinging microplate carriers would be suitable |
MicroFill Microplate Dispenser | BioTek www.biotek.com |
AF1000A | Automated liquid dispenser for filling microplates |
Bialetti brand 17×11 inch Commercial Large Cookie Sheet | Target Department Store | www.bialetti.com | This specific cookie sheet has the ideal depth for Ice-Cap |
Custom Made Metal Rack | Hardware Store | See text for full description | |
33 Liter plastic storage box | Target Department Store | Sterilite Brand | For Ice-Cap Fountain. Plastic storage box large enough to hold the 17×11 inch cookie sheet |
30 gallon per hour Fountain Pump | Sunterra | 104506 | Small submersible fountain pump available at garden supply stores |
Hose for fountain pump | Any lab supply company | Hose compatible with fountain pump | |
Plastic Clamp | Hardware Store | Clamp to hold hose to cookie sheet | |
Clear plastic lids from Falcon Microtest flat bottom 96-well polystyrene plates | BD Falcon www.bdbiosciences.com |
351172 | Clear plastic lids for covering Ice-Cap Seedling Plates |
3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
3/32-inch diameter stainless steel balls | Hartford Technologies, Rocky Hill, CT | 034-006-1K | Used to disrupt root tissue after harvest |
3 inch Elastic hair bands | Local grocery store | Used to secure Root Plate to Seedling Plate | |
4 mm diameter wooden skewers | Local grocery store | These skewers are typically used to prepare kabobs | |
Fisher Scientific Nunc brand, 1-mL filter plates without frit | Fisher Scientific | 278012 | 96-well Seedling Plates with holes in bottom. |
Fisherbrand 96-Well Tall-Chimney PCR Plate | Fisher Scientific | 14-230-242 | 96-well Root Plates |
Agar – cell culture tested | Sigma-Aldrich | A1296 | |
4-Morpholinoethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M2933 | |
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Sigma-Aldrich | M-5524 | |
Easy Peel heat sealing foil | ABgene USA | AB-0745 | Heat sealing film for sealing Root Plates prior to tissue disruption |
Duck Brand Extra Wide Packaging Tape, 3.00″ x 54.6 yd | OfficeMax www.officemax.com |
Item no. 21242139 | Adhesive tape for sealing microplates containing DNA extracts for storage |
Sealing Roller | Bio-Rad | MSR-0001 | Hand held rolling tool for pressing adhesive sealing tape onto microplates |
96-well metal thermal block | Cole-Parmer | 36400-66 | Used to freeze the Root Plates for tissue harvest |
Whatman Filter paper | Whatman International | 1002 090 | Used for surface sterilizing seeds |
Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | 5 ¾”disposable Pasteur pipette used for transferring seeds to Seedling Plate |
Pyrex baking dish (20 cm x 30 cm) | Target Department Store | Used to construct a dry ice/ethanol bath. |