Summary
وحيد الخلية التنميط التعبير يسمح التعبير الجيني التحليل التفصيلي الخلايا الفردية. نحن تصف طرق لعزل الخلايا العضلية ، وإعداد lysates الناتجة إما كليا أو ميكروأري transcriptome qPCR أهداف محددة.
Abstract
في حين أن العديد من الدراسات قد درست التغييرات التعبير الجيني من الخليط من أنسجة القلب ، وهذا يحول دون دراسة الاختلاف بين الخلايا العشوائية الكامنة داخل الأنسجة. عزل السكان cardiomyocyte نقية من خلال نضح كولاجيناز قلوب الماوس يسهل جيل من خلية واحدة لميكروأرس كله transcriptome التعبير الجيني ، أو qPCR أهداف محددة باستخدام صفائف nanofluidic. نحن هنا وصف لإجراء فحص واحد ملامح التعبير الجيني للخلايا العضلية معزولة من القلب. هذا النموذج يسمح لتقييم مقاييس المصالح التي لا تعتمد على الوسط (على سبيل المثال الفرق بين الخلايا داخل الأنسجة) التي هي غير ممكنة عند استخدام الأنسجة التقليدية سير العمل كله لتقييم التعبير الجيني (الشكل 1). حققنا التضخيم القوي للميكروغرام خلية واحدة transcriptome العائد من [كدنا] الذين تقطعت بهم السبل المزدوج الذي يسهل استخدام ميكروأرس على طndividual الخلايا. في إجراء وصفنا استخدام صفائف NimbleGen التي تم اختيارها لسهولة استخدامها والقدرة على تخصيص تصميمها. بدلا من ذلك ، والناسخ العكسي -- التضخيم محددة الهدف (RT - STA) رد فعل ، ويسمح لqPCR مئات الأهداف التي nanofluidic PCR. باستخدام أي من هذه الأساليب ، فمن الممكن لدراسة التباين في التعبير بين الخلايا ، وكذلك دراسة ملامح التعبير من أنواع الخلايا نادرة من داخل الأنسجة. عموما ، هذا الجين التعبير عن خلية واحدة النهج يسمح لتوليد البيانات التي يمكن أن تحدد ملامح التعبير الفقهي يحتمل أن متوسط عادة عند دراسة أصل التعبير عن ملايين الخلايا من الخليط النموذجية الناتجة من الأنسجة كلها.
Protocol
1. الخطوة 1 -- العزلة Cardiomyocyte
- إعداد العازلة الهضم على النحو التالي :
10 الاحتياطي الهضم × (المحرز في فائقة نقية O 2 H)اضرب النهائي. ز / L g/500 مل ز حل 10X / L كلوريد الصوديوم 130 ملم 7،597 3.3 75.97 بوكل 5 مم. 0.4 0.2 4.0 حمض البيروفيك 3 نانومتر 0.33 0،165 3.30 HEPES 25 ملم 5.96 2.85 59.6 MgCl 2 0.5 ملم 0،101 0.05 1.01 ناه 2بريد 4monobasic 0.33 ملي 0.04 0.02 0.40 الدكستروز 22 ملم 3.96 1.98 39.6
العازلة إلى 7.4 درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم - باستخدام الاحتياطي 10X الهضم ، وجعل الأربعة التالية الحلول لكل قلب أن perfused (صنع في فائقة نقية O 2 H) :
الاحتياطي الهضم ألف (aliquots يتخذ ثلاثة من هذه الحلول)
- 50 مل -- 1X الاحتياطي الهضم التي تحتوي على :
- ميكرولتر 75 -- EGTA حل (100 ملي EGTA)
الهضم الاحتياطي ب (جعل واحدة من هذه)
- 25 مل -- 1X الاحتياطي الهضم التي تحتوي على :
- 1.25 ميكروليتر -- CaCl 2 محلول (1 M)
- 1 ملغ -- البروتياز
- 25 ملغ -- كولاجيناز (كاليفورنيان أيضا استخدام 75 ٪ من هذا المبلغ = 18.75 ملغ) **
جمع العازلة (جعل واحدة من هذه)
- 2.5 مل -- 1X الاحتياطي الهضم التي تحتوي على :
- 1.25 ميكروليتر -- CaCl 2 محلول (1 M)
- 0،5 ملغ -- البروتياز
- 15 ملغ -- كولاجيناز (75 ٪ = 11.25 ملغ) **
- 125 ملغ -- BSA
تحييد الاحتياطي اغسل (جعل واحدة من هذه)
- 25 مل -- 1X الاحتياطي الهضم التي تحتوي على :
- 6.25 ميكروليتر -- CaCl 2 محلول (1 M)
- 250 ملغ BSA
** واعتمادا على مصدر ودفعة من كولاجيناز ، قد تختلف نشاط انزيم. قد يكون من الضروري لتحسين كمية الأنزيم المضافة إلى هذا المخزن المؤقت لمنع الإفراط في الهضم.
- إعداد نظام العزلة في السابق كما هو موضح في دetail 1،2 مع ثلاثة أكواب 15 مل من الاحتياطي الهضم A على الجليد ، وأنبوب واحد مل من 50 ألف مخزن الهضم والهضم مل 25 B الاحتياطي مستعد لنضح (الاحتياطي الهضم وينبغي مسح من خلال الخط ، في الحد الأدنى من 5 مل من خلال تشغيل النظام) ، وارتفعت درجة حرارة المخزن كوكتيل في حمام مائي لرفع درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية ، واغسل تحييد الاحتياطي في RT.
- سد قنية التروية وطبق تشريح حيث سيتم تنظيف القلب ، وتعادل على طرف نضح من البرد الهضم ألف عقدة الاحتياطي فضفاضة بعض خياطة (4 - O - O لحجم 6) حول الجزء العلوي من قنية. وسوف يكون هذا في وقت لاحق يستخدم للاحتفاظ الأورطى لمنع الانزلاق قلب قبالة قنية.
- رزين عضال الماوس مع حقنة مخدر IP وكيل (0.25 مل بنتوباربيتال حل الصوديوم) وضمان الفأر هو فاقد الوعي وغير مستجيب للمنبهات الألم. خفض فتح التجويف الصدري بعناية على طول طريق خفض هامش الصدري الحجاب الحاجز(الشكل 2). قطع متفوق صعودا وتعكس القفص الصدري الأمامي (يتم تعيين هذه الشقوق B و A على التوالي في الشكل 2) الحرج -- الماوس لا يزال يتعين التنفس قبل هذه الشقوق.
- باستخدام قطع من البلاستيك ماصة لحجمها ، وتمتص بلطف القلب إلى ماصة. قطع القلب من تجويف الصدر والحرص على ترك ما يكفي من الشريان الأورطي في القلب إلى تحديد واضح لفرع الأبهر (الشكل 3). ويستخدم ماصة منذ يتسبب في أضرار طفيفة في القلب.
- هبوط في القلب في واحدة من الاحتياطي دورق الهضم الجليد الباردة ألف وشطف الدماء. بعد 15 -- 45 ثانية في القلب مكان في الدورق الثاني من الاحتياطي الهضم الجليد الباردة لشطف لفترة وجيزة مرة أخرى. نقل قلب في طبق بتري أيضا مليئة الباردة الهضم ألف الاحتياطي
- عرض القلب في طبق من الاحتياطي الهضم وضمن نطاق تشريح بعناية وعزل الشريان الأورطي وفروعه. تقليم بعناية أدنى عادل للمشاركة الفروع الخارجيةح (الشكل 4).
- تناسب الطرف قنية في الشريان الأورطي وligate في مكان مع O - 4-6 - O خياطة باستخدام الإعداد مرحلة تشريح تحت المجهر. تأكد من أن لا يجلس قنية منخفضة جدا داخل الشريان الأورطي ، ويبقى فوق الشرايين التاجية (الشكل 4).
- مع مخزن الهضم والتي تتدفق من خلال الإعداد التروية ، ومكان غيض نضح إلى الإعداد ، والبدء في يروي القلب حتى يتم غسلها أغلبية الدم من القلب وترك القلب السائل واضحة. الحرجة -- درجة حرارة السوائل يجب أن تكون قريبة نضح ممكن الى 37 درجة مئوية عندما يخرج من القسطرة. إذا الحل هو ساخنة جدا أو باردة جدا ثم سوف نضح قتل الأنسجة. الوقت حتى نضح القلب أمر بالغ الأهمية أيضا. يجب أن يكون الإطار الزمني أقل من 5-10 دقيقة من ازالة قلب نضح حتى يبدأ. يجب إزالة القلب تحت التخدير ، وليس CO 2 affixation أو خلع عنق الرحم.
- مرة واحدة في الدم كانهد من القلب ، والتبديل في الهضم B الاحتياطي من الهضم ألف الاحتياطي تأكد من أن الاحتياطي B الهضم تتدفق الآن من خلال القلب. وسوف يبدأ الحل أن يكون لها لون أصفر. الانتظار 2-3 دقائق حتى قلب يظهر علامات فقدان شكله ويبدأ في نظرة مقربة وهو يدل على أن يعمل الهضم. يجب أن تظهر عضلة القلب أخف وعائدات التروية.
- خفض قبالة البطينين مع مقص ومكان في أنبوب مخروطية 50 مل تحتوي على 15 مل من الاحتياطي كوكتيل في 37 درجة مئوية. خفض بلطف البطين الى قطع صغيرة ، بينما وضع في الأنسجة العازلة كوكتيل. المزيج بلطف مع ماصة بلاستيكية بحل التصاقات خلية خلية وجعل cardiomyocyte خلية واحدة الخليط.
- عندما تم حل معظم الأنسجة ، (أقل من 1 دقيقة) ترك قطعة نسيج أكبر تنزل الى القاع. إزالة وحفظ طاف لأنبوب مخروطي 15 مل. اسمحوا خطورة سحب بيليه من طاف أكثر من 10 إلى 20 دقيقة (15فضل دقيقة) في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة وتجاهل طاف. يغسل بيليه بإضافة 5 مل من تحييد الاحتياطي اغسل لبيليه ومزيج بلطف الخلايا لresuspend لهم. عند هذه النقطة كانت الخلايا جاهزة على الفور ليتم تحديده للتحليل خلية واحدة (انتقل إلى الخطوة 2).
2. الخطوة 2 -- عزل واحد من الخلايا
- إعداد micromanipulator باستخدام اللهب وأنبوب الزجاج الشعرية التي سيتم استخدامها لمعالجة الخلايا. وmicromanipulator هو مجرد أنبوب دقيق جدا الشعرية التي تعلق ثم إلى قطعة طويلة من الأنابيب المرنة التي يمكن ان تتحرك أو التقاط الخلايا عندما يتم تطبيق الشفط.
- الشروع فورا في اختيار الخلايا الفردية تحت المجهر (نيكون الكسوف TS100 ، 20X) باستخدام micromanipulator التي تم إنشاؤها بواسطة ماصة سحبت وغرفة معادلة الضغط لمنع المواد من نقله إلى خلية عينات عينة واحدة. ضمان حصول السكان الخلية هو صحي(70 ٪ قابلة للحياة) وليس تضررت من عملية العزلة.
- تمييع الخلايا إلى الأسفل في طبق بتري الصغيرة بحيث يمكن اختيارهم بشكل فردي. عند اختيار الخلايا تأكد من التقاط الخلايا في حجم صغير (أقل من 2 ميكرولتر). حدد الخلايا السليمة فقط التي لديها المميزة التشكل cardiomyocyte العادي (الشكل 5).
- مكان الخلايا الفردية في الجزء السفلي من الأنابيب PCR الفردية وتجميدها على الفور على الثلج الجاف. ثم يتم تخزين هذه الخلايا في -80 درجة مئوية حتى يتم استخدامها لتحليل التعبير الجيني.
3. الخطوة 3A -- qPCR خلية واحدة التعبير الجيني
لأداء qPCR على الخلايا وحيدة توظيف بروتوكول تكييفها من خلية واحدة وضعت للتعبير الجين من قبل شركة Fluidigm لهذه المصفوفات Biomark qPCR Nanofluidic (Fluidigm -- النهوض بالتنمية بروتوكول # 30) 3،4.
- إعداد النسخ العكسي -- التضخيم محددة الهدف (RT - STA). أن تكونالجن ، resuspend جميع أزواج التمهيدي (ونحن قد استخدمت ما يصل إلى 125 أزواج التمهيدي بنجاح) للجينات الفائدة عند 100 ميكرومتر في الحمض النووي 1X العازلة تعليق (10 ملي تريس ، ودرجة الحموضة 8.0 ، 0.1 ملم EDTA). والجمع بين مزيد من تمييع أزواج التمهيدي إلى الأمام وعكس إلى 20 ميكرومتر لكل مقايسة. أخيرا ، تمييع جميع أزواج التمهيدي في حل واحد مع التركيز النهائي لل200 نانومتر لكل مقايسة التي سوف تتضخم في التفاعل RT - STA. للقيام بذلك ، واتخاذ كل زوج التمهيدي وتمييع لهم 1:100. على سبيل المثال ، إذا كان لديك 30 زوجا مقايسة التمهيدي في 20 ميكرون ، وسوف تحتاج إلى إضافة 1 ميكرولتر من كل زوج (30 مجموع ميكرولتر) ، وجعل بعد ذلك ما تبقى من وحدة التخزين مع 70 ميكرولتر من العازلة تعليق الحمض النووي للوصول الى النهائي حجم التخفيف من 100 ميكروليتر.
- الآن أن يتم إعداد الحلول التمهيدي ، التجمع الرئيسي تفاعل RT - STA المزيج. إعداد ما يكفي من مزيج الرئيسي لكل من الخلايا الفردية التي ترغب في التعاظم.
الجدول 1. مزيج الرئيسي RT - STAالكاشف ميكرولتر في حجم (في رد فعل) CellsDirect 2X مزيج التفاعل 5.0 ثالثا مرتفع RT Plantinum طق مزيج 0.2 RT - STA مزيج التمهيدي (200 نانومتر كل مقايسة) 2.5 Nuclease الحرة H 2 O (1X العازلة أو تعليق DNA) 1.3 مجموع 9.0 - على الفور إزالة الخلايا المجمدة والطرد المركزي في إطار التعاون الإقليمي أقصى لمدة 30 ثانية لضمان أن يتم وضع الخلايا في الجزء السفلي من الأنبوب. إضافة ميكرولتر من 9 RT - STA المزيج إلى أنبوب ، والشروع في رد الفعل في thermocycler.
- 50 درجة مئوية -- 15 دقيقة
- 95 درجة مئوية -- 2 دقيقة
- دورات من 18
- 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية
- 60درجة مئوية لمدة 4 دقائق
- عقد في 4 درجات مئوية
- إزالة أنابيب من جهاز PCR وإضافة 4 ميكرولتر من ExoSAP تكنولوجيا المعلومات للتفاعل. ExoSAP - IT هو كاشف تنظيف PCR الذي سيزيل الاشعال الزائدة والانزيم من التفاعل RT - STA. تشغيل أنابيب من خلال التفاعل التالي في جهاز PCR.
- 37 درجة مئوية -- 15 دقيقة
- 80 درجة مئوية -- 15 دقيقة
- عقد في 4 درجات مئوية
- عند معالجة ExoSAP - IT اكتمال ؛ تمييع 01:05 عينات الحمض النووي مع تعليق العازلة. مستعدون الآن لتحليل عينات qPCR. نحن نستخدم هذه المواد بالتعاون مع صفائف Fluidigm لجين qPCR التعبير (48.48 ، 96.96 ، أو لوحات). ومن الممكن أيضا استخدام هذا النهج مع أكثر الأجهزة qPCR التقليدية (96 أو 384 تنسيقات جيدا أيضا). ومع ذلك ، فإن هذه الصكوك عادة ما تتطلب أكثر من ذلك بكثير إدخال عينة الذي يقيد عدد من المقايسات التي يمكن أن تكون عerformed من خلية واحدة.
3. الخطوة 3B -- الجامعة التضخيم transcriptome ميكروأري واحدة من الخلايا
استخراج والتضخيم
- استخدام سيغما WTA2 مجموعة (كات # WTA2) لتضخيم مزدوجة [كدنا] الذين تقطعت بهم السبل من كلا الكريات والخلايا واحدة. هي "انتزعت" خلايا وحيدة عبر الخطوة الأولى من بروتوكول WTA2 سيغما وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. خلال هذه الخطوة الأولى في الحضانة مع توليف مكتبة العازلة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق يعطل غشاء الخلايا وحيدة و "مقتطفات" الرسالة لتضخيم.
- تضخيم الخلايا واحد في جولتين ، وذلك باستخدام عدة اتجاهات من سيغما الدريخ في WTA2. تنفيذ الخطوة الإعدادية المكتبة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ، ثم يضاف 1 / 5 من العينة المكتبة إلى 70 ميكرولتر من التضخيم WTA2
الرئيسية ميكس. تضخيم هذه العينات لمدة 25 دورات باستخدام المعلمات الدراجات الموصى بها. - تنقية USI العيناتنانوغرام Qiagen لتنقية PCR QIAquick كيت (القط # 28104) وعملية على Qiacube Qiagen لاستخدام "تنظيف PCR التضخيم ردود الفعل QIAquick قياسي V4" البروتوكول.
- تركيز عينات المنقى إلى 5 ميكرولتر ، وذلك باستخدام فراغ السرعة ، وضعت من خلال الجولة الثانية من التضخيم لمدة 17 دورات (WTA2 بروتوكول التضخيم والمعلمات الدراجات متكررة).
- تنقية تنقية العينات باستخدام PCR QIAquick كيت وفحص الجودة باستخدام معمل NanoDrop واجيلنت في الحمض النووي عدة BioAnalyzer 7500 وفقا لبروتوكول الصانعين.
التوسيم وصالحة NimbleGen التعبير الجيني
- التسمية 2 ميكروغرام من تقطعت بهم السبل المزدوج [كدنا] من كل عينة باستخدام خلية تضخيم NimbleGen في لون واحد وصفها كيت (القط # 05223555001) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- هجن 5 ميكروغرام من Cy3 عينة المسمى إلى المصحف العضلة 12x135k ، صالحة NimbleGen التعبير الجيني (القط # 05543797001) ACCording لبروتوكول الشركة الصانعة. بعد التهجين من العينات لصفائف ، ينبغي الشرائح ثم غسلها وتجفيفها قبل أن يتم تصويرها على أنها ماسح ليزر.
- صالحة فحص الجينات باستخدام ماسح ليزر. هنا ، علينا استخدام أجهزة الماسح الجزيئي 4200A GenePix مع إعدادات 100POW ، و 300 350PMT. ثم تولد الملفات الزوج لكل مجموعة باستخدام البرمجيات NimbleGen في NimbleScan وتحليل في وقت لاحق للتعبير transcriptome كامل من كل مجموعة خلية واحدة (يتم تضمين جدول النصوص النموذجية cardiomyocyte أعرب ستابلي كمكمل ؛ S1 الجدول).
إذا نضح القلب يعمل بشكل جيد يجب أن يكون هناك نسبة عالية من الخلايا صحة القلب التي تحتفظ بها التشكل مستطيلة نموذجية على العزلة. إذا لم نضح المضي قدما بشكل جيد ثم سيكون هناك نسبة كبيرة من الخلايا الميتة (انظر الصور في الشكل 5). إذا تضخمت بشكل صحيح الخلايا باستخدام أساليب إما WTA2 أو STA - RT لن يجب أن تمر المنتجات النهائية اللاحقة اختبارات مراقبة الجودة لنوعية العينات التي NanoDrop مرنا وBioAnalyser (الشكل 6). لسير العمل ميكروأري ، بعد اكتمال هذا التضخيم التنس حيث يتم اختبار كل من NanoDrop مرنا وBioanalyzer. وتظهر النتائج الإيجابية لهذا التحليل ممثل في الشكل 6. يجب أن تظهر عينات WTA2 التضخيم قوية مع كل من القراءة معمل NanoDrop ، فضلا عن قراءات مخطط رحلاني من رقاقة (BA) Bioanalyzer (الشكل 6). يتم تضمين جدول من الجينات التي تم رصدها عبر ستابلي ميكروأري من الخلايا كمثال واحد (الجدول S1). لعملية qPCR ، يمكن تقييم جودة البيانات قبل تنفيذ خطوة تذوب في نهاية التفاعل PCR لضمان أن يتم تضخيم مجموعات التمهيدي المنتج المطلوب (الشكل 7). إذا كان ذلك صحيحا ، يجب أن تولد هذه الخطوة تذوب ذوبان قمة واحدة محددة. لتوضيح هذه النقطة ، يتم عرض مجموعة فرعية من nanofluidic qPCR البيانات في ذروة الذوبان heatmap رemperature (الشكل 8) 8. فمن الممكن لتقييم جودة المنتج بواسطة PCR درجة حرارته تذوب لضمان عدم وجود منتجات غير محددة 5. كل صف من هذه الخريطة تمثل عينة واحدة الخلية (S1 - S40) اختبرت في 43 المقايسات qPCR منفصلة (A1 - A43). في هذا الشكل ، فمن الواضح أن بعض المقايسات ومتغير جدا وربما تكون أقل موثوقية من المقايسات أكثر استقرارا مع خصوصية أعلى PCR.
الشكل 1. نظرة عامة على خلية واحدة بمعزل عن تحليل الجينات والتعبير. وسوف تثبت إجراء الاستئصال الجراحي للقلب فأر وعزل الخلايا العضلية الفردية. الأساليب التي نوقشت في هذا الإجراء وتشمل طرق إما qPCR أو تحليل ميكروأري بعد التضخيم transcriptome كله (WTA). الإجراء WTA يبدأ تحلل (A) ثم ربط الاشعال عالمية سيغما (B) إلى مرنابركة. تمديد هذه المشارع (C) والتضخيم المرحلة (D) إنشاء ميكروغرام من المواد تضخيمها. ثم يتكرر هذا التضخيم (E) لتوليد ما يكفي من المواد لإجراء ميكروأري.
الشكل 2. تمثيل موقع شقوق لإزالة القلب من الماوس. قطع على طول الجدار الوحشي من القفص الصدري (A) ، ثم قص على طول الهامش السفلي من القفص الصدري (B). قطع السفن فوق وتحت القلب تسمح لإزالة بينما تترك ما يكفي من الشريان الأورطي إلى يقني ؛ يدخل القنية القلب. صور مقتبسة من كوك MJ 6.
الشكل 3. مخطط للصدر من الفأرة. الخطوط المنقطة تشير إلى مواقع شقوق (A) لاستئصال القلب من تجويف الصدر دون الإضرار ح eart الأنسجة. صور مقتبسة من كوك MJ 6.
الشكل 4. صورة قوس الأبهر وفروعه. خط رمادي يشير إلى الموقع المثالي من حيث لخفض الأبهر (A). هو الشريان الأورطي مقنى المتبقية التي تعلق على القلب بحيث غيض من قنية (ب) ينتقل إلى المستوى المناسب داخل الشريان الأورطي (C). صور مقتبسة من غايار F. 7.
الشكل 5. اختيار واحد من الخلايا لتحليل التعبير الجيني. كل لوحة تظهر تصوير العضلية تحت المجهر ضوء عرض نموذجي مورفولوجيا الخلايا العضلية. يشار العضلية صحية من خلال الأسهم الخضراء. وتظهر الخلايا التي هي الميتة أو التي تحتضر مع السهام الحمراء. لا ينبغي أن تكون هذه الخلايا الميتة التي استخدمت في التحليل.
iles/ftp_upload/3302/3302fig6.jpg "بديل =" الشكل (6) "/>
الشكل 6. مراقبة الجودة النتائج WTA لتضخيم خلية واحدة. (أ) صورة من قراءات معمل NanoDrop غير مناسبة للنصوص تضخيمها من ردود فعل WTA. (ب) وقراءات من رقاقة BioAnalyzer يظهر نتائج من ثلاث خلايا تضخيمها.
الرقم 7 qPCR التضخيم. منحنيات (الرسم البياني الأيسر) وذروة الذوبان منحنيات درجة الحرارة (الرسم البياني على اليمين). (أ) أظهرت نتائج الفحص التعبير من الجودة مع ذروة ذوبان واحدة على الرغم من التضخيم منحنيات مختلفة. (ب) تذوب منحنيات لمجموعة التمهيدي الفقيرة ، والتي تذوب القمم شديدة التباين والتي ليست مثالية لتحليل التعبير.
الرقم 8. نتائج مراقبة الجودة للرد خلية واحدة qPCRالأيونات. وقد أنشئت هذه الخريطة الحرارة لعرض درجات الحرارة تذوب كما مقياس اللون. يظهر درجة حرارة انصهار الذروة لكل مقايسة qPCR (A1 - A43) لمدة 40 الخلايا الفردية (S1 - 40). وكانت عنقودية المقايسات وفقا درجة حرارتها تذوب. من خلال النظر إلى أسفل العمود لكل مقايسة فمن الممكن أن نرى الاختلاف عبر تذوب فى جميع العينات. هذا الرقم يدل على أن بعض المقايسات qPCR محددة للغاية في حين أن آخرين تختلف اختلافا كبيرا ، وبالتالي فهي لا تصلح لتحليل خلية واحدة.
S1 الجدول. الجدول التكميلي للبيانات ميكروأري. يتم سرد هذه الجينات وفقا للقوة التي يتم اكتشافها في العضلية واحدة عبر مجموعة البيانات الكبيرة. هذه القائمة الجين يدل على حساسية الكشف عن عدد من الجينات التي يتم التعبير عنها عادة في العضلية واحد.
Discussion
هذا الأسلوب لديه إمكانية لتوليد العضلية لعدد من وظيفية فضلا عن دراسات التعبير الجيني. فحص الخلايا واحدة هي منطقة مزدهرة في تحليل التعبير الجيني. في الاستفادة من فحص مستويات النسخي على مستوى الخلية واحد هو الذي يسمح للفحص من السكان الخلية نقية ، وهي ليست ممكنة من التحضيرات النسيج كله. بالإضافة إلى ذلك ، واحد خلية التحليل يسمح لدراسة تباين مستويات العشوائية مرنا في الخلايا الفردية لتعريف السكان الخلية التي كان يعتقد في السابق أن يكون 8،9 متجانسة. بالإضافة إلى تحديد الجينات التي يحتمل العشوائية في التعبير الجيني على 10،11،12 ، الأسلوب يسمح أيضا لتحديد هوية السكان الخلية نادرة تعرف من خلال ملفاتهم التعبير الجيني.
في حين أن هذا الأسلوب يوفر عددا من الاستخدامات المحتملة مثيرة في تحليل التعبير الجيني ، وهناك سومه المحاذير والاعتبارات في استخدام الخلايا واحدة. القيد الأولية لتحليل خلية واحدة ، هو جمع ما يكفي من الخلايا في التجربة لتحقيق دلالة إحصائية فيما يتعلق متري من الاهتمام ، على سبيل المثال الفرق. في الحالات التي يكون فيها عدد خلايا معزولة عن الأنسجة من الاهتمام ليس الحصر ، يمكن للمرء أن دراسة مئات من الخلايا لكل مجموعة ، وذلك باستخدام أساليب مثل الجيل المقبل من التسلسل ، أو صفائف nanofluidic. ومع ذلك ، في بعض الحالات ، قد تكون هناك صعوبة في الحصول على ما يكفي من الخلايا من الأنسجة من الاهتمام. يمكن أن يكون هذا في جزء منه بسبب الإجراءات وقت الفقهي مكثفة لجمع نوع من الخلايا المستهدفة. ومع ذلك ، قد التخطيط الدقيق والإعداد قبل الشروع في جمع خلية واحدة لا تزال تسمح لصرامة التحليل خلية واحدة مع خطأ تقني محدود. عند دراسة النتائج يجب النظر في ذلك ، وهذا حتى ولو تم استخدام هذا الإجراء لعزل الخلايا في العديد من studieق (بما في ذلك الفحص المجهري ، الكهربية ، الخ) ، يمكن عزل نفسها تأثير يحتمل التعبير الجيني. كما هو الحال مع أي الطريقة التي تعالج العينات البيولوجية ، ينبغي أن تكون النتائج التي توصلت الخاص التحقق بعناية من أجل ضمان التعبير خلية واحدة هو ممثل النسيج نفسه ، وليس التحيز التقنية. قد طرق مثل تهجين في الموضع الطبيعي أن تكون مفيدة للتحقق من هذه النتائج في أنسجة سليمة. أخيرا ، من الأهمية بمكان لضمان أن يتم التحقق بعناية البيانات التي تم إنشاؤها لمراقبة الجودة. البيانات التي تظهر في الشكل 8 يدل على أن المقايسات qPCR قد تكون قوية جدا في خصوصيتها ، مثل مقايسة # 13 (A13) أو لديهم مستوى عال من التباين الذي يمكن أن يؤدي إلى الفرق الفنية مثل مقايسة # 34 (A34).
Acknowledgments
فإن الكتاب أن نعترف المساعدة التقنية من Zambataro جيم أثناء تصوير هذا البروتوكول. نحن نعترف بامتنان بدعم من مؤسسة جلين للأبحاث الطبية (SM) ، ومؤسسة Hillblom ، والمعاهد الوطنية للصحة لمركز ناثان جائزة صدمة (P30AG025708) وPO1AG025901. كان مدعوما من قبل JMF T32AG000266 منحت لمعهد باك لبحوث الشيخوخة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71378 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 | |
| Pyruvic Acid | Sigma-Aldrich | P4562 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | 54457 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M1020 | |
| NaH2PO4 monobasic | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | G6721 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 72068 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | O3777 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21115 | |
| Protease, Type XIV | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| Collagenase, Type I | Worthington Biochemical | C9891 | |
| 1x DNA Suspension Buffer (10 mM Tris, pH 8.0, 0.1 mM EDTA) | TEKnova, Inc. | PN T0221 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | B8667 | |
| Sodium Pentobarbital | Henry Schein | Contact supplier for ordering | *must be procured through a Veterinarian or lab animal professional |
| ExoSAP IT | Affymetrix | 78201 | |
| CellsDirect 2x Rxn Mix | Invitrogen | 11737-030 | |
| SuperScript III RT Platinum Taq Mix | Invitrogen | 10928-042 | |
| RT-STA Primer Mix | IDT | Custom | |
| Nuclease Free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| WTA2 | Sigma-Aldrich | WTA2-50rxn | |
| Qiaquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Qiacube | Qiagen | 9001292 | |
| NanoDrop Spectrophotometer | NanoDrop | 2000c | |
| BioAnalyzer DNA 7500 kit | Agilent Technologies | 7500 kit | |
| One Color Labeling kit | Roche Group | 5223555001 | |
| Mus Musculus 12x135k array | Roche Group | 5543797001 | |
| GenePix 4200A Scanner | Molecular Devices | 4200A | |
| TransPlex Complete Whole Transcriptome Amplification Kit (WTA2 Kit) | Sigma-Aldrich | WTA2-50RXN |
References
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. Am. J. Physiol. 271 (3 Pt 2), H1250-H1255 (1996).
- Shioya, T. A simple technique for isolating healthy heart cells from mouse models. J. Physiol. Sci. 57 (6), 327-335 (2007).
- Guo, G., Huss, M., Tong, G. Q., Wang, C., Li Sun, L., Clarke, N. D., Robson, P. Resolution of cell fate decisions revealed by single-cell gene expression analysis from zygote to blastocyst. Dev. Cell. 18 (4), 675-685 (2010).
- Narsinh, K. H., Sun, N., Sanchez-Freire, V., Lee, A. S., Almeida, P., Hu, S., Jan, T., Wilson, K. D., Leong, D., Rosenberg, J., Yao, M., Robbins, R. C., Wu, J. C. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 121 (3), 1217-1221 (2011).
- D'haene, B., Vandesompele, J., Hellemans, J. Accurate and objective copy number profiling using real-time quantitative PCR. Methods. 50 (4), 262-270 (2010).
- Cook, M. J. The Anatomy of the Laboratory Mouse. Informatics. , Academic Press. (1965).
- Gaillard, F. Aorta. Radiopaedia. , (2008).
- Ståhlberg, A., Andersson, D., Aurelius, J., Faiz, M., Pekna, M., Kubista, M., Pekny, M. Defining cell populations with single-cell gene expression profiling: correlations and identification of astrocyte subpopulations. Nucleic Acids Res. 39 (4), e24-e24 (2011).
- Zhong, J. F., Chen, Y., Marcus, J. S., Scherer, A., Quake, S. R., Taylor, C. R., Weiner, L. P. A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells. Lab Chip. 8 (1), 68-74 (2008).
- Bahar, R., Hartmann, C. H., Rodriguez, K. A., Denny, A. D., Busuttil, R. A., Dollé, M. E., Calder, R. B., Chisholm, G. B., Pollock, B. H., Klein, C. A., Vijg, J. Increased cell-to-cell variation in gene expression in ageing mouse heart. Nature. 441 (7096), 1011-1014 (2006).
- Raj, A., van Oudenaarden, A. Nature, nurture, or chance: stochastic gene expression and its consequences. Cell. 135 (2), 216-226 (2008).
- Elowitz, M., Levine, A., Siggia, E., Swain, P. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
