Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

A Simple Chelex protokol til DNA-ekstraktion fra Published: January 9, 2013 doi: 10.3791/3281
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1Malaria Institute at Macha, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health

Summary

En hurtig og billig måde at udtrække kvalitet malaria parasitten og vektor-DNA fra myg prøver er beskrevet. Udnyttelse af chelaterende egenskaber Chelex harpiks, muliggør den enkle metode genotypebestemmelse af malariaparasitter i mosquito mid-tarm og spytkirtel faser, samt molekylær identifikation af

Abstract

Endemiske lande tager i stigende grad molekylære værktøjer til effektiv maskinskrivning, identifikation og overvågning mod malariaparasitter og vektor myg, som en integreret del af deres bekæmpelsesprogrammer 1,2,3,4,5. For bæredygtig etablering af disse præcise metoder i operationer forskning for at styrke malaria kontrol og eliminering indsats, enkle og overkommelige metoder, med påholdende reagens og udstyr er afgørende 6,7,8. Her præsenterer vi en simpel Chelex-baseret teknik til at udvinde malaria parasitten og vektor-DNA fra marken indsamlede myg prøver.

Vi morfologisk identificerede 72 Anopheles gambiae sl. Fra 156 myg fanget af pyrethrum spray fangster i soverum i husholdninger i en 2.000 km 2 nærhed af Malaria Institut på Macha. Efter dissektion at adskille hoved og thorax fra maven for alle 72 Anopheles GAMbiae sl. myg blev de to sektioner anbringes individuelt i 1,5 ml mikrocentrifugerør og nedsænket i 20 ul deioniseret vand. Anvendelse af en steril pipettespids blev hver mosquito afsnit separat homogeniseret til en ensartet suspension i deioniseret vand. Af den efterfølgende homogenat fra hver myg sektion, blev 10 pi bibeholdes, mens den anden 10 ul blev overført til en separat autoklaveret 1,5 ml rør. De separate portioner blev udsat for DNA ekstraktion af enten forenklede Chelex eller standarden udsaltning ekstraktionsprotokol 9,10. Den udsaltning protokollen er såkaldt og almindeligt anvendt, fordi det anvender høje saltkoncentrationer i stedet for farlige organiske opløsningsmidler (såsom phenol og chloroform) for proteinet udfældningstrin under DNA-ekstraktion 9.

Ekstrakter blev anvendt som templates til PCR-amplifikation under anvendelse af primere rettet mod arthropod mitochondrial nikotinamidadenindinucleotid dehydrogenase (NADH) subunit 4-genet (ND4) at kontrollere DNA-kvalitet 11, en ​​PCR til identifikation af Anopheles gambiae søskende arter 10 og et nested PCR til typebestemmelse af Plasmodium falciparum-infektion 12. Sammenligning med DNA-kvalitet (ND4) PCR viste 93% følsomhed og 82% specificitet for Chelex fremgangsmåde i forhold til den etablerede udsaltning protokol. Tilsvarende værdier af følsomhed og specificitet var 100% og 78% under anvendelse af søskende artsidentifikation PCR og 92% og 80% for henholdsvis P. falciparum detektion PCR. Der var ingen signifikante forskelle i andelen af ​​prøver, der giver amplicon signal med Chelex eller den regelmæssige udsaltnings protokol over alle tre PCR-applikationer. Den Chelex tilgang, der kræves tre simple reagenser og 37 min at udfylde, mens den udsaltnings protokol indebar 10 forskellige reagenser og 2 timer og 47 min 'behandlingstid, herunder en overnatning skridt. Vores resultater viser thved Chelex metode kan sammenlignes med de eksisterende udsaltning ekstraktion og kan være substitueret som en enkel og holdbar fremgangsmåde i ressource-begrænsede miljøer, hvor en konstant reagens forsyningskæde er ofte vanskeligt at opretholde.

Protocol

1. Forberedende Dissektion af Mosquito Prøver

  1. Placer myg på en lille klipning af parafilm og montere på dissektionsmikroskop.
  2. Dækning i dråbe deioniseret vand for at blødgøre væv.
  3. Incise myg slagtekrop præcist ved samlingen mellem thorax og abdomen, og dermed huldannelse off hoved og brystkasse fra den abdominale sektion.
  4. Overfør hver dissekeret myg sektion ind i en ren autoklaveret 1,5 ml mikrocentrifugerør prelabeled med mosquito ID-nummeret detaljer og passende mærket at betegne kropsektionen (fx "m" for mid-gut sektion, "ht" for hoved og brystkasse afsnit).
  5. Kassér parafilm og omhyggeligt tørre mikroskop scenen med 70% alkohol-fugtet Kimwipe før behandlingen af ​​næste myg.

2. DNA-ekstraktion fra Mosquito Prøver

  1. Pipetter 20 ul deioniseret vand i prøverøret og anvendelse pipettespidsen til at slibe den nedsænkede mosquito sektion i en uniform suspension.
  2. Tilsæt 100 pi autoklaveret 1X PBS / 1% saponin opløsning til prøven homogenat og bland ved forsigtig momentan vortexing.
  3. Inkuber ved stuetemperatur i 20 minutter.
  4. Centrifuger ved 20.000 x g i 2 minutter og kasser supernatanten.
  5. Resuspender pellet i 100 ul 1X PBS.
  6. Der centrifugeres igen ved 20.000 x g i 2 minutter og kasser supernatanten.
  7. Ved forsigtig vortexing (5 sekunder), resuspender pellet i 75 pi sterilt deioniseret vand og 25 ul 20% w / v Chelex-100-harpiks suspension i deioniseret vand.
  8. Pierce hul i låget af prøverøret anvendelse af sterilt 23G kanyle flammede i bunsenbrænder.
  9. Boil prøve suspension i vandbad på flydende rack (eller varmeblok) i 10 minutter.
  10. Centrifuger ved 20.000 x g, i 1 min og overføres efterfølgende DNA-opløsning til prelabeled opbevaring hætteglas til anvendelse som template i PCR-applikationer.

3. Plasmodium falciparum Genotypebestemmelse og Anophelesspp. Molekylær Identifikation

  1. Tilsæt 2,5 ul af Chelex DNA ekstrakt i 25 ul PCR-reaktioner for at kontrollere DNA-kvalitet 11, identificerer Anopheles arter 10 og til genotype P. falciparum 12 mid-tarm og spytkirtler infektioner.
  2. For at maksimere amplicon udbytte, især for P. falciparum detektion, indbefatter 1,5 X bovint serumalbumin (BSA) i PCR-assayet. Det følgende reaktionsskema præparat anbefales: (2.5 pi template, 0,25 uM primere, 1,5 uM magnesiumchlorid, 200 uM dNTP'er, 1X PCR buffer, 1,5 x BSA og 1.0U Taq DNA-polymerase, i 25 gl volumener).
  3. At kontrollere, om DNA-kvalitet i ekstraktet, amplificere regionen af ​​leddyr mitochondrial nikotinamidadenindinucleotid dehydrogenase (NADH) subunit 4 (ND4)-gen (primere ND4FW [5'-GTD YAT TTA TGA TTR CCT ​​AA-3 '] og ND4RV [5' -CTT CGD CTT CCW ADW CGT TC-3 ']; forvente produkt 400bp) 11,13.
  4. At differentiere Anopheles Gambiae Sl. søskende arter (an. gambiae ss og An. arabiensis kun), forstærke region flankerer SNPs i den intergeniske afstandsstykket (IGS) region, (primere FN [5'-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 '], GA [5'-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 '], AR [5'-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3']; forvente produkt 390bp An gambiae ss, 315bp An arabiensis) 10,11.
  5. For at skrive P. falciparum-antifolat-lægemiddelresistens polymorfier, udføre nested PCR at amplificere regionen flankerende aminosyrekodoner 108, 51, 59, 16 og 164 i parasitten dihydrofolatreduktase (DHFR)-genet:
    Primære runde primere: M1 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 '] og M5 [5'-AGTATATACATCGCTAACAGA-3']
    Sekundære runde primere: M3 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 '] med F / [5'-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3']
    Eller
    F [5'-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] med M4 [5'-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 ']).
    Også forstærke område indeholdende aminosyrekodoner 436, 437, 540, 581 and 613 i P. falciparum dihydropteroate synthetase (DHPS) genet:
    Primær runde primere R2 [5'-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 '] med R / [5'-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3'];
    Sekundære runde primere
    J: [5'-»TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3 '] med K / [5'-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3']
    Eller
    K: [5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 '] med K /,
    Eller
    L [5'-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 '] med L / [5'-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3'] 12.
  6. Emne 4 pi amplikon til allel-specifikke restriktionsenzymfordøjelser i 30 fil reaktioner efter fabrikantens anvisninger, for at opdage antifolat narkotika resistensassocierede polymorfier 12.
  7. Om 5 pi af PCR-amplikon (eller 15 pi af restriktionsfordøjelse) per bane af ethidiumbromid-farvede 2% agarosegel elektroforese (100 - 120V) og visualisere bånd under UV-gennemlysning.

Representative Results

Eksempler på resultater fra PCR-assays til mosquito DNA ekstrakt kvalitet (figur 1), Anopheles arabiensis molekylær identifikation (fig. 2) og P. falciparum detektering (fig. 3) viser, at den forenklede Chelex metode giver lignende resultater som standarden udsaltning protokol 10, på trods af meget færre trin (tabel 1). Med sammenlignelig DNA kvalitet i de respektive ekstrakter er det ikke overraskende, at sample positivitetsrater med hensyn til en. gambiae søskende arter samt parasit infektion satser var ikke statistisk forskellige baseret på McNemar s chi-square test (Figur 3).

Følsomhed (%) blev beregnet som TP / (TP + FN) * 100, hvor TP betegner ægte positive og FN betegner falske negativer. Specificitet (%) blev bestemt som TN / (TN + FP) * 100, hvor TN betegner sande negativer og FP betegner falske positive. DNA'et kvalitet (ND4) PCR viste 93% sensitivitet og 82% specificitet for den Chelex fremgangsmåde i forhold til den etablerede udsaltnings protokol som guld standard. Tilsvarende værdier af følsomhed og specificitet var 100% og 78% under anvendelse af søskende artsidentifikation PCR og 92% og 80% for henholdsvis P. falciparum detektion PCR.

Tilsætning af BSA til reaktionsblandinger resulterede i en generel forøgelse af PCR-positive (figur 3) på grund af lindring af PCR-inhibitorer 14 for både den forenklede Chelex og regelmæssig udsaltning protokol. Men denne stigning var ikke statistisk signifikant bortset fra DNA kvalitet (ND4 PCR) på Chelex ekstrakter (p = 0,039). Allelspecifik restriktionsenzymfordøjelse for P. falciparum DHFR (eller anden målgen) amplicon muliggør genotypebestemmelse af mid-tarm og spytkirtel malariainfektioner for lægemiddelresistens alleler (Figur 4, spytkirtel data ikke vist).

Simpel Chelex Procedure Standard Saltning ud Procedure
Steps Reagenser Steps Reagenser
  1. Læg prøven til 1,5 ml mikrofugerør og homogeniseres i 100 gl 1X PBS / 1% Saponin opløsning (2 min).
  2. Efterlad ved stuetemperatur i 20 min.
  3. Spin ved 20.000 x g i 2 minutter og kasser supernatanten.
  4. Tilsæt 100 ul 1X PBS og bland forsigtigt ved momentant vortex (3 sek.)
  5. Spin ved 20.000 x g i 2 minutter og kasser supernatanten.
  6. Tilsættes 25 ul 20% w / v Chelex i deioniseret vand og 75 ul sterilt deioniseret vand.
  7. Pierce hul i låget af prøverøret ved hjælp af varm, steril 23G kanyle og kog rørets indhold i 10 min.
  8. Spin mikrofugerør ved 20000 x g i 1 min.
  9. Overfør supernatanten til sterilt prelabeled hætteglas og opbevares DNA-opløsning ved -20 ° C indtil anvendelse (2.5 pi i 25 ul PCR-reaktion).

PBS


Saponin

Chelex-100-perler

  1. Læg prøven til 1,5 ml mikrofugerør og homogeniseres i 100 ul Bender puffer * med 1% DEPC (2 min).
  2. Inkuber ved 65 ° C i 1 time.
  3. Der tilsættes 15 ul kold 8 M kaliumacetat. Bland forsigtigt og inkuber på is i 45 min.
  4. Spin prøve i mikrocentrifugerør ved 20.000 x g i 10 minutter og overføres supernatanten til et nyt 1,5 ml rør.
  5. Tilsæt 250 pi 100% ethanol og blandes godt ved at vende røret.
  6. Inkuber prøven ved stuetemperatur i 5 minutter.
  7. Spin prøver ved 20.000 x g i 15 minutter.
  8. Aspirer og kassér supernatanten, forlader pillen helt tør i røret (30 mi).
  9. Resuspender pellet i 20 ul 0,1 X SSC + RNAse (10 ug / ml) natten over ved 4 ° C.
  10. Der tilsættes 80 pi DEPC vand og opbevares ved -20 ° C indtil anvendelse.

Diethylpyrocarbonat (DEPC)
* Bender Buffer:
0,1 M NaCI
0,2 M saccharose
0,1 M Tris-HCL


0,05 M EDTA, pH 9,1


0,5% SDS i DEPC vand

8 M kaliumacetat

Ethanol

0,1 x Saline natriumcitrat (SSC) buffer

RNAse (10 mg / ml)

Samlet tid: 37 min Samlet tid: 2 timer 47 min, plus natten

Tabel 1. Trin for trin sammenligning af reagenser og tidsmæssige krav til enkel Chelex protokol og ståard udsaltning fremgangsmåde til DNA-ekstraktion fra myg prøver.

Figur 1
Figur 1.. ND4 mitochondrial PCR sammenligning af DNA-kvalitet fra forenklet Chelex "C" og standard udsaltning "M" uddrag på Anopheles arabiensis feltprøver. NC, negativ kontrol; M1 og C1, M2 og C2, M3 og C3, og M4 og C4 er parret udsaltning og Chelex ekstrakter fra samme An. arabiensis myg prøver. L, 100 bp DNA-stige.

Figur 2
Figur 2 Molekylær identifikation PCR for Anopheles arabiensis C1 og M1, C2 og M2, C3 og M3, C4 og M4 betegner respektive amplikon fra udsaltning "M" og forenklet Chelex "C" DNA ekstrakter til samme myg prøver;.. AR, Anopheles arabiensispositiv kontrol; L, 100 bp DNA-stige.

Figur 3
Figur 3. Detektion af positiver på Chelex og saltning ud DNA ekstrakter til myg prøveoptagning, med PCR-assays for molekylær identifikation af Anopheles arabiensis (AR) 10, arthropod NADH dehydrogenase-genet 4 (ND4) DNA kvalitet test 11, og antifolat lægemiddelresistens P . falciparum DHFR genotypebestemmelse 12 (F-M4). Resultater er vist for assays køres med eller uden BSA i reaktionsblandingen. McNemar s chi-kvadrat testen blev anvendt til at bestemme, om forskellene mellem procent af positive PCR'er fra DNA ekstraheret fra den forenklede Chelex og standard udsaltning protokoller var statistisk signifikante.

Figur 4
P. falciparum infektioner i myg (mid-gut data vist) til lægemiddelresistens alleler. BstN I fordøjelse af amplikon flankerende kodon 108 i P. falciparum DHFR-genet 12 viser cycloguanil-resistente S108T mutanter i mosquito prøver (M1-M5, mid-tarm data vist). U, ufordøjet 522 bp amplikon, FCR3, laboratorie standard P. falciparum positiv kontrol klon, som S108T, K1, P. falciparum laboratorie standard klon negativ kontrol bærer cycloguanil-sensitive S108N, L, 100 bp DNA-stige.

Discussion

Den forenklede Chelex metode præsenteres her muliggør ekstraktion af kvaliteten Anopheles spp og P. falciparum DNA fra myg prøver kan underkastes forskellige PCR-applikationer. Denne teknik kan anvendes til molekylær identifikation af malaria vektor myg og overvågning af resistente P. falciparum alleler i myg for nationale malaria kontrol programmer. Fordelene ved det forenklede Chelex teknik indbefatter enkelhed, færre reagenser og deraf følgende omkostninger, sikkerhed og kortere behandlingstid (37 min) end standard protokoller, såsom udsaltning fremgangsmåde 10 (2 hr 47 min, og en overnight trin, tabel 1). De førnævnte fordele og minimale reagens krav (3 reagenser) i forhold til den nuværende standard protokol (10 reagenser, tabel 1) 11,15, gør den forenklede Chelex protokol særlig venligt til endemiske lande laboratorier, hvor en konstant reagensforsyningskæde er ofte vanskeligt at opretholde. En begrænsning ved metoden er, at ligesom den standard protokol, det var også genstand for PCR-inhibitorer vides at forekomme i den myg integument 16. Dog er denne let afhjælpes ved optagelse af BSA i assayene. BSA er også blevet anvendt med succes som en forstærkning forstærker mod inhibitorer i andre PCR-applikationer 17,18.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Forfatterne står i gæld til de høvdinge, headmen og samfund i Macha for deres unwaveing ​​samarbejde under mosquito feltprøve samlinger. Dr. Doug Norris og Rebekka Kent tilbudt uvurderlig ekspertise på udsaltning protokollen. Dette arbejde blev finansieret af Johns Hopkins Malaria Research Institute pilot tilskud system. Mosquito og parasit-DNA laboratoriestandarder blev venligt doneret af mR4, American Type & Culture Collection.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chelex-100, 50-100 dry mesh BioRad #143-2832
Saponin SIGMA 142-7425
BSA New England Biolabs B9001S

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bonnet, M., et al. Efficacy of antimalarial treatment in Guinea: in vivo study of two artemisinin combination therapies in Dabola and molecular markers of resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in N'Zerekore. Malar. J. 6, 54 (2007).
  2. Nsimba, B., et al. Sulphadoxine/pyrimethamine versus amodiaquine for treating uncomplicated childhood malaria in Gabon: a randomized trial to guide national policy. Malar. J. 7, 31 (2008).
  3. Oyewole, I. O., et al. Behaviour and population dynamics of the major anopheline vectors in a malaria endemic area in southern Nigeria. J. Vector Borne Dis. 44, 56-64 (2007).
  4. Harris, I., et al. A large proportion of asymptomatic Plasmodium infections with low and sub-microscopic parasite densities in the low transmission setting of Temotu Province, Solomon Islands: challenges for malaria diagnostics in an elimination setting. Malar. J. . 9, 254 (2010).
  5. Ouedraogo, A. L., et al. Substantial contribution of submicroscopical Plasmodium falciparum gametocyte carriage to the infectious reservoir in an area of seasonal transmission. PLoS ONE. 4, e8410 (2009).
  6. Birx, D., de Souza, M., Nkengasong, J. N. Laboratory challenges in the scaling up of HIV, TB, and malaria programs: The interaction of health and laboratory systems, clinical research, and service delivery. Am. J. Clin. Pathol. 131, 849-851 (2009).
  7. Ishengoma, D. R., et al. Health laboratories in the Tanga region of Tanzania: the quality of diagnostic services for malaria and other communicable diseases. Ann. Trop. Med. Parasitol. 103, 441-453 (2009).
  8. Alonso, P. L., et al. A research agenda for malaria eradication: vector control. PLoS Med. 8, e1000401 (2011).
  9. Grimberg, J., et al. A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood. Nucleic Acids Res. 17, 8390 (1989).
  10. Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Indentification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by polymerase chain reaction. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 49, 520-529 (1993).
  11. Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome B. Am. J. Trop. Med. Hyg. 73, 336-342 (2005).
  12. Duraisingh, M. T., Curtis, J., Warhurst, D. C. Plasmodium falciparum: detection of polymorphisms in the dihydrofolate reductase and dihydropteroate synthetase genes by PCR and restriction digestion. Exp. Parasitol. 89, 1-8 (1998).
  13. Gorrochotegui-Escalante, N., Munoz, M. L., Fernandez-Salas, I., Beaty, B. J., Black, W. C. T. Genetic isolation by distance among Aedes aegypti populations along the northeastern coast of Mexico. Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 200-209 (2000).
  14. Kreader, C. A. Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein. Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).
  15. Norris, D. E., Shurtleff, A. C., Toure, Y. T., Lanzaro, G. C. Microsatellite DNA polymorphism and heterozygosity among field and laboratory populations of Anopheles gambiae ss (Diptera Culicidae). J. Med. Entomol. 38, 336-340 (2001).
  16. Schriefer, M. E., Sacci, J. B., Wirtz, R. A., Azad, A. F. Detection of polymerase chain reaction-amplified malarial DNA in infected blood and individual mosquitoes. Exp. Parasitol. 73 (91), 311-316 (1991).
  17. Al-Soud, W. A., Radstrom, P. Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
  18. Hyun, C., Filippich, L. J., Hughes, I. The inhibitory effect of pentobarbitone on reverse transcription-PCR. J. Biochem. Biophys. Methods. 62, 63-68 (2005).

Tags

Infektion Immunology Infectious Diseases genetik molekylær biologi mikrobiologi parasitologi entomologi Malaria, Vektor, Diptera myg Chelex DNA ekstraktion PCR dissektion insekt vektor patogen
A Simple Chelex protokol til DNA-ekstraktion fra<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Musapa, M., Kumwenda, T., Mkulama,… More

Musapa, M., Kumwenda, T., Mkulama, M., Chishimba, S., Norris, D. E., Thuma, P. E., Mharakurwa, S. A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.. J. Vis. Exp. (71), e3281, doi:10.3791/3281 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter