Summary
아이스 캡 방식은 하나가 각 묘목의 96 - 웰 플레이트 및 비 destructively 수확 루트 조직에 식물을 성장 할 수 있습니다. 이 루트 조직에서 추출한 DNA는 genotyping 반응에 사용될 수 있습니다. 우리는 얼음 모자가 잘 작동하는지 발견
Abstract
그것은 식물이 다수의 genotyping을 필요로 프로젝트를 개발하기 위해 식물 과학자에 대한 일반지고 있습니다. 모든 genotyping 프로젝트의 첫 번째 단계는 각각의 공장에서 조직 샘플을 수집하는 것입니다. 이 작업에 대한 전통적인 접근 방식은 샘플 식물 하나에서 - - 시간입니다. 개인의 유전자형 수백 또는 수천 한 소망 그러나, genotyping 파이프라인에 상당한 병목 현상이 전략 결과를 사용하는 경우. 우리가 여기서 설명하는 아이스 캡 방식은 과학자 한사람 하루 1,2에서 수천 모종의 조직을 수집할 수 있도록 허락해하여이 도전하는 높은 처리량 솔루션을 제공합니다. 처리량이 수준은 조직이 아니라 하나에서 - - 시간보다, 식물의 96시 - 시간을 수확있다는 사실에 의해 가능하게됩니다.
아이스 캡 방법은 묘목의 성장, 조직 수확 및 DNA 추출을 수행하기위한 통합 플랫폼을 제공합니다. 얼음 모자의 기초는 seedli의 성장입니다96 - 웰 플레이트의 스택 쌍의에 ngs. 상단 접시의 우물 개별 모종은 발아되는 한천 성장 미디어의 플러그가 포함되어 있습니다. 뿌리는 한천 매체를 통해 구멍을 통해 상부 판을 종료하고, 낮은 플레이트가 포함된 물에 통과 아래로 성장합니다. 상단 플레이트에있는 묘목은 실온에서 유지하면서 DNA 추출, 뿌리 조직을 포함하는 낮은 접시에 물이 조직을 수확하는 것은 급속 냉동입니다. 상부 판은 다음 얼음과 96 가능한 모종 한 판에 얼어 붙 어서 96 루트 조직 샘플 한 접시를 항복, 멀리 낮은 접시에서 벗겨 있습니다. 그것은 루트 조직을 캡처하는 얼음을 사용하기 때문에이 기술은 "아이스 모자"라는 것입니다. 묘목을 포함한 96 - 웰 플레이트 다음 호일에 싸여과 낮은 온도로 전송하실 수 있습니다. 이 과정은 모종의 추가 성장을 정직 시키실지만, 그들의 생존에 영향을주지 않습니다. 유전자형 분석이 완료되면 원하는 유전자형과 모종은 96 잘 P에서 전송할 수 있습니다자세한 전파를 위해 토양에 늦었어요. Arabidopsis thaliana 우리는, 토마토, 그리고 쌀 모종을 사용하여 아이스 캡 방식의 유틸리티를 증명하고있다. 우리는 방법도 96 - 웰 플레이트의 우물에 들어갈만큼 작은 씨앗과 식물의 다른 수종에 적용되어야한다고 기대합니다.
Protocol
1. 한천 성장 미디어와 함께 아이스 캡 묘목 플레이트를 준비
용융 성장 미디어 (0.5X Murashige와 Skoog (MS) 기초 소금 혼합물, 2 MM Morpholinoethanesulfonic 산성 (MES), 0.6 %의 한천 (W / V), 산도 5.7) MicroFill의 Microplate 디스펜서를 사용하여 autoclaved 묘목 판에 적절합니다. 미디어 중 하나 리터 18 묘목 판마다 필요합니다.
- 나사 상단 뚜껑 20 분 압력솥과 일리터 유리병 성장 미디어를 준비합니다.
- 나사 상단 뚜껑이있는 유리병에 증류수의 압력솥 일리터. 동시에 또한 알루미늄 호일에 싸서 빈 묘목 번호판을 압력솥.
- 65 보육 세트에 autoclaved 미디어 및 물을 전송 ° C. 이 온도는 용융 상태에서 성장 미디어를 유지합니다.
- autoclaving 후, 호일 및 건조 층류 후드의 위치에서 묘목 판을 제거합니다. 접시는 접착제 포장 테이프 수 있도록 진행하기 전에 완전히 건조되어야합니다완전히 접시의 우물의 바닥에있는 구멍을 밀봉.
- 살균에 95 % 에탄올로 실험실 벤치를 닦아주십시오.
- 살균에 95 % 에탄올의 묘목 판에 대한 투명한 플라스틱 뚜껑을 만끽해보세요. 에탄올과 층류 흐름 후드의 건조한 공기로부터 피부를 제거합니다. 그들은 압력솥에 용해되므로 플라스틱 뚜껑이 그들을 소독하기 위해 압력솥하지 마십시오.
- 각 묘목 플레이트의 하단에 포장 테이프를 적용하고 단단히 롤러 도구를 사용하여 밀봉.
- 65 ° C.에서 설정 물을 욕조에 용융 성장 미디어 및 소독 물 병 장소
- MicroFill 기계에 실온에서 70 % 에탄올을 포함하는 병을 첨부하여 퍼지주기에게 MicroFill 기계의 배관을 살균하기 위해 두 번 실행합니다.
- MicroFill 기계 멸균 물을 병을 첨부합니다. 퍼지주기에게 배관을 따뜻하고 시스템의 에탄올을 취소 6 번 실행합니다. 물의 병이 절차를 통해 65 ° C의 욕조에 남아 있어야.
- 멸균 물을 purges를 완료한 후 즉시 MicroFill 기계 용융 성장 미디어의 병을 연결합니다. 퍼지주기에게 배관 밖으로 증류수를 비우는 두 번 실행합니다. 성장 미디어 병이 절차를 통해 65 ° C의 욕조에 남아있는 것입니다.
- 각 묘목 플레이트의 우물로 성장 미디어 450 microliters을 분배. 성장 미디어 MicroFill 기계의 배관에서 응고되지 않는 신속 있도록 작동합니다.
- 묘목 판의 모든 충만되었을 경우, 즉시 MicroFill 기계 65 ° C 살균 물 한병을 부착하고 퍼지주기에게 배관 청소를 12 번 실행합니다. 물의 병이 절차를 통해 65 ° C의 욕조에 남아있는 것입니다.
- MicroFill 기계를 사용할 수없는 경우, 묘목 번호판도 손으로 pipetting 멀티채널 pipettor를 사용하여 봉인 접시에 녹은 한천을하여 준비하실 수 있습니다.
- 각 묘목 판의 t의 우물을 검사O는 성장 미디어 어떤 우물 밖으로 유출되지 않았음을 확인합니다. 개별 웰스에 핸드 피펫 추가 용융 성장 매체로 필요했습니다.
- 투명한 플라스틱 뚜껑과 각각의 접시를 커버하고, 성장 미디어 실온에서 묘목 강판의 응고 수 있습니다. 스택 접시와 4 스토리지를위한 알루미늄 호일에 포장 ° C. 스토어 번호판 거꾸로 저장하는 동안 우물에서 물을 축적을 방지하기 위해.
2. 아이스 캡 묘목 플레이트와 발아 모종에 씨를 뿌리다 씨앗
우리는 이전 씨앗 로딩 장치 (2)를 사용하여 묘목 판에 Arabidopsis 종자를 분배를위한 세미 - 자동화된 방법을 설명합니다. 이 장치는 씨앗의 일부 배치에 대해 유용할 수 있지만, 우리는 Arabidopsis 종자의 다른 일괄하여 표시 씨앗 크기의 다양성이 장치의 일반 유틸리티를 제한 것으로 나타났습니다. 우리는 BU, 종자 분배에 대한 대안 자동화된 방법을 개발하는 과정에 있습니다현재 우리는 묘목 판에 씨앗을 분배를위한 가장 효과적인 전략은 아래에 설명된대로 수동으로이 단계를 수행하는 것입니다 T를 발견했습니다.
- 워트 먼지 필터 종이에 마른 씨앗을 뿌린다.
- 씨앗의 모든 에탄올 덮여 있도록 씨앗에 95 % 에탄올을 분배. 이 치료는 표면 씨앗을 소독합니다.
- 씨앗은 건조 공기를 허용합니다.
- 수정된 일회용 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 묘목 플레이트의 우물에 개인 씨앗을 전송합니다. 파스퇴르 피펫의 끝 부분은 팁을 불타는으로 날인합니다. 그 결과 유리 팁은 부드럽게 하나의 씨앗이 쉽게 포착하고 묘목 플레이트의 우물에서 한천의 표면에 전송할 수있는 한천 매체에 만져 moistened있다. 이 종자 도금 도구의 두 개 달린 버전도 처리량을 증대하는 데 사용할 수 있습니다.
- Micropore 수술 테이프와 함께 투명한 플라스틱 뚜껑을 날인하여 각 묘목 플레이트를 커버. 쌓인 접시, 은밀히4 알루미늄 호일 및 매장 Arabidopsis의 종자와 ° C는 나흘 동안 씨를 계충화하다하고 발아를 동기화합니다. 토마토 씨앗은 나흘 동안 12 ° C에서 어둠에 보관해야합니다.
- 18 ° ~ 20 ° C 발아를 시작으로 형광등 아래의 묘목 판을 놓습니다.
3. 아이스 캡 분수에 묘목 번호판을 전송
묘목 판은 나흘 동안 불빛 아래되었습니다 후 아이스 캡 분수에 묘목 번호판을 전송할 수 있습니다. Arabidopsis 들어, 묘목은 일반적으로 10~14일위한 아이스 캡 분수대에 남아 있습니다.
- 플라스틱 저장 상자 안에 위치되어 사용자 정의 랙 구조의 상단에 쿠키 시트를 배치하여 아이스 캡 분수를 조립. 쿠키 시트의 수준을 조정하는 레벨링 너트를 사용하십시오. 저장 상자에 잠수 펌프를 놓고 스프링로드 CIA 요원을 사용하여 펌프의 쿠키 시트 측면에 출력 호스를 연결MP. 아이스 캡 분수의 표면이 직접 형광등 조명을받는 있도록 식물의 성장 룸이나 성장 챔버의 선반에있는 얼음 모자의 분수를 조립.
- 3 부품 증류수 한 부분 수돗물로의 혼합물과 함께 아이스 캡 분수를 입력합니다. 잠수 펌프 수위 아래 몇 cm 때까지 물이 분수에 추가되어 있어야합니다. 실험실 테이프를 사용하여 플라스틱 저장 상자에 최종 수위 및 마킹 펜을 표시합니다.
- 루트 플레이트의 각 잘 한 3/32-inch 직경 스테인레스 스틸 볼을 추가하여 루트 번호판을 준비합니다.
- 스테인레스 스틸 공은 공 분배 장치 1을 만든 사용자 정의를 사용하여 루트 판에 추가할 수 있습니다. 이 장치는 96 - 웰 PCR 플레이트의 표면 위에 알루미늄 호일의 단일 시트를 배치하고 포일의 표면에 각 우물의 센터 위치를 표시하는 표시 펜을 사용하여 이루어집니다. 호일이 표시된 시트는 다음을 위해 알루미늄의 추가 6 용지의 상단에 위치IL 및 사용 피펫 팁 상자에서 뚜껑의 매끄러운 표면 주위를 감쌌다. 같은 나무 꼬치로 날카로운 도구는 다음 96 위치의 각 단일 금속 공을 가질 정도로 큰 잔디를 만드는 데 사용됩니다. 불알이 분배 장치를 채우기 위해, 금속 공의 초과는 장치로 부어 그리고 그것은 부드럽게 여분의 공을 제거하는 흥분 상태입니다. 루트 플레이트는 다음 루트 플레이트의 각 잘 하나의 볼을 드롭으로 이성을 상실하는 분배 장치의 맨 위에 배치됩니다.
- MicroFill 기계를 사용하여 루트 플레이트의 각 잘 ~ 3 부품 증류수 한 부분 수돗물로의 혼합물의 340 microliters을 추가합니다. 철강 공이 물을 분배하기 전에 루트 판에 추가되었는지 확인하십시오.
- 묘목 플레이트의 하단에서 접착 필름 껍질과 접시에서 투명한 플라스틱 뚜껑을 제거합니다. 금속 공 및 물을 포함하는 루트 플레이트의 각 묘목 플레이트를 삽입 두 탄성 하이를 사용하여 함께 두 개의 접시를 확보R 밴드.
- 아이스 캡 분수에 쌓인 얼음 모자의 접시를 놓습니다. 접시는 아이스 캡 분수의 경우 투명한 플라스틱 뚜껑은 사용하지 않아야합니다. 잘 묘목 플레이트의 A - 01은 루트 접시의 잘 A - 01 정렬되어 있는지 확인하십시오.
- 묘목의 대다수는 루트 판으로 침투가 루트 조직 때까지 스택 묘목 / 루트 플레이트는 아이스 캡 분수에 남아 있어야합니다. 아이스 캡 분수에 Arabidopsis 모종에 대한 이상적인 성장 온도는 CA입니다. 18 ° C. 쿠키 시트에있는 수위는 묘목 플레이트에있는 묘목이 침수되도록 깊은 그러한 물이 루트 플레이트의 우물로 흘러 수 있지만, 안됩니다. 수위가 올바르지 않을 경우 정확한 깊이의 다른 쿠키 시트를해야합니다.
- 원래 수위를 유지하기 위해 아이스 캡 분수 정기적으로 증류수를 추가합니다. 분수에 순수한 증류수를 추가함으로써 당신은을 교체합니다액체가 분수대에 물을 미네랄 성분을 변경하지 않고 증발로 인한 손실. 수위는 매일 아이스 캡 분수에 확인하여야한다.
4. 수확 루트 조직
루트 조직은 루트 플레이트에 물을 동결하고 루트 플레이트에서 멀리 묘목 플레이트를 필링으로 수확됩니다.
- 일 루트 조직을 수확하기 전에, 아이스 캡 분수에서 쌓인 얼음 모자 플레이트를 제거합니다.
- 스택 묘목 및 뿌리 플레이트의 우물 간의 세 번의 나무 꼬치를 삽입합니다. 꼬치의 목적은 냉동 과정에 대비하여 루트 플레이트의 우물의 묘목 판의 높으신 양반을 마련하는 것입니다.
- 불빛 아래에서 밤새 서서 삽입 나무 꼬치로 쌓인 얼음 모자의 번호판을 허용합니다. 이 부화는 이후 동결 플레이트 분리 프로세스를 용이하게 루트 플레이트에 액체 약간 증발 수 있습니다.
- 에조직의 수확 하루, 냉동 목욕을 준비합니다. 드라이 아이스와 95 % 에탄올의 혼합과 pyrex 접시에 96 잘 금속 열 블록을 삽입합니다. 열 블록이 CA에 대한 온도의 평형 수 있습니다. 20 분. 같은 낮은 온도가 실험실 벤치의 표면을 손상하지 않도록 벙어리 장갑 압력솥으로 절연 재료의 일부 유형의 상단에있는 Pyrex 요리를 놓습니다.
- 5 분 차게 열 차단과 부화에 나무 꼬치와 스택 아이스 캡 접시를 놓습니다. 이 시간 동안 루트 플레이트에있는 물이 얼어 고체 것입니다. 묘목 플레이트의 모종이 치료 기간 동안 동결하고 완벽하게 가능한 유지하지 않습니다.
- 열 블록에서 스택 아이스 캡 접시를 제거하고 실온에서 실험실 벤치에서 그들을 놓으십시오. 탄성 밴드 및 스택 접시에서 나무 꼬치를 제거합니다. 단단히 번호판을 "균열"로 묘목 플레이트의 맨 아래로 누르십시오. 다음 조심스럽게 루트 플레이트와 묘목 플레이트 AP 껍질예술.
- 루트 플레이트에있는 물이 상온에서 해동하도록 허용합니다. 해동은 25 세트 열 블록 ° C.에있는 루트 번호판을 잠복기로 긴급 수 있습니다
5. 어둠에 저온에서 보관 묘목 플레이트를
조직 수확 다음, 묘목의 플레이트는 유전자형 분석이 수행되는 동안 묘목의 생존을 유지 저온에서 어둠에 저장할 수 있습니다. 모종은 생존에 영향을주지 않고 몇 주 동안이 온도에서 저장할 수 있습니다.
- 접착제 테이프와 묘목 판의 하단 부분을 밀봉, 조직 수확을 따라.
- 묘목 플레이트 위에 투명한 플라스틱 뚜껑을 놓고 micropore 테이프 확보.
- 함께 여러 묘목 접시를 쌓아 알루미늄 호일에 포장.
- Arabidopsis 모종 들어, 4 접시에 배치 ° C. 토마토 모종을 위해, 12 ° C.에 접시를 배치 일단 genotyping은 SE가 완료edlings이 저온 배양에서 제거하고 아래에 설명된대로 토양에 이식 수 있습니다.
6. DNA 추출
PCR 반응에 적합한 DNA가 쉽게 루트 조직 샘플에서 추출한 수 있습니다. Arabidopsis 루트 조직 샘플에서 발견한 총 DNA의 수율은 CA입니다. 평균 2 400 NG.
- 루트 강판에 물이 완전히 DNA 추출 절차를 수행하기 전에 해동이 있는지 확인합니다. 모든 우물이 평균보다 상당히 적은 물을 가지고 있는지 확인하기 위해 번호판을 검사합니다. 핸드 피펫 추가 물을 필요로 우물로 물을 소주.
- 루트 판의 각 잘한다 트리스 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 용액 (50 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), pH8 500 MM 트리스, 산도 8) 25 microliters를 추가하는 MicroFill 시스템을 사용합니다.
- 열 씰링 호일과 열 씰링 기계를 사용하여 루트 플레이트의 우물을 봉쇄해.
- 와 GenoGrinder 머신에 봉인 루트 접시를 놓습니다아래로 직면하고있는 접시의 밀봉 끝. 이 플레이트 방향은 최적의 비드 움직임을 제공하고 우물의 고집에서 비즈를 방지할 수 있습니다. 분당 1,350 스트로크에서 3 ½ 분에 대한 GenoGrinder에서 접시를 흔들어.
- microplate 캐리어와 함께 원심 분리기에 접시를 전송하고 4 3,500 RPM에서 10 분 동안 접시를 스핀 ° C를 펠렛에 박살 나자 루트 조직.
- 그 결과 희석 추출 직접 PCR 반응에 사용할 수있는 게놈 DNA가 포함되어 있습니다. 일반적으로 하나는 PCR 반응이 DNA 추출물 2 microliters 추가됩니다.
- DNA 샘플을 저장하기 위해, 마이너스 20 접착 테이프 포장과 장소를 사용하여 microplate를 밀봉 ° C. DNA 샘플은 품질 뚜렷한 감소로 몇 달 동안 저장할 수 있습니다.
7. 토양에 원하는 유전자형과 모종를 전송
유전자형 분석이 완료되면, 원하는 유전자형과 모종은 묘목에서 전송할 수토양에 번호판입니다.
- 냉장에서 묘목 판을 제거하고 물 - 포화 토양 혼합물과 냄비를 준비합니다.
- 묘목 플레이트에서 개별 묘목을 제거하려면, 한 묘목을 분쇄하지 않고 한천 플러그를 잡고 수있는 집게를 사용합니다. 포셉과 한천 플러그를 잡고 부드럽게 묘목을 손상하지 않도록주의되는 묘목 플레이트 밖으로 한천 플러그를 끼웁니다. 또는 가압 공기가 부드럽게 한천 플러그와 잘 밖으로 묘목을 촬영하는 데 사용할 수 있습니다. 플러그는 실험실 벤치에 빠져 팝업까지 잘 하단에있는 작은 구멍에 압력을 적용합니다.
- 토양 한천 플러그의 크기에 작은 구멍을 준비합니다. 토양에있는 한천 플러그를 놓고 토양의 묘목을 확보하기 위해 한천 플러그 주위에 촉촉한 흙을 팩. 묘목 주변의 한천 중 하나를 제거하지 마십시오.
- 표준 성장 조건에서 성장 방에 이식 묘목를 놓습니다. 의 플라스틱 뚜껑이있는 냄비를 커버첫째 이일 이식 후. 이후 뚜껑을 제거하고 표준 약관을 사용하여 식물의 성장을 계속합니다.
8. 대표 결과 :
아이스 캡 시스템을 사용 재배 Arabidopsis 모종의 예제는 그림 4A에 표시됩니다. 이 모종은 사진이 언제 찍혔는지 두 주 동안 아이스 캡 분수대에되고 조직 수확 준비가되었다했다. 이와 같은 묘목의 뿌리 조직은 그림 4B에 표시됩니다. Arabidopsis 루트 조직 중 하나를 샘플에서 추출한 DNA의 총 금액 700 NG 2-100 NG의 범위에서 일반적이다. 이 항복 계산은 원유 루트 추출물의 한 부분의 사용에 따라 달라집니다. 때문에 CA 전용입니다. 원유 루트 추출물의 10 %가 일반적으로 DNA 추출 과정에 사용되는, 그것은 원유 추출물의 자세한 내용을 유지하여 스트림 분석을 위해 훨씬 더 많은 게놈 DNA를 얻을 수 있습니다. 게놈 DNA의 총 금액은 사용 얻은 아이스를모자 절차는 PCR 반응 2 백을 수행하기 위해 충분하다.
그림 1 : 아이스 캡 프로세스의 플로우 차트. 모종은 발아되는 한천 성장 미디어를 포함) 묘목 플레이트. 뿌리는 한천을 침투하고 접시의 바닥을 향해 내려 성장. 접시의 우물의 바닥에 구멍이 접착제 필름으로 봉인하고 있습니다. B) 묘목 플레이트는 루트 플레이트가 포함된 물의 상단과 금속 공에 쌓인 것입니다. 뿌리는 묘목 플레이트의 우물의 바닥에있는 구멍을 종료하고 루트 플레이트의 우물로 성장합니다. 스택의 ice cap 플레이트가 드라이 아이스 / 에탄올 목욕탕에 thermoblock에 배치되기 전에 C) 나무 꼬치는 하루 묘목 플레이트와 루트 플레이트 사이에 삽입됩니다. 루트 플레이트에있는 물이 꽁꽁 얼어되면 D), 묘목 플레이트는 96 조직 샘플 루트 플레이트를 항복, 루트 플레이트 멀리 벗겨입니다96 가능한 묘목과 묘목 플레이트. 나무 꼬치는이 단계에서 두 접시의 분리를 용이하게합니다.
그림 2 : 묘목 플레이트와 루트 플레이트의 사진. A) 묘목 플레이트 별도로 볼 루트 플레이트. B) 묘목 플레이트 루트 플레이트 위에 했답니다. DNA 추출에 사용되는 철강 공은 루트 플레이트의 우물에서 볼 수 있습니다. 탄성 밴드는 함께 두 접시를 확보하는 데 사용됩니다.
그림 3 : 아이스 캡 분수. 아이스 캡 분수는 루트 플레이트의 우물의 정상의 정확한 높이에서 일정한 수위를 유지하는 데 사용됩니다. 이 지속적인 급수 시스템은 루트 접시의 우물에서 물을 증발이나 증산에 의한 열화가되지 않는다는 것을 보장합니다. A) 집에서 만든 랙그것은 스택 아이스 캡 플레이트가 앉아있는 쿠키 시트를 지원합니다. B) 일정한 수심이 분수의 표면에 걸쳐 달성되도록 정확하게 쿠키 시트의 수준을 조절하는 수단을 제공하는 1 "너트 중 하나의 클로즈업 전망. C)이 이미지의 모든 표시 부품 아이스 캡 분수. D) 조립 아이스 캡 분수에 대한 집에서 만든 랙을 구축하는 데 필요한. 잠수 분수 펌프가 지속적으로 낮은 저수지에서 집에서 만든 상단에 달려 쿠키 시트에 물을 이동 랙. 스프링로드 클램프는 쿠키 시트의 가장자리에 호스를 연결하는 데 사용됩니다.
그림 4 : Arabidopsis 모종의 얼음 모자 프로세스를 사용하여 성장. A) 톱 전망 묘목 플레이트의 두 우물로 내려보고. 각 우물 Arabidopsis 묘목이 포함되어 있습니다. 루트 플레이트의 두 우물의 B) 측면 볼 수 있습니다. 뿌리는 복잡하게 볼 수 있습니다우물의 내부 표면 주위. 이 사진의 모종은 CA의 아이스 캡 분수에 있었다. 이주 및 조직 수확이 정상적으로 수행 될의 성장 단계에 있습니다.
Discussion
여기에 제시 아이스 캡 방법은 하루에 각 식물의 수백, 또는 수천의 조직 샘플을 수집하고 효율적으로 genotyping 반응에 사용하기 위해 이러한 샘플에서 게놈 DNA를 추출 한 과학자 수 있습니다. 개별 과학자 시간의 짧은 기간에 모종의 수천을 유전자형 수있는 능력을 제공함으로써, 아이스 캡 방식은 다르게 수행하는 실용적 않을 유전자 실험의 숫자를 촉진시킬 잠재력이있다. 몇 가지 예제가 아래에 제공됩니다.
- 유전자 매핑. 연구원은 염색체 3 따라 특정 간격 내에 재조합 이벤트를 식별할 수있다면 미세 규모의 유전자 매핑을 빠른 수 있습니다. 이 간격이 매우 짧은 유전자 거리를 포함한다면, 재조합 이벤트 segregating 매핑 인구 비교적 드문 것입니다. 이런 이유로, 그것은 원하는 다시 찾을 개별 식물의 화면 수천해야 할 수도 있습니다combinant 개인. 이 과정은 크게 얼음 모자의 사용을 통해 빠른 수 있습니다. 심지어 게놈 와이드 다시 시퀀싱의 시대에 직접 주어진 돌연변이가 관심의 표현형 직접 책임이있다는 것을 입증하는 여전히 필요합니다. 이러한 경우에는, 그것은 후보 변이 실제로 원인이되는 것입니다 증명하기 위해 다른 밀접하게 연결된 돌연변이 떨어져 관심의 변이를 분리하기 위해 필요합니다. 이러한 상황에서는, 아이스 캡은 밀접하게 연결된 한 쌍의 변이 사이의 연동을 깨는위한 효율적인 방법을 제공합니다.
- 멀티 돌연변. 그것은 기능 중복 4-6을 극복하기 위해 하나의 개인으로 몇 가지 별개의 loci에서 돌연변이 대립 유전자를 조합하여 Arabidopsis를 공부하고 연구에 대한 일반되었다. 예를 들어, 하나는 유전자 횡단을 통해 단일 공장으로 네 가지 loci에서 돌연변이 대립 유전자를 결합하고자 사건을 고려하십시오. 이 프로젝트에 대해, 그것은을 생성하는 데 필요한 것입니다횡단 계획의 일환으로이 네 loci에서 heterozygous있다 N 개별. 이 사중 - heterozygote 세트의 씨앗이, 사중 homozygote는 자손의 결과 인구 256의 밖으로 하나의 비율로 존재 것으로 예상하는 경우. 전통적인 방법으로이 드문 개인에 대한 선별하는 것은 매우 노동 집중 것입니다. 비교함으로써,이 프로젝트 얼음 모자를 사용하면 하나의 세대에 희귀한 사중 homozygote 식별을 위해 효율적인 전략으로 과학자를 제공할 것입니다.
- iTILLING. 저희 연구실은 최근 Arabidopsis 7의 관심 유발 변이 유전자의 존재를 검사하기위한 새로운 접근 방식을 설명했다. 이 방법은 화학 mutagen 80-10로 치료 개인의 주문 인구의 변이를 찾을 사용되는 TILLING라는 설립된 기술에 대한 변화이다. 그것이 산업 있습니다 TILLING의 개별 버전이기 때문에 우리는 우리의 방법 iTILLING 이름을 붙여 놨ividual 과학자는 전통적으로 완료하는 데 큰 연구팀 필요가 무언가를 달성할 수 있습니다. 아래에 설명된대로 아이스 캡은 iTILLING 방법 7의 중요한 부분을 형성한다.
iTILLING 뒤에 아이디어는 전통적인 TILLING 프로젝트 만든 내구성 돌연변이 인구 대비 서 임시 돌연변이 인구를 생산하는 것입니다. iTILLING 들어, bulked M2 인구의 종자가 50-100 얼음층 블록에 sown하고 있으며, DNA는 아이스 캡 방법을 사용하여 추출됩니다. Arabidopsis 모종은 다음 4에 배치됩니다 ° C 돌연변이 검사는 아이스 캡 DNA를 사용하여 수행하는 동안 preps. 토마토 모종은 12 ° C.에 저장됩니다. 모종 운반 원하는 돌연변이가 확인되고 나면, 그들은 아이스 캡 접시에서 회복하고 흙으로 전송됩니다. iTILLING는 화면 전체 연구 커뮤니티에 대한 지속적인 돌연변이 인구를 제공하기위한 것이 아닙니다. 대신, iTILLING는 전략을 제공하는과학자 한사람 효율적으로, 그리고 상대적으로 낮은 비용으로 신속하게 유전자의 소수의 돌연변이에 대한 사용자 지정 돌연변이 인구를 스크린 수 있습니다.
우리는 Arabidopsis, 토마토, 그리고 쌀을 재배하고 genotyping을위한 효과적인 방법으로 얼음 모자를 발견했습니다. 우리는 식물의 다른 종류도 아이스 모자 의무가되어야한다는 기대합니다. 아이스 캡에 의해 수용 수있는 수종의 다양한 한 제한은 종자의 크기입니다. 96 - 웰 플레이트의 우물에 들어갈만큼 작은 씨앗과 식물만이 현재 구성에서 아이스 모자와 호환됩니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 과학 재단 (부여 번호 MCB - 0447750)에서 부여에 의해 투자되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GenoGrinder | Spex/CertiPrep, Metuchen, NJ | 2000 Geno/Grinder | Machine for shaking Root Plates for DNA extraction |
| ABgene Thermo-Sealer | ABgene Limited | AB-0384 | Manual heat sealing machine used to Root Plates prior to tissue disruption |
| Centrifuge equipped with swinging microplate carriers | Beckman Coulter Inc. | Allegra 25R | Any centrifuge with swinging microplate carriers would be suitable |
| MicroFill Microplate Dispenser | BioTek | AF1000A | Automated liquid dispenser for filling microplates |
| Bialetti brand 17x11 inch Commercial Large Cookie Sheet | Target Department Store | www.bialetti.com | This specific cookie sheet has the ideal depth for Ice-Cap |
| Custom Made Metal Rack | Hardware Store | See text for full description | |
| 33 Liter plastic storage box | Target Department Store | Sterilite Brand | For Ice-Cap Fountain. Plastic storage box large enough to hold the 17x11 inch cookie sheet |
| 30 gallon per hour Fountain Pump | Sunterra | 104506 | Small submersible fountain pump available at garden supply stores |
| Hose for fountain pump | Any Supplier | Hose compatible with fountain pump | |
| Plastic Clamp | Hardware Store | Clamp to hold hose to cookie sheet | |
| Clear plastic lids from Falcon Microtest flat bottom 96-well polystyrene plates | BD Biosciences | 351172 | Clear plastic lids for covering Ice-Cap Seedling Plates |
| 3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
| 3/32-inch diameter stainless steel balls | Hartford Technologies, Rocky Hill, CT | 034-006-1K | Used to disrupt root tissue after harvest |
| 3 inch Elastic hair bands | Local Grocery Store | Used to secure Root Plate to Seedling Plate | |
| 4 mm diameter wooden skewers | Local Grocery Store | These skewers are typically used to prepare kabobs | |
| Fisher Scientific Nunc brand, 1-mL filter plates without frit | Fisher Scientific | 278012 | 96-well Seedling Plates with holes in bottom. |
| Fisherbrand 96-Well Tall-Chimney PCR Plate | Fisher Scientific | 14-230-242 | 96-well Root Plates |
| Agar - cell culture tested | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| 4-Morpholin–thanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Sigma-Aldrich | M-5524 | |
| Easy Peel heat sealing foil | ABgene Limited | AB-0745 | Heat sealing film for sealing Root Plates prior to tissue disruption |
| Duck Brand Extra Wide Packaging Tape, 3.00" x 54.6 yd | Office Max | Item no. 21242139 | Adhesive tape for sealing microplates containing DNA extracts for storage |
| Sealing Roller | Bio-Rad | MSR-0001 | Hand held rolling tool for pressing adhesive sealing tape onto microplates |
| 96-well metal thermal block | Cole-Parmer | 36400-66 | Used to freeze the Root Plates for tissue harvest |
| Whatman Filter paper | Whatman, GE Healthcare | 1002 090 | Used for surface sterilizing seeds |
| Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | 5 ¾"disposable Pasteur pipette used for transferring seeds to Seedling Plate |
| Pyrex baking dish (20 cm x 30 cm) | Target Department Store | Used to construct a dry ice/ethanol bath. | |
References
- Clark, K. A., Krysan, P. J. Protocol: An improved high-throughput method for generating tissue samples in 96-well format for plant genotyping (Ice-Cap 2.0). Plant Methods. 3, 8-8 (2007).
- Krysan, P. I. ce-cap A high-throughput method for capturing plant tissue samples for genotype analysis. Plant Physiol. 135, 1162-1169 (2004).
- Jander, G. Arabidopsis map-based cloning in the post-genome era. Plant Physiol. 129, 440-450 (2002).
- Liljegren, S. J. SHATTERPROOF MADS-box genes control seed dispersal in Arabidopsis. Nature. 404, 766-770 (2000).
- Buechel, S. Role of A-type ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATORS in meristem maintenance and regeneration. Eur. J. Cell. Biol. 89, 279-284 (2010).
- Krysan, P. J., Jester, P. J., Gottwald, J. R., Sussman, M. R. An Arabidopsis mitogen-activated protein kinase kinase kinase gene family encodes essential positive regulators of cytokinesis. Plant Cell. 14, 1109-1120 (2002).
- Bush, S. M., Krysan, P. J. iTILLING: a personalized approach to the identification of induced mutations in Arabidopsis. Plant Physiol. 154, 25-35 (2010).
- Comai, L., Henikoff, S. TILLING: practical single-nucleotide mutation discovery. Plant J. 45, 684-694 (2006).
- Henikoff, S., Till, B. J., Comai, L. TILLING. Traditional mutagenesis meets functional genomics. Plant Physiol. 135, 630-636 (2004).
- McCallum, C. M., Comai, L., Greene, E. A., Henikoff, S. Targeting induced local lesions IN genomes (TILLING) for plant functional genomics. Plant Physiol. 123, 439-442 (2000).
