Summary
एकल सेल अभिव्यक्ति की रूपरेखा विस्तृत व्यक्ति की कोशिकाओं के जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण की अनुमति देता है. हम cardiomyocytes के अलगाव के लिए विधियों का वर्णन है, और या तो पूरी transcriptome या विशिष्ट लक्ष्यों के माइक्रोएरे qPCR के लिए जिसके परिणामस्वरूप lysates की तैयारी है.
Abstract
जबकि कई अध्ययनों हृदय के ऊतकों के homogenates से जीन एक्सप्रेशन परिवर्तनों की जांच की है, यह एक ऊतक के भीतर कोशिकाओं के बीच निहित stochastic की भिन्नता का अध्ययन रोकता है. माउस दिलों की collagenase छिड़काव के माध्यम से शुद्ध cardiomyocyte आबादी के अलगाव पूरे transcriptome जीन की अभिव्यक्ति के लिए एकल कोशिका प्रोटीन की पीढ़ी है, या विशिष्ट nanofluidic सरणियों का उपयोग करते हुए लक्ष्य की qPCR की सुविधा. हम यहाँ दिल से अलग cardiomyocytes की एकल सेल जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल की जांच प्रक्रिया का वर्णन. इस प्रतिमान ब्याज की मैट्रिक्स है जो मतलब है पर निर्भर नहीं हैं (उदाहरण के एक ऊतक के भीतर कोशिकाओं के बीच विचरण के लिए), जो संभव नहीं है जब जीन अभिव्यक्ति के मूल्यांकन (चित्रा 1) के लिए पारंपरिक पूरे ऊतक वर्कफ़्लो का उपयोग नहीं है के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है. हम डबल असहाय सीडीएनए एकल कक्ष transcriptome उपज micrograms है कि मैं पर प्रोटीन के उपयोग की सुविधा के मजबूत प्रवर्धन हासिल किया हैndividual कोशिकाओं. प्रक्रिया में हम NimbleGen सरणियों जो उपयोग और उनके डिजाइन को अनुकूलित करने के लिए की क्षमता के अपने आसानी के लिए चयन किया गया था का उपयोग का वर्णन करता है. वैकल्पिक रूप से, एक रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस - विशिष्ट लक्ष्य (आरटी एसटीए) प्रवर्धन प्रतिक्रिया, nanofluidic पीसीआर द्वारा लक्ष्य के सैकड़ों के qPCR के लिए अनुमति देता है. या तो इन तरीकों का उपयोग, यह अभिव्यक्ति की कोशिकाओं के बीच परिवर्तनशीलता, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दुर्लभ प्रकार की कोशिकाओं के एक ऊतक के भीतर से अभिव्यक्ति प्रोफाइल की जांच की जांच करने के लिए संभव है. कुल मिलाकर, एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति दृष्टिकोण डेटा है कि संभावित विशेष स्वभाव की अभिव्यक्ति प्रोफाइल है कि आम तौर पर बाहर औसत कर रहे हैं जब ठेठ पूरे ऊतकों से उत्पन्न homogenates से कोशिकाओं के लाखों लोगों की अभिव्यक्ति की जांच की पहचान कर सकते हैं की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है.
Protocol
1. चरण 1 - cardiomyocyte अलगाव
- पाचन बफर के रूप में इस प्रकार तैयार:
X 10 पाचन बफर (अति शुद्ध एच 2 हे में बनाया)अंतिम सान्द्र. छ / एल g/500 एमएल 10x समाधान छ / एल NaCl 130 मिमी 7.597 3.3 75.97 KCl 5 मिमी 0.4 0.2 4.0 Pyruvic एसिड 3 एनएम 0.33 0.165 3.30 HEPES 25 मिमी 5.96 2.85 59.6 2 MgCl 0.5 मिमी 0.101 0.05 1.01 नाह 2पीओ 4monobasic 0.33 मिमी 0.04 0.02 0.40 द्राक्ष - शर्करा 22 मिमी 3.96 1.98 39.6
NaOH के साथ पीएच बफर 7.4 के लिए - 10x पाचन बफर का प्रयोग, हर दिल है कि (अति शुद्ध एच 2 हे में किए गए) perfused जाएगा के लिए निम्नलिखित चार समाधान बनाने:
पाचन बफर (इस समाधान के तीन aliquots करें)
- 50 एमएल - 1x पाचन बफर युक्त:
- 75 μL - EGTA समाधान (100 मिमी EGTA)
पाचन बफर बी (बनाओ इन में से एक)
- 25 एमएल - 1x पाचन बफर युक्त:
- 1.25 μL - CaCl 2 समाधान (एम 1)
- 1 मिलीग्राम - Protease
- 25 मिलीग्राम - Collagenase (can = 18.75 मिलीग्राम इस राशि का 75%) का उपयोग **
संग्रह बफर (एक इनमें से बनाओ)
- 2.5 एमएल - 1x पाचन बफर युक्त:
- 1.25 μL - CaCl 2 समाधान (एम 1)
- 0.5 मिलीग्राम - Protease
- 15 मिलीग्राम (75% = 11.25 मिलीग्राम) Collagenase **
- 125 मिलीग्राम - BSA
निराकरण धो बफर (एक इनमें से बनाओ)
- 25 एमएल - 1x पाचन बफर युक्त:
- 6.25 μL - CaCl 2 समाधान (एम 1)
- 250 मिलीग्राम BSA
** स्रोत और collagenase के बैच के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, एंजाइम गतिविधि है . इस बफर जोडी अधिक पाचन को रोकने के एंजाइम की राशि का अनुकूलन यह आवश्यक हो सकता है.
- अलगाव के रूप में पहले से घ में वर्णित प्रणाली स्थापितपाचन बफर के तीन 15 एमएल beakers के साथ 1,2 etail बर्फ पर एक, एक पाचन बफर के 50 एमएल ट्यूब एक और 25 एमएल पाचन बफर छिड़काव के लिए तैयार (पाचन बफर एक लाइन के माध्यम से प्लावित किया जाना चाहिए 5 एमएल के कम से कम , बी प्रणाली के माध्यम से चलाने), संग्रह बफर एक पानी के स्नान में गर्म तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस, और निराकरण धो बफर आरटी पर बढ़ा.
- छिड़काव प्रवेशनी और विच्छेदन पकवान जहां दिल और साफ हो जाएगा छिड़काव टिप पर बंधे ठंड पाचन बफर ए के साथ शिथिल गाँठ प्रवेशनी के ऊपरी हिस्से के चारों ओर कुछ सिवनी (4 हे हे 6 आकार के) भरें. यह बाद में महाधमनी पकड़ बंद प्रवेशनी फिसल दिल को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
- Terminally शांत संवेदनाहारी एजेंट (0.25 एमएल सोडियम Pentobarbital समाधान) के एक आईपी इंजेक्शन के साथ माउस और माउस सुनिश्चित बेहोश और दर्द उत्तेजनाओं के लिए अनुत्तरदायी है. डायाफ्राम काटने वक्ष गुहा वक्ष मार्जिन के साथ सावधानी से खोलने के कट(चित्रा 2). ऊंचा ऊपर की तरफ कट और पूर्वकाल ribcage को प्रतिबिंबित (इन चीरों बी और एक नामित कर रहे हैं, चित्रा 2 में क्रमशः). क्रिटिकल - माउस अभी भी इन चीरों से पहले चाहिए श्वास हो.
- एक प्लास्टिक विंदुक आकार में कटौती का प्रयोग, धीरे पिपेट में दिल चूसना. दिल वक्ष गुहा के दिल पर महाधमनी के लिए पर्याप्त छोड़ने के लिए स्पष्ट रूप से महाधमनी शाखा (चित्रा 3) की पहचान के लिए सावधान किया जा रहा बाहर कट. एक विंदुक के बाद से यह दिल को न्यूनतम क्षति का कारण बनता है प्रयोग किया जाता है.
- ड्रॉप एक बीकर में बर्फ के ठंडे पाचन एक बफर के दिल और रक्त दूर कुल्ला. 15 - 45 सेकंड जगह बर्फ ठंड पाचन बफर के दूसरे बीकर में दिल के बाद एक संक्षिप्त फिर से कुल्ला. पेट्री भी ठंड पाचन बफर ए से भरा पकवान में दिल का स्थानांतरण
- पाचन विच्छेदन गुंजाइश के तहत एक बफर के पकवान में दिल देखें और ध्यान से महाधमनी और अपनी शाखाओं को अलग. ध्यान सिर्फ पिछले branc अवर ट्रिमघंटे (चित्रा 4).
- महाधमनी में प्रवेशनी टिप फ़िट और 4 हे के साथ जगह में 6 - हे सीवन एक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे मंच सेटअप का उपयोग करने के लिए कटी घमनी को बांधना. सुनिश्चित करें कि प्रवेशनी महाधमनी के भीतर भी कम नहीं बैठ करता है और कोरोनरी धमनियों (चित्रा 4) के ऊपर बनी हुई है.
- पाचन बफर के छिड़काव सेटअप के माध्यम से बह के साथ सेटअप करने के लिए पर छिड़काव टिप जगह है, और रक्त के बहुमत जब तक दिल और द्रव छोड़ने दिल स्पष्ट है से धोया जाता है दिल छिड़कना शुरू. क्रिटिकल छिड़काव तरल पदार्थ के तापमान के रूप में संभव के रूप में करीब 37 तक किया जाना चाहिए डिग्री सेल्सियस जब यह कैथेटर से बाहर आता है. यदि समाधान बहुत गर्म या बहुत ठंडा है तो छिड़काव ऊतकों को मार देगा. दिल का छिड़काव जब तक समय भी महत्वपूर्ण है. समय खिड़की दिल को हटाने से 5-10 मिनट से भी कम हो सकता है जब तक छिड़काव शुरू. दिल संवेदनाहारी के तहत हटा दिया जाना चाहिए, सीओ 2 मिलाना या गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था नहीं.
- एक बार खून हैदिल से hed, पाचन बफर ए से पाचन बफर बी करने के लिए स्विच सुनिश्चित करें कि पाचन बफर बी अब दिल के माध्यम से बह रहा है. समाधान के लिए एक पीले रंग के लिए शुरू हो जाएगा. 2-3 मिनट रुको जब तक दिल अपने आकार को खोने का लक्षण दिखाता है और गोल है जो एक संकेत है कि पाचन काम कर रहा है है देखो शुरू. मायोकार्डियम हल्का छिड़काव आय के रूप में प्रकट होना चाहिए.
- निलय कट बंद कैंची और जगह के साथ 37 पर 50 एमएल शंक्वाकार संग्रह बफर के 15 एमएल युक्त ट्यूब में डिग्री सेल्सियस धीरे छोटे - छोटे टुकड़ों में निलय में कटौती करते हुए संग्रह बफर में ऊतक दे. सेल सेल adhesions भंग करने के लिए और एक एकल कोशिका cardiomyocyte मिश्रण बनाने के लिए एक प्लास्टिक विंदुक के साथ धीरे मिश्रण.
- जब ऊतक के सबसे भंग कर रहा है (कम से कम 1 मिनट) बड़ा ऊतक टुकड़े नीचे सिंक. निकालें और एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब के लिए सतह पर तैरनेवाला बचाने के लिए. गुरुत्वाकर्षण सतह पर तैरनेवाला से 10 से 20 मिनट (15 पर एक गोली खींचमिनट कमरे के तापमान पर) पसंद है.
- निकालें और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. गोली निराकरण धो बफर के 5 एमएल जोड़ने और धीरे कोशिकाओं मिश्रण करने के लिए उन्हें resuspend द्वारा गोली धो लें. इस बिंदु पर कोशिकाओं तुरंत एकल कक्ष विश्लेषण (चरण 2 पर आगे बढ़ना) के लिए चयनित होने के लिए तैयार हैं.
2. चरण 2 - एकल कक्षों के अलगाव
- Micromanipulator एक लौ और एक गिलास केशिका ट्यूब जो कोशिकाओं में हेरफेर करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा का उपयोग कर तैयार है. micromanipulator बस एक बहुत ठीक केशिका ट्यूब है जो तब लचीला टयूबिंग जो चाल या कोशिकाओं लेने जब चूषण लागू किया जाता है कर सकते हैं का एक लंबा टुकड़ा से जुड़ा हुआ है है.
- तुरंत (Nikon ग्रहण TS100, 20x) खुर्दबीन एक micromanipulator है जो एक खींच विंदुक और एकल कक्ष नमूने नमूने के लिए स्थानांतरित किया जा रहा से सामग्री को रोकने के लिए एक airlock के साथ बनाया गया था का उपयोग कर के तहत व्यक्तिगत कक्षों का चयन करने के लिए आगे बढ़ना. सुनिश्चित करें कि सेल की आबादी को स्वस्थ है(70% व्यवहार्य) अलगाव की प्रक्रिया से क्षतिग्रस्त नहीं है और.
- कोशिकाओं पतला नीचे एक छोटा सा पेट्री डिश में इतना है कि वे व्यक्तिगत रूप से चुना जा सकता है है. जब उठा कोशिकाओं के लिए एक छोटी मात्रा (कम से कम 2 μL) में कोशिकाओं पर कब्जा करने के लिए सुनिश्चित हो. केवल स्वस्थ कोशिकाओं है कि विशिष्ट सामान्य cardiomyocyte आकारिकी (चित्रा 5) का चयन करें.
- व्यक्तिगत पीसीआर ट्यूबों के नीचे में व्यक्ति की कोशिकाओं प्लेस और उन्हें सूखी बर्फ पर तुरंत फ्रीज. इन कोशिकाओं को फिर -80 पर संग्रहीत कर रहे हैं डिग्री सेल्सियस जब तक वे जीन की अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा रहे हैं.
3. चरण 3A सेल - एकल qPCR जीन अभिव्यक्ति
3,4 (अग्रिम विकास प्रोटोकॉल # 30 Fluidigm) एकल कक्षों पर qPCR प्रदर्शन करने के लिए एक से एक Fluidigm निगम द्वारा एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति के लिए उनके BioMark Nanofluidic qPCR arrays के लिए विकसित अनुकूलित प्रोटोकॉल को रोजगार.
- विशिष्ट लक्ष्य प्रवर्धन (RT-एसटीए) - रिवर्स प्रतिलेखन की तैयारी. होना करने के लिएजिन, सभी प्राइमर जोड़े resuspend (हम 125 प्राइमर जोड़े को इस्तेमाल किया है सफलतापूर्वक) 1x डीएनए निलंबन बफर में 100 सुक्ष्ममापी (10 मिमी Tris, पीएच 8.0, 0.1 मिमी EDTA) पर ब्याज की जीन के लिए. मिश्रण है और आगे प्रत्येक परख के लिए 20 सुक्ष्ममापी आगे और रिवर्स प्राइमर जोड़े पतला. अन्त में, 200 एनएम के प्रत्येक परख कि RT-STA प्रतिक्रिया में परिलक्षित हो जाएगा के लिए एक अंतिम एकाग्रता के साथ एक समाधान में सभी प्राइमर जोड़े पतला. ऐसा करने के लिए, प्रत्येक प्राइमर जोड़ी ले और उन्हें 1:100 पतला. उदाहरण के लिए, यदि आप 20 सुक्ष्ममापी पर 30 परख प्राइमर जोड़े हैं, तो आप प्रत्येक जोड़ी (30 μL कुल) की 1 μL जोड़ने की जरूरत है, और फिर डीएनए निलंबन बफर के 70 μL के साथ मात्रा के शेष बनाने के लिए फाइनल में पहुंचने 100 μL के कमजोर पड़ने की मात्रा.
- अब जब कि प्राइमर समाधान तैयार हैं, RT-STA प्रतिक्रिया मास्टर मिश्रण को इकट्ठा करो. पर्याप्त व्यक्तिगत कक्षों आप बढ़ाना चाहते हैं प्रत्येक के लिए मास्टर मिश्रण तैयार करें.
तालिका 1. RT-STA मास्टर मिश्रणअभिकर्मक ΜL में वॉल्यूम (प्रति प्रतिक्रिया) 2x रिएक्शन मिश्रण CellsDirect 5.0 सुपरस्क्रिप्ट क्ष्क्ष्क्ष् RT Plantinum Taq मिश्रण 0.2 RT-STA प्राइमर मिश्रण (200 एनएम प्रत्येक परख) 2.5 Nuclease मुफ्त एच 2 हे (या 1x डीएनए निलंबन बफर) 1.3 कुल 9.0 - तुरंत अधिकतम आरसीएफ में 30 सेकंड के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को ट्यूब के नीचे तैनात हैं के लिए जमे हुए कोशिकाओं और अपकेंद्रित्र को हटा दें. ट्यूब के लिए RT-STA मिश्रण के 9 μL जोड़ें और एक thermocycler में प्रतिक्रिया के लिए आगे बढ़ें.
- 50 ° सी - 15 मिनट
- 95 डिग्री सेल्सियस - 2 मिनट
- 18 चक्रों
- 95 ° 15 सेकंड के लिए सी
- 60° 4 मिनट के लिए सी
- 4 में रुको डिग्री सेल्सियस
- पीसीआर मशीन से ट्यूबों निकालें और प्रतिक्रिया ExoSAP आईटी 4 μL जोड़ने. ExoSAP आईटी पीसीआर सफाई अभिकर्मक जो RT-STA प्रतिक्रिया से अधिक प्राइमरों और एंजाइम को निकाल देंगे है. एक पीसीआर मशीन में निम्नलिखित प्रतिक्रिया के माध्यम से ट्यूब चलाएँ.
- 37 ° सी - 15 मिनट
- 80 ° सी - 15 मिनट
- 4 में रुको डिग्री सेल्सियस
- जब उपचार ExoSAP आईटी डीएनए निलंबन बफर के साथ पूरा हो गया है, नमूने 01:05 पतला. नमूने अब qPCR विश्लेषण के लिए तैयार हैं. हम Fluidigm जीन अभिव्यक्ति qPCR Arrays (48.48, या 96.96 प्लेट) के साथ संयोजन के रूप में इस सामग्री का उपयोग करें. यह भी अधिक पारंपरिक qPCR इंस्ट्रूमेंटेशन (96 अच्छी तरह से या 384 अच्छी तरह स्वरूपों) के साथ इस दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए संभव है. हालांकि, इन उपकरणों आमतौर पर बहुत अधिक नमूना इनपुट जो assays की संख्या प्रतिबंधित है कि पी जा सकता है की आवश्यकताकिसी एकल कक्ष से erformed.
3. चरण 3B - पूरे transcriptome और एकल कक्षों के प्रवर्धन माइक्रोएरे
निष्कर्षण और प्रवर्धन
- सिग्मा WTA2 किट (WTA2 # कैट) का प्रयोग करने के लिए दोनों छर्रों और एकल कक्षों से डबल असहाय सीडीएनए बढ़ाना. एकल कोशिकाओं सिग्मा WTA2 प्रोटोकॉल के निर्माता के निर्देशों के अनुसार पहला कदम के माध्यम से कर रहे हैं "निकाले". इस दिशा में पहला कदम के दौरान 37 पर पुस्तकालय संश्लेषण बफर के साथ ऊष्मायन डिग्री सेल्सियस के लिए 5 मिनट के एकल कोशिकाओं की झिल्ली और प्रवर्धन के लिए संदेश "अर्क" बाधित.
- दो दौर में एकल कक्षों बढ़ाना, सिग्मा Aldrich WTA2 किट से दिशाओं का उपयोग. पुस्तकालय प्रस्तुत करने का निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार कदम प्रदर्शन, तो WTA2 प्रवर्धन के 70 μL 1 / 5 पुस्तकालय नमूने के जोड़
मास्टर मिक्स. 25 चक्र के लिए सिफारिश की साइकिल चालन के मापदंडों का उपयोग कर नमूने बढ़ाना. - नमूने उसी शुद्धएनजी Qiagen है QIAquick पीसीआर शुद्धीकरण (28,104 # कैट) किट और Qiagen Qiacube पर प्रक्रिया "क्लीनअप QIAquick पीसीआर प्रवर्धन प्रतिक्रियाओं मानक V4" प्रोटोकॉल का उपयोग.
- 5 μL नमूने शुद्ध ध्यान लगाओ, एक गति निर्वात का उपयोग, और 17 चक्र (WTA2 प्रवर्धन प्रोटोकॉल और साइकिल मापदंडों दोहराया) के लिए एक प्रवर्धन के दूसरे दौर के माध्यम से डाल दिया.
- QIAquick पीसीआर शुद्धीकरण किट का उपयोग कर नमूने शुद्ध और गुणवत्ता की जांच 'निर्माताओं प्रोटोकॉल के अनुसार एक NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और Agilent है BioAnalyzer डीएनए 7500 किट का उपयोग कर.
लेबल और NimbleGen जीन एक्सप्रेशन Arrays
- लेबल डबल 2 μg प्रत्येक प्रवर्धित सेल निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार NimbleGen एक रंग लेबल किट (05223555001 # कैट) का उपयोग नमूना से सीडीएनए फंसे.
- मुसलमानों मस्कुलस 12x135k, NimbleGen जीन एक्सप्रेशन (बिल्ली 05543797001 #) Arrays एसीसी के Cy3 नमूना लेबल 5 μg अंतरभिजनन के योग्यनिर्माता के प्रोटोकॉल के लिए ording. Arrays के लिए नमूने के संकरण के बाद, तो स्लाइड्स और धोया जाना चाहिए सूखे से पहले वे एक लेज़र स्कैनर पर imaged किया जा सकता है.
- स्कैन जीन अभिव्यक्ति Arrays एक लेजर स्कैनर का उपयोग कर. यहाँ, हम 100POW की सेटिंग्स के साथ एक आण्विक डिवाइसेज GenePix 4200A स्कैनर, और 300-350PMT का उपयोग करें. फिर प्रत्येक NimbleGen NimbleScan सॉफ्टवेयर का उपयोग सरणी के लिए जोड़ी फ़ाइलों को पैदा करते हैं और बाद में प्रत्येक एकल कक्ष सरणी (ठेठ stably व्यक्त cardiomyocyte टेप की एक मेज एक पूरक के रूप में शामिल है, टेबल S1) से पूरे transcriptome की अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण.
यदि दिल छिड़काव अच्छी तरह से काम किया है वहाँ स्वस्थ हृदय कोशिकाओं है कि अलगाव पर अपने ठेठ आयताकार आकारिकी बनाए रखने के एक उच्च प्रतिशत किया जाना चाहिए. यदि छिड़काव अच्छी तरह से आगे नहीं था तो वहाँ मृत कोशिकाओं का एक बड़ा प्रतिशत (चित्रा 5 में छवियों को देखने के) हो जाएगा. यदि कोशिकाओं को सही ढंग से या तो WTA2 या RT-STA तरीकों का उपयोग कर परिलक्षित कर रहेn अंत उत्पादों mRNA नमूनों की NanoDrop और BioAnalyser (चित्रा 6) द्वारा गुणवत्ता के लिए बाद में गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षणों के पास चाहिए. माइक्रोएरे वर्कफ़्लो के लिए, इस डब्ल्यूटीए प्रवर्धन जहां mRNA दोनों NanoDrop और Bioanalyzer द्वारा परीक्षण किया जाता है के बाद पूरा हो गया है. इस विश्लेषण के लिए प्रतिनिधि सकारात्मक परिणाम चित्रा 6 में दिखाए जाते हैं. WTA2 नमूने दोनों NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पढ़ना, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से Bioanalyzer चिप (बीए) (चित्रा 6) से electropherogram readout के साथ एक मजबूत प्रवर्धन दिखाना चाहिए. जीन है जो stably एकल कक्षों के माइक्रोएरे के माध्यम से पाया गया की एक तालिका (टेबल S1) एक उदाहरण के रूप में शामिल है. QPCR प्रक्रिया के लिए, डेटा की गुणवत्ता पीसीआर के लिए सुनिश्चित करें कि प्राइमर सेट वांछित उत्पाद (चित्रा 7) amplifying रहे हैं प्रतिक्रिया के अंत में एक पिघल कदम प्रदर्शन से मूल्यांकन किया जा सकता है. सही अगर, यह पिघल कदम एक विशिष्ट पिघल चोटी उत्पन्न करनी चाहिए. इस बिंदु को वर्णन करने के लिए, nanofluidic qPCR डेटा के एक सबसेट शिखर पिघल टी के एक हीटमैप में दिखाया गया हैemperature (चित्र 8) 8. यह अपनी पिघल तापमान से एक पीसीआर उत्पाद की गुणवत्ता का आकलन करने के लिए गैर विशिष्ट 5 उत्पादों के अभाव सुनिश्चित करने के लिए संभव है. इस नक्शे के प्रत्येक पंक्ति एक कक्ष (S1-S40) नमूना है 43 अलग qPCR assays (A1: A43) में परीक्षण का प्रतिनिधित्व करता है. इस आंकड़े में, यह स्पष्ट है कि कुछ assays काफी चर रहे हैं और शायद उच्च पीसीआर विशिष्टता के साथ और अधिक स्थिर assays से कम विश्वसनीय हैं.
चित्रा 1 एकल सेल अलगाव और जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण का अवलोकन. माउस हृदय की शल्य हटाने और व्यक्ति cardiomyocytes के अलगाव प्रक्रिया प्रदर्शन करेंगे. इस प्रक्रिया में चर्चा की विधियों या पूरे transcriptome प्रवर्धन (डब्ल्यूटीए) के बाद माइक्रोएरे विश्लेषण qPCR के लिए तरीके शामिल हैं. डब्ल्यूटीए प्रक्रिया तो सिग्मा सार्वभौमिक प्राइमरों के बंधन (बी) mRNA lysis (ए) के साथ शुरू होता हैपूल. इन प्राइमरों (सी) और प्रवर्धन चरण (डी) के विस्तार प्रवर्धित सामग्री के micrograms बनाएँ. यह प्रवर्धन तो (ई) माइक्रोएरे प्रक्रिया के लिए पर्याप्त सामग्री को उत्पन्न करने के लिए दोहराया है.
चित्रा 2 चीरों के स्थान पर माउस से दिल हटाने का प्रतिनिधित्व. रिब पिंजरे के पार्श्व दीवार (ए) के साथ कट, तो रिब पिंजरे के अवर मार्जिन (बी) के साथ काटा. ऊपर और नीचे दिल वाहिकाओं काटना हटाने के लिए अनुमति देते हैं, जबकि अभी भी महाधमनी के लिए पर्याप्त छोड़ने के लिए दिल cannulate. एम.जे. कुक 6 से अनुकूलित छवियाँ.
चित्रा 3 माउस के छाती के आरेख. बिंदीदार लाइनों घंटे को नुकसान पहुँचाए बिना वक्ष गुहा से दिल excising के लिए (एक) चीरों के स्थान का संकेत मिलता है eart ऊतक. एम.जे. कुक 6 से अनुकूलित छवियाँ.
चित्रा 4 महाधमनी चाप और अपनी शाखाओं की छवि. ग्रे लाइन जहां महाधमनी (एक) ट्रिम करने के लिए आदर्श स्थान इंगित करता है. शेष दिल को जुड़ी महाधमनी cannulated है ताकि प्रवेशनी (बी) के टिप महाधमनी के भीतर उचित स्तर (सी) के लिए चला जाता है. एफ Gaillard 7 से अनुकूलित छवियाँ.
चित्रा 5 जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए एकल कक्षों का चयन. प्रत्येक पैनल प्रकाश cardiomyocytes की ठेठ आकारिकी दिखा खुर्दबीन के नीचे imaged cardiomyocytes को दिखाता है. स्वस्थ cardiomyocytes हरी तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं. कक्ष जो मृत या मर रहे हैं लाल तीर के साथ दिखाए जाते हैं. इन मृत कोशिकाओं विश्लेषण में नहीं किया जाना चाहिए.
iles/ftp_upload/3302/3302fig6.jpg "Alt =" 6 / चित्रा ">
चित्रा 6 गुणवत्ता नियंत्रण डब्ल्यूटीए एकल कक्ष प्रवर्धन के लिए परिणाम है . (ए) एक NanoDrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर readout है कि डब्ल्यूटीए प्रतिक्रिया से प्रवर्धित टेप के लिए उपयुक्त है की छवि. (बी) BioAnalyzer चिप से readout तीन प्रवर्धित कोशिकाओं से परिणाम से पता चलता है.
चित्रा 7. QPCR प्रवर्धन (वाम चार्ट) घटता है और शिखर तापमान घटता (राइट चार्ट) पिघला. (ए) एक गुणवत्ता परख से अभिव्यक्ति परिणाम अलग प्रवर्धन घटता बावजूद भी पिघल चोटी के साथ दिखाए जाते हैं. (बी) एक गरीब प्राइमर सेट है, जो अत्यधिक चर पिघल चोटियों जो अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए आदर्श नहीं है के लिए घटता पिगलो.
एकल कक्ष qPCR प्रतिक्रिया के लिए 8 चित्रा गुणवत्ता नियंत्रण के परिणामआयनों. इस गर्मी के नक्शे के लिए एक रंग पैमाने के रूप में पिघल तापमान प्रदर्शित करने के लिए बनाया गया था. प्रत्येक qPCR परख के लिए शिखर पिघलने के तापमान (A1: A43) 40 व्यक्ति की कोशिकाओं (S1 40) के लिए दिखाया गया है. assays उनके पिघल तापमान के अनुसार क्लस्टर थे. नीचे प्रत्येक परख के लिए स्तंभ देख कर यह संभव है करने के लिए देखने के लिए भिन्नता सभी नमूनों भर में पिघल. यह आंकड़ा दर्शाता है कि कुछ qPCR assays बहुत विशिष्ट हैं, जबकि दूसरों को अत्यधिक चर रहे हैं और इस प्रकार एकल कोशिका विश्लेषण के लिए उपयुक्त नहीं हैं.
टेबल S1. माइक्रोएरे डेटा के पूरक तालिका इन जीनों मजबूती जिसमें वे एक बड़े डेटासेट भर एकल cardiomyocytes में पता चला रहे हैं के अनुसार सूचीबद्ध हैं. इस जीन जीन है कि आम तौर पर एकल cardiomyocytes में व्यक्त कर रहे हैं की एक संख्या के लिए पता लगाने की संवेदनशीलता सूची इंगित करता है.
Discussion
इस विधि के लिए कार्यात्मक की एक संख्या के रूप में अच्छी तरह के रूप में जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए cardiomyocytes उत्पन्न संभावना है. एकल कक्षों की परीक्षा जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण में एक तेजी से बढ़ते क्षेत्र है. एकल कोशिका के स्तर पर transcriptional स्तर की जांच करने का लाभ यह है कि यह एक शुद्ध सेल की आबादी है, जो पूरे ऊतकों की तैयारी से संभव नहीं है की परीक्षा की अनुमति देता है. इसके अतिरिक्त, एकल कक्ष विश्लेषण व्यक्ति की कोशिकाओं में mRNA स्तर के stochastic परिवर्तन की परीक्षा सेल आबादी है कि पहले सजातीय 8,9 लगा रहे थे परिभाषित करने के लिए अनुमति देता है. जीन जो उनके जीन अभिव्यक्ति 10,11,12 में संभावित stochastic कर रहे हैं की पहचान करने के अलावा, विधि भी दुर्लभ सेल उनके जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल द्वारा परिभाषित आबादी की पहचान के लिए अनुमति देता है.
हालांकि इस विधि जीन की अभिव्यक्ति विश्लेषण में रोमांचक क्षमता का उपयोग करता का एक नंबर प्रदान करता है, वहाँ रहे हैं सोमएकल कक्षों के उपयोग में ई निरंतर और विचार. एकल कक्ष विश्लेषण करने के लिए प्राथमिक सीमा, प्रयोग में पर्याप्त कोशिकाओं के संग्रह के लिए ब्याज की मीट्रिक संबंध के साथ उदाहरण के विचरण के लिए सांख्यिकीय महत्व प्राप्त करने है. मामलों में जहां ब्याज के ऊतकों से अलग कक्षों की संख्या एक सीमा नहीं है, एक समूह के प्रति कोशिकाओं के सैकड़ों की जांच, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण, या nanofluidic सरणियों के रूप में इस तरह के दृष्टिकोण का उपयोग कर सकते हैं. हालांकि, कुछ मामलों में, वहाँ हित के ऊतकों से पर्याप्त कोशिकाओं को प्राप्त करने में कठिनाई हो सकता है. इस हिस्से में लक्षित सेल प्रकार का संग्रह के लिए विशेष स्वभाव का समय गहन प्रक्रियाओं की वजह से किया जा सकता है. हालांकि, सावधान योजना और एकल कक्ष संग्रह के साथ आगे बढ़ने से पहले तैयारी अभी भी सीमित तकनीकी त्रुटि के साथ कठोर एकल कोशिका विश्लेषण के लिए अनुमति दे सकता है. जब परिणाम यह विचार किया जाना चाहिए की जांच कि, भले ही अलग कोशिकाओं के लिए इस प्रक्रिया के कई studie में इस्तेमाल किया गया है(माइक्रोस्कोपी, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, आदि सहित), अलगाव ही संभावित जीन की अभिव्यक्ति के प्रभाव सकता है. किसी भी विधि है जो जैविक नमूनों manipulates के साथ के रूप में, अपने निष्कर्षों के परिणामों को ध्यान करने के लिए सुनिश्चित करें एकल कक्ष अभिव्यक्ति ऊतक और ही नहीं तकनीकी पूर्वाग्रह के प्रतिनिधि है मान्य होना चाहिए. स्वस्थानी संकरण में के रूप में इस तरह के तरीके को बरकरार ऊतकों में इन परिणामों की पुष्टि करने के लिए उपयोगी साबित हो सकता है. अंत में, यह महत्वपूर्ण है करने के लिए सुनिश्चित करें कि डेटा उत्पन्न को ध्यान से गुणवत्ता नियंत्रण के लिए जाँच की है. 8 चित्रा में दिखाया गया डेटा दर्शाता है कि qPCR assays उनकी विशिष्टता में बहुत मजबूत हो सकता है, जैसे # 13 परख (A13) या परिवर्तनशीलता का एक उच्च स्तरीय है जो # 34 (A34) परख जैसे तकनीकी विचरण करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
Acknowledgments
लेखकों के लिए इस प्रोटोकॉल के फिल्मांकन के दौरान सी. Zambataro की तकनीकी सहायता स्वीकार करना होगा. हम कृतज्ञता एक नाथन शॉक केंद्र पुरस्कार के लिए ग्लेन मेडिकल रिसर्च (एस), Hillblom नींव, और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान के लिए फाउंडेशन (P30AG025708) और PO1AG025901 के समर्थन को स्वीकार करते हैं. JMF T32AG000266 उम्र बढ़ने पर अनुसंधान के लिए बक संस्थान के लिए सम्मानित किया गया द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71378 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 | |
| Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich | P4562 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | 54457 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1020 | |
| NaH2PO4 monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G6721 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | O3777 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Protease, Type XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase, Type I | Worthington Biochemical | C9891 | |
| 1x DNA Suspension Buffer (10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | TEKnova, Inc. | PN T0221 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B8667 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | Contact supplier for ordering | *must be procured through a Veterinarian or lab animal professional |
| ExoSAP IT | Affymetrix | 78201 | |
| CellsDirect 2x Rxn Mix | Invitrogen | 11737-030 | |
| SuperScript III RT Platinum Taq Mix | Invitrogen | 10928-042 | |
| RT-STA Primer Mix | IDT | Custom | |
| Nuclease Free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| WTA2 | Sigma-Aldrich | WTA2-50rxn | |
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Qiacube | Qiagen | 9001292 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | 2000c | |
| BioAnalyzer DNA 7500 kit | Agilent Technologies | 7500 kit | |
| One Color Labeling kit | Roche Group | 5223555001 | |
| Mus Musculus 12x135k array | Roche Group | 5543797001 | |
| GenePix 4200A Scanner | Molecular Devices | 4200A | |
| TransPlex Complete Whole Transcriptome Amplification Kit (WTA2 Kit) | Sigma-Aldrich | WTA2-50RXN |
References
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J. Physiol. Sci. 57 (6), 327-335 (2007).
- Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Dev. Cell. 18 (4), 675-685 (2010).
- Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).
- D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR. Methods. 50 (4), 262-270 (2010).
- Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. Informatics. , Academic Press. (1965).
- Gaillard, F. Aorta. Radiopaedia. , (2008).
- Ståhlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations. Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).
- Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells. Lab Chip. 8 (1), 68-74 (2008).
- Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart. Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).
- Raj, A., van Oudenaarden, A. Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences. Cell. 135 (2), 216-226 (2008).
- Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
