Summary
En snabb och prisvärt sätt att extrahera parasiter kvalitet malaria och vektor-DNA från mygga prover beskrivs. Utnyttja kelatbildande egenskaper Chelex-harts, möjliggör den enkla metoden genotypning av malariaparasiter i mygga mitten gut och spottkörtel faser, liksom molekylär identifiering av
Abstract
Endemiska länder i allt större utsträckning molekylära verktyg för effektiv typning, identifiering och övervakning mot malariaparasiter och myggor vektor, som en integrerad del av deras kontrollprogram 1,2,3,4,5. För en hållbar etablering av dessa exakta metoder i verksamheten forskning för att stärka malaria kontroll och insatser eliminering, enkla och prisvärda metoder, med snål reagens och utrustning är grundläggande 6,7,8. Här presenterar vi en enkel Chelex-baserad teknik för att extrahera malariaparasiten och vektor-DNA från fältet samlas mygga exemplar.
Vi identifierade morfologiskt 72 Anopheles gambiae sl. Från 156 myggor fångade av Pyrethrumextrakt spruta bifångster i sovrum hushåll inom en 2.000 km 2 närheten av Malaria Institute vid Macha. Efter dissekering för att separera huvudet och bröstkorgen från buken för alla 72 Anopheles GAMbiae sl. myggor, de två sektionerna placerades individuellt i 1,5 ml mikrorör och nedsänkt i 20 pl avjoniserat vatten. Med användning av en steril pipettspets, har varje sektion mygga separat homogeniserades till en enhetlig suspension i avjoniserat vatten. Av den efterföljande homogenatet från varje mygga sektion, var 10 pl kvar medan den andra 10 | il överfördes till en separat autoklaverad 1,5 ml rör. De separata alikvoter utsattes för DNA-extraktion från antingen den förenklade Chelex eller standarden utsaltning extraktion protokoll 9,10. Den utsaltning protokollet är så kallade och allmänt används eftersom det utnyttjar höga saltkoncentrationer i stället för farliga organiska lösningsmedel (såsom fenol och kloroform) för proteinutfällning steget under DNA-extraktion 9.
Extrakt användes som templat för PCR-amplifiering med användning av primrar riktade artropod mitokondrie nikotinamidadenindinukleotid dehydrogeNase (NADH) subenhet 4-genen (ND4) för att kontrollera DNA-kvalitet 11, en PCR för identifiering av Anopheles gambiae syskon arter 10 och en kapslad PCR för att skriva av Plasmodium falciparum-infektion 12. Jämförelse med hjälp av DNA kvalitet (ND4) PCR visade 93% sensitivitet och 82% specificitet för Chelex tillvägagångssättet i förhållande till den etablerade utsaltning protokoll. Motsvarande värden på känslighet och specificitet var 100% och 78%, respektive, med användning av syskon artidentifiering PCR och 92% och 80%, respektive för P. falciparum detektion PCR. Det fanns inga signifikanta skillnader i andelen prover som har gett amplicon signal med Chelex eller regelbunden utsaltning protokoll över alla tre PCR-program. Den Chelex metod som krävs tre enkla reagens och 37 min att slutföra, medan utsaltnings protokollet innebar 10 olika reagenser och 2 tim och 47 min "behandling tid, inklusive en övernattning steg. Våra resultat visar thpå Chelex metoden är jämförbar med den befintliga utsaltning extraktion och kan ersättas som en enkel och hållbar strategi i resursfattiga begränsad miljöer där en konstant reagens leveranskedjan är ofta svårt att upprätthålla.
Protocol
1. Förberedande Dissektion av Mosquito prover
- Placera mygga på en liten skärning av parafilm och montera på dissekera mikroskop.
- Omslag i droppe avjonat vatten för att mjuka vävnad.
- Incise mygga stommen precis vid leden mellan bröstkorgen och buken, vilket nicking av huvudet och bröstkorgen från buken avsnitt.
- Överför varje dissekerade mygga sektion i en ren autoklaveras 1,5 ml mikrocentrifugrör prelabeled med mygga detaljer ID-nummer och markeras på lämpligt sätt för att beteckna stomdelen (t.ex. "m" för mid-gut avsnitt, "HT" för huvud och bröstkorg avsnitt).
- Kasta parafilm och försiktigt torka mikroskop scenen med 70% alkohol-fuktad Kimwipe innan behandlingen nästa mygga.
2. DNA-extraktion från Mosquito prover
- Pipettera 20 | il avjoniserat vatten i provröret och användning pipettspetsen att slipa den nedsänkta mygga sektionen till en FNiform suspension.
- Tillsätt 100 | il autoklaverat 1X PBS / 1% saponin lösning till provet homogenatet och blanda genom försiktig virvling momentan.
- Inkubera vid rumstemperatur under 20 minuter.
- Centrifugera vid 20.000 x g under 2 minuter och kassera supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 100 pl 1X PBS.
- Centrifugera igen vid 20.000 x g under 2 minuter och kassera supernatanten.
- Genom försiktig virvling (5 sek), resuspendera pelleten i 75 pl sterilt avjoniserat vatten och 25 pl av 20% vikt / vol Chelex-100 harts suspension i avjoniserat vatten.
- Pierce hål i locket provröret med steril 23G injektionsnål flammade i Bunsenbrännare.
- Koka prov suspension i vattenbad på flytande gallret (eller i värmeblock) under 10 min.
- Centrifugera vid 20.000 x g under 1 min och överföring efterföljande DNA-lösning i prelabeled lagring flaska för användning som mall i PCR-tillämpningar.
3. Plasmodium falciparum genotypning och Anophelesspp.. Molekylär identifiering
- Lägg 2,5 il av Chelex DNA-extrakt i 25 pl PCR-reaktioner för att kontrollera DNA kvalitet 11, identifiera Anopheles arter 10 och genotyp P. falciparum 12 mid-gut och spottkörtel infektioner.
- För att maximera amplikon avkastning, särskilt för P. falciparum detektion, innefattar 1,5 X bovint serumalbumin (BSA) i PCR-analysen. Följande reaktion sammansättning rekommenderas: (2,5 pl mall, 0,25 iM primer, 1,5 M magnesiumklorid, 200 iM dNTP, 1x PCR-buffert, 1,5 X BSA och 1.0U Taq DNA-polymeras, i 25 ul volymer).
- För att kontrollera för DNA kvalitet i extrakt, förstärka regionen av leddjur mitokondrie nikotinamidadenindinukleotid dehydrogenas (NADH) subenhet 4 (ND4) genen (primers ND4FW [5'-GTD YAT TTA TGA TTR CCT AA-3 '] och ND4RV [5' -CTT CGD CTT CCW ADW CGT TC-3 ']; förväntar produkt 400 bp) 11,13.
- För att skilja Anopheles Gambiae sl. syskon arter (an. gambiae ss och An. arabiensis endast), förstärka regionen som flankerar SNP i den intergena distans (IGS) region (primers FN [5'-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3 '], GA [5'-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 '], AR [5'-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3']; förväntar produkt 390bp En gambiae ss, 315bp En arabiensis) 10,11.
- För att skriva P. falciparum antifolat läkemedelsresistenta polymorfismer, utför kapslade PCR för att amplifiera regionen flankerande aminosyrakodoner 108, 51, 59, 16 och 164 i parasiten dihydrofolatreduktas (DHFR)-gen:
Primära runda primrar: M1 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 '] och M5 [5'-AGTATATACATCGCTAACAGA-3']
Sekundära runda primers: M3 [5'-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 '] med F / [5'-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3']
Eller
F [5'-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] med M4 [5'-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 ']).
Också amplifiera regionen innehållande aminosyrakodoner 436, 437, 540, 581 and 613 i P. falciparum dihydropteroate syntetas (DHPS)-genen:
Primär runda primers R2 [5'-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 '] med R / [5'-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3'];
Sekundära runda primers
J: [5'-'TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3'] med K / [5'-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3 ']
Eller
K: [5'-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 '] med K /,
Eller
L [5'-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 '] med L / [5'-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3'] 12. - Ämne 4 ul amplikon till allelspecifika restriktionsenzymdigestioner i 30 ul reaktioner efter tillverkarens anvisningar, att upptäcka antifolat läkemedelsresistens-associerade polymorfismer 12.
- Ämne 5 pl PCR-amplikon (eller 15 pl restriktionsklyvning) per bana av etidiumbromid-färgade 2% agarosgel för elektrofores (100 - 120 V) och visualisera banden under UV-genomlysning.
Representative Results
Exempel på resultat från PCR-analyser för mygga DNA-extrakt kvalitet (figur 1), Anopheles arabiensis molekylär identifiering (figur 2) och P. falciparum detektion (Figur 3) visar att den förenklade Chelex metod ger liknande resultat som den standard utsaltning protokoll 10, trots mycket färre steg (tabell 1). Med jämförbar DNA kvalitet i respektive extrakt är det inte förvånande att prov positivitet i förhållande till en. gambiae syskon arter samt parasiter priser infektion var inte statistiskt annorlunda utifrån McNemars chi-test (Figur 3).
Känslighet (%) beräknades som TP / (TP + FN) * 100, där TP betecknar sant positiva och FN betecknar falska negativa. Specificitet (%) bestämdes som TN / (TN + FP) * 100, där TN betecknar sanna negativa och FP betecknar falska positiva. Den DNA-kvalitet (ND4) PCR visade 93% sensitivitet och 82% specificitet för Chelex metod jämfört med den etablerade utsaltning protokoll som guldstandard. Motsvarande värden på känslighet och specificitet var 100% och 78%, respektive, med användning av syskon artidentifiering PCR och 92% och 80%, respektive för P. falciparum detektion PCR.
Tillsatsen av BSA till reaktionsblandningar resulterade i en generell ökning av PCR positiva (figur 3) på grund av lindring av PCR-inhibitorer 14 för båda förenklat Chelex och regelbunden utsaltning protokoll. Detta var dock ökningen inte statistiskt signifikant utom för DNA-kvalitet (ND4 PCR) på Chelex extrakt (p = 0,039). Allelspecifik restriktionsenzymdigerering på P. falciparum DHFR (eller annan målgen) amplikon möjliggör genotypning av mitten gut och saliv infektioner körtel malaria för alleler läkemedelsresistens (Figur 4, spottkörtel data ej visade).
| Enkel Chelex Procedur | Standard Saltning out | ||
| Steg | Reagens | Steg | Reagens |
| PBS
Chelex-100 pärlor |
| Dietylpyrokarbonat (DEPC)
8 M kaliumacetat Etanol 0,1 X saltlösning natriumcitrat (SSC)-buffert RNAs (10 pg / ml) |
| TOTAL TID: 37 min | TOTAL TID: 2 tim 47 min, plus övernattning | ||
Tabell 1. Steg för steg jämförelse av reagenser och krav tid för enkel Chelex protokoll och ståARD utsaltning metod för DNA-extraktion från mygga prover.
Figur 1. ND4 mitokondrie PCR jämförelse av DNA-kvalitet från förenklad Chelex "C" och standard utsaltning "M" extrakt på Anopheles prover arabiensis fält. NC, negativ kontroll, M1 och C1, M2 och C2, M3 och C3 och M4 och C4 är parade utsaltning och Chelex extrakt från samma An. arabiensis mygga exemplar. L, 100 bp DNA-stege.
Figur 2 Molekylär identifiering av PCR för Anopheles arabiensis C1 och M1, C2 och M2, C3 och M3, C4 och M4 betecknar respektive amplikon från utsaltning "M" och förenklade Chelex "C" DNA extrakt för samma mygga prover,.. AR, Anopheles arabiensispositiv kontroll, L, 100 bp DNA-stege.
Figur 3. Detektering av positiva om Chelex och saltning av DNA extrakt för mygga fältprov med PCR-analyser för molekylär identifiering av Anopheles arabiensis (AR) 10, leddjur NADH dehydrogenas-gen 4 (ND4) DNA kvalitetsbedömning 11 och antifolat resistens P . falciparum DHFR genotypning 12 (F-M4). Resultaten som visas för analyser köras med eller utan BSA i reaktionsblandningen. McNemars chi-test användes för att bestämma om skillnaderna mellan procent av positiva PCR från DNA som extraherats från den förenklade Chelex och standardavvikelsen utsaltning protokoll var statistiskt signifikanta.
Discussion
Den förenklade Chelex metoden som presenteras här möjliggör extraktion av kvalitet Anopheles spp. och P. falciparum DNA från mygga prover lämpar sig för olika PCR-tillämpningar. Denna teknik kan användas för molekylär identifiering av myggor malaria vektor och övervakning av resistent P. falciparum alleler i myggor för nationella program malaria kontroll. Fördelarna med den förenklade Chelex tekniken inkluderar enkelhet, färre reagenser och därmed kostnad, säkerhet och kortare behandlingstid (37 min) än standardprotokoll såsom utsaltning metoden 10 (2 tim 47 min och en övernattning steg, tabell 1). De ovan nämnda fördelar och minimala krav reagens (3 reagenser) jämfört med den nuvarande standarden protokollet (10 reagens, tabell 1) 11,15, gör den förenklade Chelex protokollet särskilt vänliga för endemiska länder laboratorier där en konstant reagensleveranskedjan är ofta svårt att upprätthålla. En begränsning med metoden är att i likhet med standardprotokoll, var det också av PCR-hämmare är kända för att uppträda i mygga integument 16. Emellertid är detta lätt lindras genom införande av BSA i analyserna. BSA har också framgångsrikt använts som en förstärkning förstärkare mot inhibitorer i andra PCR program 17,18.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna står i tacksamhetsskuld till cheferna, hövdingar och gemenskaper av Macha för deras unwaveing samarbetar under mygga samlingar fältprov. Dr Doug Norris och Rebecka Kent erbjöd ovärderlig expertis på utsaltning protokollet. Detta arbete har finansierats av Johns Hopkins Malaria Forskningsinstitut pilot bidragssystem. Mygga och parasit-DNA laboratorium standarder vänligt donerats av MR4, American Type & Culture Collection.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chelex-100, 50-100 dry mesh | BioRad | #143-2832 | |
| Saponin | SIGMA | 142-7425 | |
| BSA | New England Biolabs | B9001S |
References
- Bonnet, M., et al. Efficacy of antimalarial treatment in Guinea: in vivo study of two artemisinin combination therapies in Dabola and molecular markers of resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in N'Zerekore. Malar. J. 6, 54 (2007).
- Nsimba, B., et al. Sulphadoxine/pyrimethamine versus amodiaquine for treating uncomplicated childhood malaria in Gabon: a randomized trial to guide national policy. Malar. J. 7, 31 (2008).
- Oyewole, I. O., et al. Behaviour and population dynamics of the major anopheline vectors in a malaria endemic area in southern Nigeria. J. Vector Borne Dis. 44, 56-64 (2007).
- Harris, I., et al. A large proportion of asymptomatic Plasmodium infections with low and sub-microscopic parasite densities in the low transmission setting of Temotu Province, Solomon Islands: challenges for malaria diagnostics in an elimination setting. Malar. J. . 9, 254 (2010).
- Ouedraogo, A. L., et al. Substantial contribution of submicroscopical Plasmodium falciparum gametocyte carriage to the infectious reservoir in an area of seasonal transmission. PLoS ONE. 4, e8410 (2009).
- Birx, D., de Souza, M., Nkengasong, J. N. Laboratory challenges in the scaling up of HIV, TB, and malaria programs: The interaction of health and laboratory systems, clinical research, and service delivery. Am. J. Clin. Pathol. 131, 849-851 (2009).
- Ishengoma, D. R., et al. Health laboratories in the Tanga region of Tanzania: the quality of diagnostic services for malaria and other communicable diseases. Ann. Trop. Med. Parasitol. 103, 441-453 (2009).
- Alonso, P. L., et al. A research agenda for malaria eradication: vector control. PLoS Med. 8, e1000401 (2011).
- Grimberg, J., et al. A simple and efficient non-organic procedure for the isolation of genomic DNA from blood. Nucleic Acids Res. 17, 8390 (1989).
- Scott, J. A., Brogdon, W. G., Collins, F. H. Indentification of single specimens of the Anopheles gambiae complex by polymerase chain reaction. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 49, 520-529 (1993).
- Kent, R. J., Norris, D. E. Identification of mammalian blood meals in mosquitoes by a multiplexed polymerase chain reaction targeting cytochrome B. Am. J. Trop. Med. Hyg. 73, 336-342 (2005).
- Duraisingh, M. T., Curtis, J., Warhurst, D. C. Plasmodium falciparum: detection of polymorphisms in the dihydrofolate reductase and dihydropteroate synthetase genes by PCR and restriction digestion. Exp. Parasitol. 89, 1-8 (1998).
- Gorrochotegui-Escalante, N., Munoz, M. L., Fernandez-Salas, I., Beaty, B. J., Black, W. C. T. Genetic isolation by distance among Aedes aegypti populations along the northeastern coast of Mexico. Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 200-209 (2000).
- Kreader, C. A. Relief of amplification inhibition in PCR with bovine serum albumin or T4 gene 32 protein. Appl. Environ. Microbiol. 62, 1102-1106 (1996).
- Norris, D. E., Shurtleff, A. C., Toure, Y. T., Lanzaro, G. C. Microsatellite DNA polymorphism and heterozygosity among field and laboratory populations of Anopheles gambiae ss (Diptera Culicidae). J. Med. Entomol. 38, 336-340 (2001).
- Schriefer, M. E., Sacci, J. B., Wirtz, R. A., Azad, A. F. Detection of polymerase chain reaction-amplified malarial DNA in infected blood and individual mosquitoes. Exp. Parasitol. 73 (91), 311-316 (1991).
- Al-Soud, W. A., Radstrom, P. Purification and characterization of PCR-inhibitory components in blood cells. J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).
- Hyun, C., Filippich, L. J., Hughes, I. The inhibitory effect of pentobarbitone on reverse transcription-PCR. J. Biochem. Biophys. Methods. 62, 63-68 (2005).
