Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Genome-wide screen for miRNA mål ved brug af MISSION Target ID Bibliotek

Published: April 6, 2012 doi: 10.3791/3303
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Sigma-Aldrich
* These authors contributed equally

Summary

Det Target ID Biblioteket er et plasmid-baseret, genom-dækkende samling af klonede cDNA bruges til at identificere miRNA mål. Her har vi vise sin brug og anvendelse.

Abstract

Det Target ID Bibliotek er designet til at hjælpe med opdagelse og identifikation af microRNA (miRNA) mål. Target ID bibliotek er et plasmid-baseret genom hele cDNA-bibliotek klonet ind i 3'-UTR nedstrøms fra dobbelt selektion fusionsprotein, thymidinkinase-zeocin (TKzeo). Den første runde af selektion er stabile transformanter, efterfulgt af indførelse af en miRNA af interesse, og endelig selektion for cDNA'er, der indeholder miRNA mål. Udvalgte cDNA identificeres ved sekventering (se figur 1-3 for Target ID Bibliotek Workflow og detaljer).

At sikre en bred dækning af det humane transkriptomet blev Target ID bibliotek cDNA'er genereres via oligo-dT primer med en pulje af totalt RNA fremstillet ud fra flere humane væv og cellelinier. Resulterende cDNA i området fra 0,5 til 4 kb, med en gennemsnitlig størrelse på 1,2 kb og blev klonet ind i p3TKzeo dobbelt selektion plasmidet (se figur 4 for plasmid kort). De genmål er repræsenteret i library kan findes på Sigma-Aldrich webside. Resultaterne fra Illumina sekventering (tabel 3) viser, at biblioteket omfatter 16.922 til 21,518 unikke generne i UCSC RefGene (79%) eller 14.000 gener med 10 eller flere læser (66%).

Protocol

1. Transfektion med Target ID Bibliotek og udvælgelse for stabile cellelinier

1. Zeocin Kill Curve

Zeocin anvendes til at selektere for stabilt transficerede celler. Imidlertid overskydende zeocin forårsager uønskede fænotypiske responser i de fleste celletyper. Derfor skal en kill kurve analyse udføres for at fastsætte den minimale lethale dosis.

  1. Pladen 1,6 x 10 4 celler i brønde på en 96-brønds plade i 120 pi medium.
  2. Den næste dag tilsættes zeocin i stigende koncentrationer i området fra 50 ug / ml til 1 mg / ml til passende brønde.
  3. Undersøge levedygtigheden hver 2. dag.
  4. Erstatte medier indeholdende zeocin hver 3. dag. Den minimale koncentration af selektionsreagens som forårsager fuldstændig celledød efter det ønskede tidspunkt bør anvendes for denne celletype og eksperiment. Vore resultater viser, at 500 pg / ml zeocin er optimal for A549, HeLa og MCF7-celler.

2.Bibliotek Transfektion via Nucleofection og Selection

  1. Vælg en cellelinie, der enten ikke udtrykker eller giver udtryk for lave niveauer af din miRNA af interesse. Den miRNA vil blive introduceret i afsnit B for målet udvælgelse efter stabil ekspression af Target ID Library opnås.
  2. Kultur / udvide celler. Vi har opnået gode resultater med 2 x 10 7 celler pr bibliotek transfektion.
  3. Trypsinisér cellerne, som er i> 80% konfluens, og overføre 2 x 10 7 celler til et 15 ml sterilt skrue foroven rør.
  4. Pelleten trypsiniserede celler ved 200 xg i 5 min.
  5. Fjerne medium og vask cellepellet med HBSS eller 1X PBS.
  6. Centrifuger ved 200 xg i 5 minutter og aspirere vask.
  7. Gentage vasketrinet i cellepellet.
  8. Præ-varme 6-brønds plader med 2 ml komplet medium ved 37 ° C.
  9. Tilsæt 2 ug af Target ID Bibliotek (ikke at overstige 10 pl) per 0,5 ml rør for hver transfektion.
  10. Resuspender celler i 15 ml rør fra oven med 100 ul Amaxa Nucleofection opløsning (cellespecifik) pr 2 x 10 6 celler. For eksempel tilsættes til 10 Nucleofections 1 ml af reagens.
  11. En reaktion på et tidspunkt, der tilsættes 100 ul celler til 2 pg af plasmidet. Blandes med pipette.
  12. Overfører blandingen til en Nucleofector kuvette.
  13. Indsætte kuvette i Nucleofector instrument og køre optimeret program egnet til cellelinie (High Efficiency foretrækkes frem Cellelevedygtighed).
  14. Fylde overførsel pipette med forvarmet medium. Fylder celler i samme pipette og overføres til 6-brønds plade. Gentag for hver Nucleofection, en per brønd.
  15. Retur til vækst kammer til inkubering natten over.
  16. Den næste dag erstattes mediet og tillader celler at genvinde i 3-5 dage.
  17. Erstatte mediet med komplet medium indeholdende den passende grad af zeocin, som bestemt ud fra dræbe kurveanalyse.
  18. Monitor celler til zeocin selektion (celler dør).
  19. Udskift medium med zeocin hver 2-3 dage.
  20. Når sammenflydende i 6-brønds plade, passage, pool og udvide celler i større kolber.
  21. Længden af ​​tid til ekspansion af celler er bruger-og cellelinie afhængig, men det anbefales stærkt at udvide zeocin resistente celler til at generere kryo-bestande til fremtidig screening (ca. 2-3 uger; cellelinie afhængig).

2. Transficering Bibliotek Celler med miRNA-ekspressionskonstruktion, Vælg for stabil cellelinie, og Vælg miRNA Mål

Bemærk: Zeocin valg ikke længere er nødvendig eller ønsket. Eksponering af celler til zeocin under miRNA udtryk og ganciclovir (mål) valg kan resultere i tab af miRNA mål.

3. Puromycin, G418, og ganciclovir Kill Kurver

  1. Udfør en kill kurve for ganciclovir med celler stabilt udtrykker Target ID Bibliotek og med puromycin eller G418 for vildtypeceller.
  2. Pladen 1,6 x 10 4 celler i brønde på en 96-brønds plade med 120 ul frisk medium. Den næste dag tilsættes 0,1 til 10 ug / ml puromycin/G418 eller 2 til 32 uM ganciclovir til udvalgte brønde.
  3. Undersøge levedygtigheden hver 2. dag. Erstatte mediet indeholdende selektionsreagens hver 3. dag. Den minimale koncentration af selektionsreagens som forårsager fuldstændig celledød * efter den ønskede tid, bør anvendes til denne celletype og eksperiment. Vore resultater viser, at 0,25 til 1 ug / ml puromycin er optimal for A549, HeLa og MCF7-celler og 0,3 ug / ml G418 for MCF7-celler og 8-16 uM ganciclovir er optimale for A549-, HeLa-og MCF7-celler.

    * Bemærk: Med ganciclovir valg, kan langsom eller ingen cellevækst observeres uden fuldstændig celledød. Overhold celler over flere dages behandling for at kontrollere de ikke aktivt deler. Hvis dette er tilfældet, så phenolrødt i mediet forbliver rødt. Det kan også være nødvendigt at udføre en Kill kurveanalyse af målet ID biblioteket transficerede celler, hvis en ændring i modtagelighed observeres. Dette vil imidlertid nødvendigt at bestemme på en celletype bestemt grundlag.

4. miRNA Transfektion via Nucleofection og Target Selection

  1. Vokser / ekspandere Id Library celler for at opnå 2 x 10 7 celler, og Trypsinisér når cellerne er på> 80% konfluens.
  2. Overføring 2 x 10 7 celler til et 15 ml sterilt skrue toppet rør og pelleten ved 200 xg i 5 minutter.
  3. Fjerne medium og vask cellepellet med HBSS eller 1X PBS.
  4. Centrifuger ved 200 xg i 5 minutter og aspirere vask.
  5. Gentage vasketrinet i cellepellet.
  6. Præ-varme 6-brønds plader med 2 ml komplet medium per brønd ved 37 ° C.
  7. Tilsættes 2 ug miRNA ekspressionsplasmid (ikke overstiger 10 pi) per 0,5 ml rør for hver transfektion. Origene MicroRNA ekspressionsplasmider (Neomycin - G418 selektion) eller selv-klonede miRNA gener i pBABE-puro (Plasmid 1764; Addgene) er blevet anvendt med held. For sidstnævntes vedkommende blev miRNA hårnål med ~ 200 bp på hver side PCR klonet fra humant DNA.
  8. Resuspender celler i 15 ml rør fra oven med 100 ul Amaxa Nucleofection opløsning (cellespecifik) pr 2 x 10 6 celler. For eksempel: For 10 Nucleofections, tilsættes 1 ml af reagens.
  9. En reaktion på et tidspunkt, der tilsættes 100 ul celler til 2 pg af plasmidet. Blandes med pipette.
  10. Overfører blandingen til en Nucleofector kuvette.
  11. Indsætte kuvette i Nucleofector instrument og køre optimeret program egnet til cellelinie (High efficiency foretrækkes frem cellelevedygtighed).
  12. Fylde overførsel pipette med forvarmet medium. Fylder celler i samme pipette og overføres til 6-brønds plade. Gentag for hver Nucleofection, en per brønd.
  13. Retur til vækst kammer til inkubering natten over.
    14. <li> Erstat medium og tillade celler at inddrive i 3-5 dage.
  14. Erstatte mediet med komplet medium indeholdende den passende niveau af puromycin eller G418 som bestemt ud fra kill kurven testen udført før transfektion med miRNA konstruktionen.
  15. Overvåge celler til puromycin / G418-selektion (celler dør).
  16. Udskift medium med puromycin / G418 hver 2-3 dage.
  17. Når sammenflydende i 6-brønds plade, passage, pool og udvide celler i større kolber.
  18. Længden af ​​tid til ekspansion af celler er brugerens afhængig, men det anbefales stærkt at udvide puromycin / G418 resistente celler til at generere kryo-bestande til fremtidig screening (ca. 2-3 uger; cellelinie afhængig).
  19. Erstatte mediet med passende niveauer af ganciclovir (GCV) og puromycin / G418, som bestemt fra kill kurven testen udført før transfektion med miRNA konstruktionen.
  20. Overvåg celler for udvælgelse (celler dying, miRNA målretning og knockdown af TK-Zeo).
  21. Ekspandere cellerne i nærvær af GCV og puromycin / G418.
  22. Forberede Genomisk DNA fra GCV valgte celler.
  23. PCR amplificere skær med kittet primere (se PCR-amplifikation).
  24. Klon i TOPOTA vektoren (Invitrogen) for standard sekventering eller sende PCR-produktet til dyb sekventering.

3. PCR-amplificere udvalgte bibliotekselementer Inserts og Sequence

Bemærk: Denne procedure er udført for at PCR-amplificere biblioteket mål, har overlevet ganciclovir valg.

5. Opsamle ganciclovir udvalgte celler til fremstilling af kromosomalt DNA under anvendelse af en GenElute Mammalian Genomisk DNA Miniprep Kit (katalognummer G1N10) eller tilsvarende. Vi anbefaler fremstilling af DNA fra den oprindelige cellelinie, der ikke indeholder mål ID bibliotek til anvendelse som en negativ kontrol til sammenligning med DNA fra target-udvalgte celler i PCR.

  1. PCR-Amplify det genomiske DNA med amplifikationsprimer 1 og amplifikationsprimer 2. Vellykket forstærkning er opnået med JumpStart REDTaq ReadyMix Reaction Mix - til PCR (katalognummer P0982). Optimering af betingelserne, kan være nødvendig, hvis et andet polymerase anvendes. Se tabel 1 for en prøve PCR opsætning og tabel 2 for PCR-cyklisternes forhold.
  2. Løse 2-5 ul PCR-produktet på en 1% agarosegel. Den forventede Produktet skal være en smøre med nogle synlige DNA banding. Sammenlignet med kontrol PCR-produkt af genomisk DNA fra celler uden Target ID biblioteket.
  3. Fortsæt med kloning og / eller dyb sekventering af PCR-produkt. Hvis der ikke amplifikationsprodukt iagttages eller er identisk med kontrol-DNA, optimere PCR amplifikationsprodukterne betingelser (dvs. primerkoncentration, annealingstemperatur, og cyklusser).

6. Kloning og sekventering

Bemærk: Vi anbefaler kloning af PCR-produktets og derefter udføre standard-sekventering fra mindst 96 af klonerne ved hjælp af amplifikationsprimerne tilvejebragt i kittet. Denne fremgangsmåde er blevet udført med succes ved anvendelse af 96-brønds overnatskulturer og plasmidoprensning systemer. Selv om dyb sekventering ønskes, kan de foreløbige resultater fra kloning og standard sekventering anvendes som en kvalitetskontrol at bestemme, om den ekstra udgift til dyb sekventering er påkrævet.

  1. Følge TA kloning kittet producentens protokol til kloning af PCR-amplifikationsprodukter (ovenfor).
  2. Omdanne kloner ind i kompetente bakterieceller og vælge natten over på antibiotisk medium.
  3. Isolere og vokse individuelle kolonier i flydende kultur indeholdende passende antibiotika.
  4. Oprense plasmid-DNA. 6,5. Udføre sekventeringsreaktioner med amplifikationsprimere.
  5. Identificer genmål ved BLAST tilpasning af sekvenser med human transkriptomet (for kendte udskrifter) og menneskelige genom (for nye transcripts). *

* Kloning fejlfinding: Hvis et stort antal af indlæg fra sekventering er plasmidsekvens, optimere kloning / sekventering betingelser som sådan:

  • PCR-amplifikation produkt (indsæt) kvalitet og kvantitet
  • Ligeringsreaktion
  • Plasmid forberedelse (kvalitet og kvantitet)
  • Sekventering reaktionsbetingelser

4. Repræsentative resultater

Bibliotek skærm for miR-373 mål
For at evaluere udførelsen af ​​missionen Target ID Bibliotek, blev miR-373 mål udvalgt fra MCF-7 Bibliotek udtrykker celler. MCF-7 blev valgt, fordi den udtrykker lidt eller intet påviseligt miR-373 (data ikke vist). miR-373 blev valgt for sin biologisk interesse. miR-373 ekspression fremmer tumorinvasion og metastase i MCF-7, sædvanligvis et ikke-metastatisk cellelinie [2]. Endvidere, MIR-373 orthologues fra muse miR-290 klynge er involveret i muse embryonale stamcellercelle vedligeholdelse [3], og miR-373 familiemedlem, miR-372, fremmer fibroblast omprogrammering at inducerede pluripotente stamceller [4]. Endelig har vi anvendt zinkfinger nukleaser for at indsætte en PGK-promotor-miR-373 ekspressionskonstruktion i AAVS1 stedet i MCF-7 celler, og der genereres en liste over potentielle miR-373 mål ved RNA microarray analyse (data ikke vist).

Target ID Biblioteket blev transficeret i MCF-7 celler, og en stabil population af celler blev udvalgt og amplificeret i zeocin-holdigt medium. De resulterende celler (MCF-7-bibliotek) blev stabilt transficeret med en miR-373 udtrykker konstruktionen og udvælges i ganciclovir-holdigt medium til berigelse for celler, der udtrykker miR-373 mål. Vi observerede, at den negative kontrol MCF-7 Bibliotek celler (uden miR-373) ikke løsnes og bliver afrundet som forventet for døde celler. Men de gjorde op med at vokse, som blev let opdaget, fordi phenolrød-holdigt medium ikke bliver orange-gul som observeret foR-celler, der udtrykker miR-373 (figur 5). Cellerne blev ekspanderet i ganciclovir-holdigt medium og målsekvenser blev isoleret ved PCR med primere, der flankerer mål ID Library cDNA-inserter og DNA fremstillet ud fra de overlevende celler. PCR-produkterne blev Illumina sekventeret.

Som vist i tabel 4, har vi opnået 17.740.719 cDNA læst, som kortlagt til 11.076 unikke gener. Af disse unikke gener, blev 2.898 fundet med mere end 40 hits, og derfor blev anset for pålidelige hits. Den 13.106.469 Vektoren læser blev forventet, fordi PCR primerne anvendt til at amplificere cDNA-inserter er 40 og 300 baser væk fra insertionsstedet. Som sådan, forventes det, at de fleste resulterende sekvenser vil være fra vektoren modsætning mere traditionelle dyb sekventering af genomisk materiale. Fjorten procent ikke knyttes til enten vektor eller cDNA, men har på linie med NCBI ikke-redundante nucleotid database (dvs. med NR hit), og kun 1% havde ingen cDNA-insert.

En indledende sammenligning fandt, at 10 af de unikke gener identificeret med Target ID Library er også på listen over tidligere identificerede miR-373 mål i TarBase (tabel 5). Disse 10 miR-373 mål blev tidligere identificeret ved mikroarray med RNA fra HeLa-celler transient transficeret med et syntetisk miR-373 efterligne [5]. Endvidere har vi konstateret de samme 10 gener nedreguleret i MCF-7 celler, der udtrykker miR-373 fra AAVS1 stedet (data ikke vist). Derfor er disse 10 er sandsynlige gyldige mål for miR-373. Arbejdet er i gang at karakterisere listen over potentielle mål og forsøger at validere udvalgte hits eksperimentelt ved hjælp af RT-qPCR, Western blot, og luciferase reporter assay.

Figur 1
Figur 1. Arbejdsgang for Target ID Bibliotek. Sektioner AC: Der henvises til afsnit i proceduren. Hvert trin er illustreret og beskrevet i detaljer i 3.

Figur 2
Figur 2. Transfektion og Zeocin udvælgelse. Target ID bibliotek er en samling af plasmider (A), hvert med et humant cDNA indsat i 3'-UTR efter thymidinkinase-zeocin-fusionsprotein (TKzeo; figur 4). Celler transficeret med Target ID Library (B) og lodes komme sig i 3-5 dage. Konstruktionerne kan integrere ind i genomet i denne hvileperiode (C), og udtrykke det kodede transkript (D). Efter udvinding celler udsat for zeocin (E). Celler, der udtrykker TKzeo fusionsproteinet fra stabilt integrerede Id konstrukter overlever zeocin selektion (F). Utransficerede celler dør (G). Endvidere, der indeholder celler, en konstruktion, der er et mål for en endogen miRNA eller på andenis faktor udtrykkes i cellen, der inhiberer ekspression af TKzeo fra Target ID konstruktionen vil dø (H).

Figur 3
Figur 3. MiRNA transfektion og ganciclovir selektion. Celler indeholdende mål ID bibliotek (dvs. zeocin-udvalgte celler) transficeret med et selekterbart microRNA ekspressionskonstruktion (A). Under restitution kan miRNA ekspressionskonstruktionen integrere (B) og udtrykker den selekterbare markør er kodet på miRNA konstruktionen. Efter selektion for stabil integration (C) og celleekspansion er celler behandlet med ganciclovir (D). Celler, der producerer thymidinkinase (TK) i nærvær af ganciclovir (dvs. celler, der udtrykker TKzeo konstruktioner ikke målrettet i miRNA) vil dø (E) på den anden side, celler indeholdende Bibliotek konstruktioner med miRNA target s ITES vil ikke frembringe TK, og derfor vil overleve ganciclovir selektion (F). Overlevende celler kan dyrkes, gDNA isoleret, og cDNA indeholdende miRNA målsteder PCR-amplificeret under anvendelse af Id amplifikationsprimere. PCR-produkter kan sekventeres, og på linie med det humane genom til identifikation miRNA mål.

Figur 4
Figur 4. Plasmid kort og placering af amplifikationsprimere. Sfil er steder for cDNA-kloning.

Primersekvenser

MISSION Target ID Amplification Primer 1

5 ACGACGTGACCCTGTTCATC 3

MISSION Target ID Amplification Primer 2

5 TAAAACGACGGCCAGTGAAT 3

ig5.jpg "alt =" Figur 5 "/>
Figur 5. Ganciclovir virkning på cellevækst. Fireogtyve brøndsplader blev podet med 2 til 100.000 MCF-7 celler eller MCF-7 celler, der indeholdt mål ID biblioteket. Fireogtyve timer senere blev mediet erstattet med medium indeholdende 0, 8 eller 16 uM ganciclovir. Efter 15 dage blev pladen fotograferet (6 øvre brønde), hvorefter brøndene blev vasket med HBSS og farvet med Brilliant Blue R farvningsopløsning (B6529) (6 nedre brønde). Bemærk, at ganciclovir har nogen virkning på MCF-7 celler uden bibliotek, fordi de ikke udtrykker thymidinkinase (TK). På den anden side gør MCF-7 Bibliotek celler udtrykker TK men er ikke fuldstændigt dræbt af ganciclovir på 8 eller 16 uM, som vist ved de levende celler, der optager Brillinat Blue. Imidlertid har de bibliotek cellerne op med at vokse i ganciclovir, som det fremgår af farven af ​​phenolrødt farvestoffet i deres medium. De stoppede celler ikke syrne deres medium, og farven forbliver rødlige stedet for at ændre ellerange-gul.

Reagens Volumen / Reaction
Jumpstart REDTaq ReadyMix reaktionsblanding 10 ul
Amplifikationsprimer 1 (25 uM) 0,2 gl
Amplifikationsprimer 2 (25 uM) 0,2 gl
Genomisk DNA 50-200 ng
Vand, Molekylær Grade 20 pi

Tabel 1.

Trin Temp. Tid Cycles
Indledende denatureringstrin 95 ° C 5 min. 1
Denaturering 95 ° C 30 sek. pan = "3"> 40 cykler
Annealing * 62 ° C 30 sek.
Udvidelse 68 ° C 2 min.
Final Extension 68 ° C 5 min. 1
Hold 4 ° C Hold

Tabel 2 nedenfor.

* Udglødningstemperaturer kan variere, men vi har observeret de bedste amplifikationsprodukterne med annealingstemperaturer på mellem 53 og 64 ° C.

Tabel 3

Tabel 3. Target ID Library indhold af Illumina sekventering.

Tabel 4

Tabel 4. MiR-373 udvalgte mål ved Illumina sekventering.

les/ftp_upload/3303/3303table5.jpg "alt =" Tabel 5 "/>

Tabel 5. 10 mål tidligere identificeret af RNA mikroarray.

Discussion

microRNA'er er 20-24 nucleotid RNA'er, som regulerer genekspression efter transskriptionelt ved inhibering mRNA translation, og ofte destabilisere målrettet mRNA (gennemgået i [6]). En enkelt miRNA kan regulere flere hundrede mRNA'er til at styre en celles respons på udviklingsmæssige og miljømæssige signaler. Identifikation og validering af target mRNA er afgørende ved fastsættelsen af ​​en miRNA rolle og funktion i disse veje. Imidlertid målet identifikation er ikke ligetil, fordi, i dyr, miRNA og deres målsteder er ikke fuldt komplementær. "Seed" region, baseret 2 til 7 fra 5'-enden af ​​miRNA, sædvanligvis komplementær til dens mål. Men der er mange undtagelser fra frøet reglen, og nedstrøms base-parring kan kompensere for et ufuldkomment frø match. En række af edb-algoritmer er blevet udviklet til at forudsige miRNA mål baseret på frø matchning og nedstrøms kompensation, målstrukturen end position, sekvensbevarelse, og forskellige andre parametre, der er blevet observeret for eksperimentelt validerede targets (revideret i [7]). Mens in silico forudsigelser er bekvemme og gøre identificere mange gyldige miRNA mål, de fleste forudsagde gener ikke eksperimentelle valideringstest, og mange egentlige mål ikke forudsiges. Da computeralgoritmer er baseret på tidligere bestemte mål træk, at de ikke tillader opdagelse af mål, der afviger fra, hvad der allerede er kendt.

Et antal eksperimentelle systemer er blevet anvendt med succes til at identificere eller opdage funktionelle miRNA mål i levende celler. Disse globale screeningsmetoder indbefatter mikroarrays og RNA-sekventering, RNA co-immunopræcipitation (RIP), og stabile isotop mærkning med Aminosyrer i cellekultur (SILAC), en proteomik metode (gennemgået i [7]). Hver metode har fordele og ulemper. Idet miRNA målretning ofte destabiliserer en mRNA og fører til nedbrydning, tab or gevinst i mRNA niveau efter at indføre en miRNA efterligne eller hæmmer, henholdsvis kan identificere miRNA mål. Dette tab eller forøgelse af mRNA let detekteres ved mikroarray eller dyb-sekventering. Mens mRNA detektionsmetoder er enklere og mere følsomme end protein påvisningsmetoder, vil mRNA detektion glip af miRNA mål, der ikke nedbrydes. Nylige rapporter fra Bartell laboratoriet sammenligne miRNA target resultater fra RNA detektion med dem fra SILAC [8] eller ribosom profilering [9] viser, at pattedyr miRNA overvejende virker ved at reducere target mRNA niveauer. Dog har mange andre laboratorier, der arbejder med de enkelte miRNA mål opdaget ændring i protein, men ingen ændring i mRNA niveau. Rapporter om, hvad der synes at være translationel regulering uden påviselig mRNA tab omfatter: miR-10b på HOXD10 [10], miR221/222 på p27kip1 [11], miR-21 på Pdcd4 [12], miR-126 på p85β [13] , miR-34 på SIRT1 [14], miR-21 på PTEN [15], miR-302d på Arid4b [16], miR-200c på JAG1 [17], og miR-299, 297, 567, ennd 609 på VEGFA [18]. Endvidere Clancy et al [19] nylig rapporteret, at translationel regulering af let-7 blev kun detekteres, når de individuelle mRNA isoformer, der indeholder let-7 målstedet blev detekteret selektivt. Sidstnævnte antyder, at i det mindste i nogle tilfælde kan translationel regulering overses i et sammensat profil - dvs når alle mRNA isoformer detekteres som en mRNA - som opnået med mange microarray og sekvensanalyser. Co-immunpræcipitering af miRNA-mRNA komplekser via argonaute (normalt ago2) eller et andet associeret protein (RNA immunfældning, eller UP) vil isolere miRNA mål uanset reguleringsmekanisme. Desuden detekterer RIP endogene, og formodentlig biologisk relevant, interaktioner. Imidlertid vides det ikke, om alle miRNA-mRNA interaktioner er funktionelle, og RIP vil springe nogen mRNA mål at associere kun forbigående eller hurtigt nedbrydes. Derudover skal specifikke miRNA-mRNA partnere udledes bioinformatitisk, fordi alle miRNA-mRNA par co-udfældet sammen. Endelig SILAC direkte identificerer slutproduktet miRNA regulering proteinet selv, men er ufølsom og derfor savner sjældne proteiner og små fold ændringer i protein-niveauer.

I lyset af de begrænsninger med nuværende miRNA-target identifikationsmetoder, følte vi en yderligere global analyse for at identificere funktionelle miRNA mål ved en alternativ mekanisme var nødvendigt. For at opfylde dette behov, har vi licens en teknologi opfundet af Joop Gaken og Azim Mohamedali af Kings College i London. Deres opfindelse er en dobbelt selektion fusionsprotein, specifikt en thymidinkinase-zeocin fusion reguleres af et cDNA-bibliotek af potentielle miRNA målsekvenser i sin 3'-UTR. Celler stabilt transfekteret med og udtrykkende TKzeo-cDNA-konstruktioner kan vælges med zeocin, som illustreret i figur 2. Efter udtryk for en miRNA af interesse, kan der miRNA målsætninger vælges with ganciclovir, som illustreret i fig 3. Ganciclovir dræber celler, der udtrykker thymidinkinase, der er eventuelle celler, der udtrykker TKzeo-cDNA mangler et mål for miRNA af interesse. Målrettet cDNA kan isoleres ved PCR-amplifikation af DNA fra celler, som overlever ganciclovir anvendelse af primere, som flankerer cDNA og PCR-produkter kan sekventeres for at identificere mål.

Vi har udviklet Kings College teknologi i et nyt værktøj for global identifikation og opdagelsen af ​​funktionelle menneskelige miRNA mål - MISSION Target ID Bibliotek. Med det mål ID biblioteket, kan brugerne isolere miRNA mål ved en serie af pattedyrcellekultur transfektion og lægemiddelselektion trin. Biblioteket er omfattende, og indeholder 66-79% af menneskelige gener. De første resultater tyder på, at både tidligere opdaget, samt nye mål kan isoleres fra MISSION Target ID Bibliotek.

Selv om protokollen er af en vis længde,anvendelse af mål-ID biblioteket kræver standard molekylær laboratorieteknikker - pattedyrcellekultur, transfektion, lægemiddelselektion, PCR og sekventering - og derfor bør være inden for midler til de fleste biologer. Vi foreslår, at tilstrækkelig opmærksomhed rettes mod passende eksperimentelt design, optimering af dyrkningsbetingelser, og vigtigst af alt, præ-teste hver ny celletype til at bestemme optimale medicinindhold for udvælgelse trin (kill-kurver) for at sikre succes med Target ID Bibliotek.

Som med alle miRNA target identifikationsmetoder, anbefales det kraftigt, at mål identificeret ved screening af Target ID biblioteket skal valideres med en anden fremgangsmåde, såsom mikroarray, QRT-PCR, reporter-assay (dvs. luciferase), eller Western-analyse.

Disclosures

Forfatterne erklærer finansielle forbindelser med kommercielle foretagender, der har en interesse i det indsendte arbejde.

Acknowledgments

Vi takker hele Sigma Life Science Mission Target ID Bibliotek udviklingsteam, især Kevin Gutshall for at finde den teknologi og forhandle licensbetingelserne, og Heather Holemon for hendes støtte og deltagelse i frugtbare fejlfinding diskussioner. Vi takker også Dr. Joop Gäken af ​​Kings College i London for fri deling af upublicerede resultater og forslag, og Qazi Hamid i RxBiosciences for at forberede en stor portion af cDNA og hans vedholdenhed i at få det klonet. Vi vil gerne anerkende Nan Lin og Scott Bahr fra SAFC til at udføre cDNA arrays og dataanalyse.

Mission er et registreret varemærke tilhørende Sigma-Aldrich Bioteknologi LP

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JumpStart REDTaq ReadyMix Sigma-Aldrich P0982
Ganciclovir Sigma-Aldrich G2536
G418 Sigma-Aldrich G8168
Puromycin Sigma-Aldrich P9620
Topo TA Invitrogen KNM4500-01
GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit Sigma-Aldrich G1N10
Cell Specific Nucleofection kit Lonza Inc.
Nucleofector Lonza Inc. AAD-1001
Zeocin Invitrogen R250-01
Target ID Library Sigma-Aldrich MREH01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Target ID Library Technical Bulletin, Catalog # MREH01. [Internet]. , Sigma Aldrich. St Louis. Available from: http://www.sigma-aldrich.com (2012).
  2. Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis. Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).
  3. Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells. Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).
  4. Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).
  5. Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).
  6. Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).
  7. Thomas, M. Desperately seeking microRNA targets. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).
  8. Baek, D. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).
  9. Guo, H. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).
  10. Ma, L. Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer. Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).
  11. Visone, R., et al. MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle. Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).
  12. Lu, Z., et al. MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene. Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).
  13. Guo, C., et al. The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers. Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).
  14. Yamakuchi, M., et al. miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).
  15. Wickramasinghe, N. S., et al. Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells. Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 Forthcoming.
  16. Ciaudo, C., et al. Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation. PLoS Genetics. 5, e1000620 (2009).
  17. Vallejo, D. M., et al. Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells. EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).
  18. Jafarifar, F., et al. Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP. L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).
  19. Clancy, J. L., et al. mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation. RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).

Tags

Genetik Target ID miRNA ncRNA RNAi genomforskning
Genome-wide screen for miRNA mål ved brug af MISSION Target ID Bibliotek
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Coussens, M. J., Forbes, K.,… More

Coussens, M. J., Forbes, K., Kreader, C., Sago, J., Cupp, C., Swarthout, J. Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library. J. Vis. Exp. (62), e3303, doi:10.3791/3303 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter