Культивирование и электрофизиологии ячеек на NRCC Патч зажим фишки

Summary

Мы покажем, как плоская патч-зажим чипов, изготовленных в Национальный исследовательский совет Канады стерилизуют, грунтовка, загружается со средой, покрыты клетками, и используется для электрофизиологических записей.

Abstract

Благодаря своей изысканной чувствительностью и возможностью контроля и управления отдельными ячейками на уровне ионных каналов, исправления зажима является золотым стандартом электрофизиологии применяется к болезням моделей и фармацевтической экранов, так ^1. Метод включает в себя традиционно мягко контакт клетка со стеклянной пипетки заполнен физиологическим раствором, чтобы выделить участок мембраны в соответствии с его вершины ^2. Электрод вставляется в пипетку захватывает ион-канал деятельности в участок мембраны или, в случае разрыва, по всей клетке. В последнее десятилетие, патч-зажим чипы были предложены в качестве альтернативы ^{3, 4:} приостановлено фильма отделяет физиологическую среду из питательной среды, а также отверстие микроизготовленном в фильме заменяет вершине пипетки. Патч зажим чипы были интегрированы в автоматизированные системы коммерческого и для высокопроизводительного скрининга ^5. Для инкроблегчить пропускной способности, они включают в себя жидкостного доставки клеток от подвески, их позиционирование на диафрагму на всасывании и автоматизированные процедуры для выявления клетки к зонд печатей и вступить в целом режим клетки. Мы сообщили об изготовлении кремниевых патч зажим чип с оптимизированным сопротивлением и формы отверстия, что позволяет высокое качество записи потенциалов действия в культуре нейронов улитки ^6, в последнее время, мы также сообщили о прогрессе на допрос млекопитающих нейроны ^7. Наш патч зажим чипы изготавливаются на канадских Photonics Изготовление центр ⁸ коммерческих литейного производства, и доступны в больших серий. Мы готовы участвовать в совместных с электрофизиологов для проверки использования NRCC технологий в различных моделях. Чипы используются в соответствии с общей схемой представлена ​​на рисунке 1: кремниевый чип находится на дне флакона оргстекла культуры и задней части диафрагмы связан с подземными ChannЭль оснащены труб на обоих концах пакета. Клетки культивируют во флаконе и клетки в верхней части датчика контролируется измерительного электрода вставляется в channel.The двумя внешними портами жидкостный обмен облегчить решение с минимальным вмешательством в клетке, это преимущество по сравнению со стеклом пипетки для внутриклеточных перфузии.

Рисунок 1. Принцип измерения с использованием NRCC патч зажим чип

Мы подробно протоколы для стерилизации и премьер-чипов, загрузить их со средой, пластинка их с клетками, и, наконец, использовать их для электрофизиологических записей.

Protocol

1. Чип производство

Процесс, описанный в ⁶ результатов в 3 мкм самостоятельный фильм, ниже 1 МОм Сопротивление доступа и гладкой поверхностью воронкообразные диафрагмы, что способствует интимным печать с клеткой ⁹ см. Рисунок 2. Чипы singulated и склеены из плексигласа пакеты с отверстием, направленным отверстие подключения чипа подземный канал. Склеивания обойтись таким образом, чтобы свести к минимуму параллельную емкость до номинального 17 пФ. Пакеты оснащен двумя 1,5 мм и 6 мм стеклянных трубок жидкостных как порты (рис. 3).

Рисунок 2. Сканирующего электронного микроскопа целенаправленного сечения пучка ионов NRCC патч зажим чип показывает гладкой поверхности диоксида кремния и форму воронки, что выступает за тесные контакты ячейки, а мелкие отверстия, которые приходится низко resistanc доступае.

Рисунок 3. Чип приклеен на дне флакона культуры в плексиглас пакет оснащен подземным струйной и стеклянных трубок.

2. Стерилизация, грунтовки и тестирование

Следующие шаги должны быть выполнены в кабинете биологии безопасности, чтобы избежать загрязнения или закупорки отверстия.

• Стерилизовать фишки Harrick основной плазмы чистых (www.harrickplasma.com) с 0,1-0,3 мбар остаточного давления воздуха в течение 15 минут при максимальной мощности 18 Вт Другие воздуха плазменных систем могут быть использованы с сопоставимыми плотность мощности (24 мВт / см ³⁾ и сохранение произведение плотности мощности и постоянной времени. Плазменная обработка также оказывает чипов гидрофильные, что облегчает грунтовки.
• Установить стеклянные трубки стерильной Silastic трубки силиконовые лаборатории, 1 мм х 2 мм ID OD (Cole ParmerКат. # 96115-08), 3inch с одной стороны, 1 дюйм, с другой стороны.
• Заполните струйной через трубки с фильтром стерильные стандартный фосфатный буферный раствор (PBS), убедившись, что ни один пузырь не попадает в ловушку.
• Клип длинная трубка силиконовая время давления на PBS с короткой стороне при 1 атм. Бассейн ФСБ просачивается через отверстие может быть видна во флаконе. Клип под давлением поставки PBS и отделить короткие трубки силиконовые от питания.
• Заполнить флакон с фильтрованной PBS с помощью шприца.
• Погрузитесь Ag / Ag: Cl электрода в короткую трубку и контр-электрод во флаконе. Сопротивление метр используется для подтверждения того, что доступ сопротивление между 300kohm и 3Mohm и параллельную емкость составляет от 10 пФ и 25пФ. Чип с низким сопротивлением, скорее всего, есть утечка, и более высокая емкость считается неприличным для использования, поскольку он не может захватить быстро динамика электрофизиологии клетки ^6. Чип с меньшей емкостиили выше сопротивления считается подключен, хотя это может быть лишь то, что пузырь в ловушке в отверстие. Некоторые чипы повторное тестирование после 1H и установлено, что правильный импеданс электрохимический.
• Флеш жидкостный канал стерильной дистиллированной водой, очистить верхний пузырек и промыть же, в два раза.
• Погрузитесь упакованных чипов с трубками в свежей стерильной дистиллированной воды в течение 30 минут а затем загрузить с другими чипами в стерильный контейнер, заполненный стерильной дистиллированной водой. Это гарантирует, что чипы остаются гидрофильными и защищены от загрязнения.

3. Чипы препарата в клетку лаборатории биологии

Следующие шаги выполняются в HEPA фильтром капот ламинарного потока с использованием асептических методов, все решения, используемые в этой процедуре должны быть отфильтрованы стерилизовать перед использованием использованием 0.22μm фильтр.

• Открыть чип контейнер под HEPA фильтром ламинарном боксе и убирать фишки со CONTAинерциальной лицом вниз, чтобы избежать возможных черпая плавающих загрязняющих веществ в верхнем флаконе.
• Промыть верхней части флакона чип 2x с свежеотфильтрованная стерильной дистиллированной водой, чтобы удалить остатки мусора с поверхности чипа.
• Аспирируйте стерильной дистиллированной воды с верхней флаконе.
• Подключите один конец силиконовой трубки прикреплен к жидкостный канал под давлением шприц со стерильным фильтром деионизированной водой. В нашей системе, шприцы заполнен раствором под давлением находятся на связи с баллон со сжатым воздухом установлена ​​в 20psi. Для обеспечения стерильности, воздух фильтруется (фильтр 0,22 мкм) до вступления в шприц, и наша система имеет также включение / выключение клапана, что позволяет нам остановиться или давление, когда это необходимо.
• Использование кровоостанавливающего, зажмите выходной конец трубки.
• Откройте включения / выключения клапанов давление в растворе.
• Для полоскания subterranen жидкостного кристалла со свежей стерильной дистиллированной водой, разжимать выходной конец трубки.
• Чтобы засе воду через отверстие, зажмите выходной конец трубки с кровоостанавливающего.
• Чтобы избежать слива воды, зажмите входных и выходных концов труб с hemostats и закрыть включения / выключения клапанов.
• Снимите входной конец трубы из шприца.
• Вставьте стекло вставляется в обоих концах трубки и удалить hemostats.
• Заполните верхнюю флакон с фильтром steriled деионизированной водой.
• Установите крышку 35 мм стерильную чашку в базу 100 мм стерильную чашку
• Место чип в верхней части 35 мм крышкой и накрыть крышкой 100 мм блюдо.
• Изображение фишек для того, чтобы мембраны и диафрагмы микросхем свободны от мусора и / или пузырьков воздуха. В нашей лаборатории мы используем прямой микроскоп и 20x большим рабочим расстоянием объектива.
• Если мусор и / или пузырьков воздуха присутствуют, неоднократно промойте жидкостный канал и топ-флаконе. Если мусор и / или пузырьки воздуха не может быть удален чип отбрасывается.
• После того, чипыотображаемого, вернуться в ламинарный поток капот и отсоедините оба конца трубы.
• Подключите один конец трубы, чтобы под давлением шприц, содержащий физиологический СМИ.
• Зажмите выходной конец трубки с кровоостанавливающего
• Откройте клапан, удалить кровоостанавливающего из выходного конца струйной и промойте жидкостный канал с физиологическими СМИ
• Для промывки подземных жидкостный с физиологическими средствами массовой информации, открыто включения / выключения клапанов и удалить кровоостанавливающего от выходного конца трубы.
• Чтобы заставить физиологических средах сквозь отверстие, зажмите выходной конец трубки с кровоостанавливающего.
• Зажим входной конец трубы с кровоостанавливающего и закрыть включения / выключения клапанов.
• Снимите входной конец трубы из шприца и подключите оба конца трубы с заглушками стеклянный.
• Удалить hemostats.
• Удаление воды из верхнего сосуда.
• Заполните верхнюю флакон с фильтром стерилизовать физиологической информации.
• Поместите чип обратно в 100 мм блюдо Петри.
• Поместите базу на 35 мм в блюдо 100 мм блюдо и залейте его фильтром стерилизовать деионизированной воды для обогащения влажности.
• Накройте блюдо, пока это не время для покрытия

4. Сотовые покрытие нейронов улитки

Патч зажим чипы могут быть пригодны для различных препаратов. Сейчас мы тестируем наши чипы млекопитающих первичных корковых нейронов и получены предварительные результаты клеток, культивированных в течение 14 дней ^7, который показывает, что наши стерилизации протокол является адекватной и что чипы не являются цитотоксическими в долгосрочных культурах. Для целей настоящего Протокола, улитки нейронов были выбраны потому, что они представляют собой простой, но устоявшейся моделью для изучения нейронных электрофизиологии ^11, и именно с тех клеток, которые мы получили наиболее значимых результатов на сегодняшний день ^10. Подробная изоляторе и культуры процедуры имеютбыли описаны ранее ^{12, 13.}

• Удалите внешнюю оболочку с 2-3 месячного stagnalis Lymnaea с тупым пинцетом и Anesthetize животных в Lymnaea солевой, содержащей 10% Listerine.

  Все последующие шаги выполняются в асептических капот воздушный поток ламинарный с стерилизовать оборудование и рассечение растворах при комнатной температуре.

• Замените физиологической информации в струйной с соответствующим решением записи с помощью пипеток Eppendorf. В случае нейронах Lymnaea раствор содержит (в мм): 50 KCl, 5 MgCl _2, 5 этиленбис (oxyethylenenitrilo) тетрауксусной кислоты (EGTA) и 5 4 - (2-гидроксиэтил)-1-piperazineethanesulfonic кислоты (HEPES, рН 7,4 , 130 мОсм) ¹⁴
• Прикрепите улитки в Sylgard блюдо заполнено Lymnaea физиологическим раствором и удалить весь мозг, как описано выше ¹³
• Лечить изолированыред мозга в определенных средствах массовой информации (СД) с трипсин фермента (0,2% раствор, Sigma, каталог № Т-9201) в течение 18 минут с последующей обработкой в ​​DM и ингибитор трипсина (Sigma, сои, каталог № Т-9003) в течение 15 минут.
• Прикрепите мозги в небольшое блюдо Sylgard заполнены с высокой осмолярности определены средства массовой информации (HODM - DM с глюкозой добавил, 750 мкл 1М раствора глюкозы до 20 мл DM).
• Используя тонкий пинцет и рассечение ножницами, удалите внешнюю и внутреннюю оболочку ганглиев интерес, подвергая нейроны.
• С помощью пипетки граненые стакан, наполненный HODM и прикреплен к микрошприца, применить нежное всасывание возле клетки интерес (левый спинной педаль 1) до нейрона отделяется от мозга и приостановлено в пипетку.
• Стеклянную пипетку затем переехал и погружают в отдельных нейрочипах где нежный исключение из микрошприца позволяет нейронам осторожно выталкивают из пипетки и размещены на верхней части отдельные отверстия пятно на чипы.
• Позвольте клетки сидеть спокойно в течение как минимум 2 часа при комнатной температуре, чтобы продвинуть их привязанность к поверхности чипа окружающих отверстие.

5. Электрофизиологические записи

Для подключения чипов к усилителю (в нашем случае Multiclamp 700B усилитель, Molecular Devices, Foster City, Калифорния, США)

• Замените решение в подземных жидкостных и в чипе флакон с соответствующими решениями записи. В случае нейронах Lymnaea, верхних палат культуры наполнены Lymnaea физиологического раствора (в мм: 51,3 NaCl, 1,7 KCl, 4 CaCl2, MgCl2 и 1,5), буфер для рН 7.9 с HEPES ^14.
• Для устойчивости, клей чип на стекле и поместить его под микроскопом.
• Для подключения микросхемы к усилителю (в нашем случае Multiclamp 700B усилитель, Molecular Devices, Foster City, Калифорния, США), вырезать один конец трубки и вставьте Silveт проволоки, который связан с главой стадии.
• Поместите электрод в верхней флакон чипа.
• Чип готов к записи.
• Применить 5 мВ шаг с усилителем для измерения полного сопротивления (R _т) и определить конфигурацию нейронов: клетки подключением (R _^> 1 ГОм); цельноклеточная (Rt = 50-100 МОм плюс емкостных переходных процессов, что свидетельствует из мембраны на диафрагму), или не печать (R _т <5 МОм). В нашей последней серии экспериментов ^10, 58% процентов клеток был высоким сопротивлением уплотнения, а из тех 80% клеток показали, возбудимый ответов.

6. Представитель Результаты

• Применить деполяризующего импульсов тока (20 мкА прирост) в нейрон (в данном случае LPeD1).
• Держите нейрона на Vm близки к ее потенциал покоя (~ - 60 мВ).
• Обратите внимание на ответы на эти деполяризующего импульсов. Потенциалов превышения действия должныбудет наблюдаться, если нейрон является жизнеспособным.
• На рисунке 4 показана представитель результат, который обсуждается в деталях в ^{14, 15.}

Рисунок 4. Напряжение ответы (сверху) LPeD1 нейрона к градуированной ряд внутриклеточных импульсов тока (см. ниже). Импульсы тока были применены на Vm = - 60мВ.

Поиск и устранение неисправностей

• Перед покрытием, изображение фишек, чтобы определить, мембраны и диафрагмы не должно быть мусора и подходит для обшивки. Мы используем прямой микроскоп и 20x большим рабочим расстоянием объектива. В нашей последней серии экспериментов ^1, 67% процентов чипы успешно грунтовать именно таким образом.
• Если мусор и / или пузырьки воздуха находятся отказаться от чипа и попробуйте другой.
• Различные обработки поверхности (плазмы) или покрытия (PDL, PEI и т.д.) могут быть привлечены, но успех может быть в значительной степени зависит от типа клетокиспользуется.
• В состав жидкостного ("пипетка") решение в критической для формирования гига-печать и целых клеток. Настройте решение, обращая внимание на осмолярность, рН и ионной макияж.
• В долгосрочной перспективе культуры, начинают со средствами массовой информации в микрофлюидных канал, а затем перейти к пипетировать решение до записи с помощью нежных самотечных перфузии (~ 0,5 мл / мин).

Discussion

Патч зажим NRCC чип допрос платформа является потенциально мощным инструментом для высокой информативности фармацевтических анализов и исследовать в лабораторных моделей болезни. Его преимущества по сравнению со стеклом пипетки низким сопротивлением доступа, что является преимуществом для исследования крупных клеток, и, несмотря на несколько большую емкость приведет к сопоставимой динамики для небольших клетках. Спонтанное клетки диафрагмы тюленей обычно получается, и все вступление клетки было обнаружено, что спонтанное ^14. Четкое различие между чипами и метод стеклянной пипетки является тот факт, что зонд входит в состав блюда культуре клеток и не вручную в контакте с клеточной мембраной. Культивирование клеток, возможно, часть функциональных сетей, приводит к более биологически соответствующих моделей, как болезнь моделей, и другой механизм для обеспечения высокой клетки для исследования уплотнения ^16. Однако, в отличие от клеточных суспензий, стремление cannoт быть использованы для размещения клеток на зонд. Улитка нейронов, как и другие крупные клетки, которые поддаются лечению с ручным позиционированием на вершине зонда. Для небольших клеток требуется более длительное время культуре, мы устраняет необходимость для любой манипуляции и сохранить высокую вероятность получения печатью полипептидов структурирование сцепление на вершине зонда поместить клетки в верхней части датчика и продемонстрировал размещения ячеек на Зонд ^17,18.

NRCC также разрабатывает полиимида микрофлюидных патч зажим чип ¹⁹ с емкостью сравнимой с стеклянной пипетки. Конечной целью этого проекта является несколькими датчиками патч зажим чип, который позволяет одновременное наблюдение за электрофизиологических активности нескольких нейронов участвует в сеть поведения при разрешении отдельных ионных каналов ^14. Этот метод является высокое разрешение дополнительный метод к многоэлектродной массивы 20.