Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Genoom-brede scherm voor miRNA Doelen Met behulp van de MISSION Target ID Bibliotheek

Published: April 6, 2012 doi: 10.3791/3303
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Sigma-Aldrich
* These authors contributed equally

Summary

De Target ID Library is een plasmide-gebaseerd, genoom-brede collectie van gekloneerde cDNA gebruikt om miRNA targets te identificeren. Hier laten we zien het gebruik en de toepassing.

Abstract

De Target ID bibliotheek is ontworpen om te helpen bij ontdekking en identificatie van microRNA (miRNA) doelstellingen. De Target ID Library is een plasmide-gebaseerde, genoom-brede cDNA-bibliotheek gekloneerd in de 3'UTR stroomafwaarts van de dual-selectie fusie-eiwit, thymidinekinase-zeocine (TKzeo). De eerste ronde van selectie is voor een stabiele transformanten, gevolgd met de introductie van een miRNA van belang, en ten slotte, het selecteren van cDNA's met de miRNA's doel. Geselecteerde cDNA's worden geïdentificeerd door sequencing (zie Figuur 1-3 voor Target ID Bibliotheek Workflow en details).

Om brede dekking van het menselijk transcriptoom te garanderen, werden Target ID Bibliotheek cDNA's gegenereerd via oligo-dT priming het gebruik van een pool van totaal RNA bereid uit meerdere menselijke weefsels en cellijnen. Resulterende cDNA van 0,5 tot 4 kb, met een gemiddelde grootte van 1,2 kb en werden gekloneerd in de p3TKzeo dubbele selectie plasmide (zie figuur 4 voor plasmide kaart). Het gen doelen weergegeven in de litheek is te vinden op de Sigma-Aldrich webpagina. Resultaten van Illumina sequentie (tabel 3) blijkt dat de bibliotheek 16922 van 21.518 unieke genen in UCSC RefGene (79%) of 14.000 genen met 10 of meer staat (66%) omvat.

Protocol

1. Transfectie met Target ID Bibliotheek en selectie voor stabiele cellijnen

1. Zeocine Kill Curve

Zeocine wordt gebruikt voor het selecteren stabiel getransfecteerde cellen. Echter, teveel zeocine zorgt ervoor dat ongewenste fenotypische responsen in de meeste celtypen. Daarom moet een kill-curve analyse worden uitgevoerd om de minimale letale dosis vast te stellen.

  1. Plaat 1,6 x 10 4 cellen in putten van een 96-wells plaat in 120 ul van de media.
  2. De volgende dag toe zeocine in toenemende concentraties van 50 ug / ml tot 1 mg / ml aan de geschikte putjes.
  3. Onderzoek haalbaarheid om de 2 dagen.
  4. Vervang de media met zeocine om de 3 dagen. De minimale concentratie van selectie reagens dat volledige celdood veroorzaakt na de gewenste tijd worden gebruikt dat celtype en experiment. Onze resultaten tonen dat 500 ug / ml zeocine optimum voor A549, HeLa en MCF7 cellen.

2.Bibliotheek Transfectie via Nucleofectie en Selectie

  1. Selecteer een cellijn die ofwel niet uiten of drukt een laag niveau van uw miRNA van belang. De miRNA zal worden ingevoerd in deel B voor de doelgroep selectie na stabiele expressie van de Target ID Bibliotheek wordt bereikt.
  2. Cultuur / uit te breiden cellen. Wij hebben uitstekende resultaten met 2 x 10 7 cellen per bibliotheek transfectie.
  3. Trypsinize cellen die bij> 80% confluentie en overdragen 2 x 10 7 cellen die 15 ml steriele schroef bovenkant buizen.
  4. Pellet getrypsiniseerd cellen bij 200 g gedurende 5 minuten.
  5. Verwijder medium en was celpellet met HBSS of 1X PBS.
  6. Centrifugeer op 200 xg gedurende 5 min en zuig wassen.
  7. Herhaal wassen stap van celpellet.
  8. Voorverwarmen 6-wells platen met 2 ml compleet medium bij 37 ° C.
  9. Voeg 2 ug Target ID Library (niet 10 pi dan) per 0,5 ml buis voor elke transfectie.
  10. Hersuspenderen cellen in de buis van 15 ml van bovenaf met 100 ul Amaxa Nucleofectie oplossing (celspecifieke) per 2 x 10 6 cellen. Voeg bijvoorbeeld 10 Nucleofections 1 ml reagens.
  11. Een reactie tegelijk worden 100 pi cellen de 2 ug plasmide. Meng met pipet.
  12. Breng het mengsel aan een Nucleofector cuvette.
  13. Plaats de cuvet in Nucleofector instrument en uit te voeren geoptimaliseerde programma geschikt is voor de cellijn (High Efficiency voorkeur boven levensvatbaarheid van de cellen).
  14. Vul transferpipet met voorverwarmd medium. Neem cellen in dezelfde pipet overgebracht in 6-wells plaat. Herhaal dit voor elk Nucleofectie, een per goed.
  15. Keer terug naar groei kamer voor een nacht incubatie.
  16. De volgende dag, vervang dan medium en laat cellen te herstellen gedurende 3-5 dagen.
  17. Vervang medium met compleet medium dat het juiste niveau van zeocine, zoals bepaald door de kill-curve analyse.
  18. Monitor cellen voor zeocine selectie (afsterven).
  19. Vervang medium met zeocine om de 2-3 dagen.
  20. Eenmaal confluente in 6-wells plaat, passage, zwembad en uitbreiding van cellen in grotere flessen.
  21. Lengte van tijd voor uitbreiding van de cellen is gebruiker en cellijn afhankelijk, maar het is ten zeerste aan te raden om zeocine resistente cellen uit te breiden naar cryo-voorraden te genereren voor toekomstige screening (~ 2-3 weken; cellijn afhankelijk).

2. Transfecteren Bibliotheek Cellen met miRNA-expressie-construct, Kies voor stabiele cellijn, en Select miRNA Doelen

Opmerking: Zeocine selectie niet meer nodig of gewenst. Blootstelling van cellen aan zeocine tijdens miRNA expressie en ganciclovir (doel-) selectie kan leiden tot verlies van miRNA doelen.

3. Puromycine, G418, en Ganciclovir Kill Curves

  1. Voer een kill-curve voor ganciclovir met cellen die stabiel de uiting van de Target ID Bibliotheek en met puromycine of G418 voor het wild-typecellen.
  2. Plaat 1,6 x 10 4 cellen in putjes van een 96-wells plaat met 120 ul vers medium. De volgende dag toe 0,1 tot 10 ug / ml puromycin/G418 of 2-32 pM ganciclovir geselecteerde putjes.
  3. Onderzoek haalbaarheid om de 2 dagen. Vervang de media die selectie reagens om de 3 dagen. De minimale concentratie van selectie reagens dat volledige celdood veroorzaakt * na de gewenste, te worden gebruikt dat celtype en experiment. Onze resultaten tonen dat 0,25 tot 1 pg / ml puromycine optimum voor A549, HeLa en MCF7 cellen, 0,3 ug / ml G418 voor MCF7 cellen en 8-16 uM ganciclovir optimaal zijn voor A549, HeLa en MCF7 cellen.

    * Opmerking: Met ganciclovir selectie, langzame of geen celgroei kan worden waargenomen zonder volledige celdood. Let op cellen gedurende een aantal dagen behandeling om te controleren of ze actief niet te delen. Als dit het geval is fenolrood in het medium rood blijft. Ook kan nodig zijn om een ​​ki voerenll curve analyse van de Target ID bibliotheek getransfecteerde cellen als er een verandering in de gevoeligheid wordt waargenomen. Dit zal echter moet worden bepaald op een celtype specifieke basis.

4. miRNA Transfectie via Nucleofectie en Target Selection

  1. Grow / uit te breiden Target ID Bibliotheek cellen tot en met 2 x 10 7 cellen te bereiken, en trypsinize wanneer de cellen zijn op> 80% confluentie.
  2. Transfer 2 x 10 7 cellen die 15 ml steriel schroef bedekt buis pellet 200 g gedurende 5 minuten.
  3. Verwijder medium en was celpellet met HBSS of 1X PBS.
  4. Centrifugeer op 200 xg gedurende 5 min en zuig wassen.
  5. Herhaal wassen stap van celpellet.
  6. Voorverwarmen 6-wells platen met 2 ml compleet medium per well op 37 ° C.
  7. Voeg 2 ug miRNA expressieplasmide (niet 10 pi dan) per 0,5 ml buis voor elke transfectie. Origene MicroRNA expressieplasmiden (Neomycine - G418 selectie) of zelf-gekloonde miRNA genen in pBabe-Puro (plasmide 1764; Addgene) zijn met succes gebruikt. Voor deze laatste werd de miRNA haarspeld met ~ 200 bp aan beide zijden PCR gekloond uit menselijk DNA.
  8. Hersuspenderen cellen in de buis van 15 ml van bovenaf met 100 ul Amaxa Nucleofectie oplossing (celspecifieke) per 2 x 10 6 cellen. Bijvoorbeeld: Voor 10 Nucleofections, voeg 1 ml reagens.
  9. Een reactie tegelijk worden 100 pi cellen de 2 ug plasmide. Meng met pipet.
  10. Breng het mengsel aan een Nucleofector cuvette.
  11. Plaats de cuvet in Nucleofector instrument en uit te voeren geoptimaliseerde programma geschikt is voor de cellijn (hoog rendement de voorkeur boven levensvatbaarheid van de cellen).
  12. Vul transferpipet met voorverwarmd medium. Neem cellen in dezelfde pipet overgebracht in 6-wells plaat. Herhaal dit voor elk Nucleofectie, een per goed.
  13. Keer terug naar groei kamer voor een nacht incubatie.
    14. <li> Vervang medium en laat cellen te herstellen gedurende 3-5 dagen.
  14. Vervang medium met compleet medium dat het juiste niveau van puromycine of G418 als bepaald op basis van de kill-curve test uitgevoerd voor transfectie met de miRNA te bouwen.
  15. Monitor cellen voor puromycine / G418 selectie (afsterven).
  16. Vervang medium met puromycine / G418 om de 2-3 dagen.
  17. Eenmaal confluente in 6-wells plaat, passage, zwembad en uitbreiding van cellen in grotere flessen.
  18. Lengte van de tijd voor uitbreiding van cellen kan door de gebruiker afhankelijk, maar het is ten zeerste aan te raden om puromycine / G418 resistente cellen uit te breiden naar cryo-voorraden te genereren voor toekomstige screening (~ 2-3 weken; cellijn afhankelijk).
  19. Vervang medium met de juiste niveaus van ganciclovir (GCV) en puromycine / G418, zoals bepaald door de kill-curve test uitgevoerd voor transfectie met de miRNA te bouwen.
  20. Monitor cellen voor selectie (cellen dying, Mirna targeting en knock-down van de TK-ZEO).
  21. Vouw cellen in de aanwezigheid van GCV en puromycine / G418.
  22. Bereid Genomic DNA van de GCV geselecteerde cellen.
  23. PCR versterken inzetstukken met kit primers (zie PCR Amplification).
  24. Clone in de TOPOTA vector (Invitrogen) voor standaard-sequencing of overlegt PCR-product voor diepe sequencing.

3. PCR-Amplify geselecteerde bibliotheek Inserts en Sequence

Opmerking: Deze procedure wordt uitgevoerd om PCR-versterken de bibliotheek doelstellingen die hebben overleefd ganciclovir selectie.

5. Verzamel ganciclovir geselecteerde cellen chromosomaal DNA voor te bereiden met behulp van een GenElute zoogdieren Genomic DNA Miniprep Kit (Catalogusnummer G1N10) of gelijkwaardig. Wij raden aan de voorbereiding van DNA van de ouder cellijn die niet beschikt over Target ID bibliotheek om als een negatieve controle te gebruiken voor de vergelijking met DNA van target-geselecteerde cellen in PCR.

  1. PCR-Ammoeten vereenvoudigen het genomische DNA met amplificatieprimer 1 en amplificatieprimer 2. Succesvolle versterkt volume is verkregen met JumpStart REDTaq Readymix Reaction Mix - voor PCR (catalogusnummer P0982). Optimalisatie van de omstandigheden kan nodig zijn als een polymerase wordt gebruikt. Zie tabel 1 voor een voorbeeld van PCR setup en tabel 2 voor de PCR fietsen omstandigheden.
  2. Los 2-5 pi van het PCR product op een 1% agarose gel. De verwachte product moet een uitstrijkje met een aantal zichtbare DNA-banding te zijn. Vergelijk met PCR-product van genomisch DNA van cellen te controleren zonder dat de Target ID Bibliotheek.
  3. Ga verder met klonen en / of diep-sequencing van het PCR-product. Als er geen amplificatieproduct wordt waargenomen of gelijk is aan DNA controle, optimaliseren PCR amplificatie zijn uitgevoerd (primer concentratie, de hybridisatietemperatuur en cycli).

6. Klonen en sequentieanalyse

Let op: We raden het klonen van het PCR-products en het uitvoeren standaard sequentie van ten minste 96 van de klonen met de amplificatieprimers in de kit. Deze procedure is met succes uitgevoerd met behulp van 96-well 's nachts culturen en plasmide zuiveringsinstallaties. Zelfs indien grote sequentie gewenst is, kan de voorlopige resultaten van het kloneren en sequencen standaard worden gebruikt als een kwaliteitscontrole te bepalen of de extra kosten van diepe sequencing gerechtvaardigd.

  1. Volg TA Cloning Kit productie het protocol voor het klonen van PCR-amplificatie producten (hierboven).
  2. Transformeer klonen in competente bacteriële cellen en selecteer 's nachts op antibiotica bevattend medium.
  3. Isoleer en groeien individuele kolonies in vloeibare cultuur met een geschikte antibiotica.
  4. Zuiver plasmide DNA. 6.5. Voer sequentiereacties met amplificatieprimers.
  5. Identificeer gen doelstellingen door BLAST positionering van sequenties met menselijke transcriptoom (voor bekende transcripties) en humaan genoom (voor nieuwe transcripts). *

* Klonen het oplossen van problemen: Als een groot aantal inserts van sequencing zijn plasmide-sequentie, het klonen / sequencing te optimaliseren als zodanig:

  • PCR-amplificatie product (insert) kwaliteit en kwantiteit
  • Ligatiereactie
  • Plasmide voorbereiding (kwaliteit en kwantiteit)
  • Sequencing reactieomstandigheden

4. Representatieve resultaten

Bibliotheek scherm voor miR-373 doelen
Om de prestaties van de missie Target ID Bibliotheek te evalueren, werden miR-373 doelen geselecteerd uit MCF-7-bibliotheek tot expressie brengen. MCF-7 werd gekozen omdat het spreekt weinig of geen aantoonbare miR-373 (gegevens niet getoond). miR-373 werd gekozen vanwege zijn biologisch belang. miR-373 expressie bevordert de tumor invasie en metastase in MCF-7, normaal gesproken een niet-gemetastaseerd cellijn [2]. Bovendien miR-373 orthologen van de muis miR-290 cluster betrokken zijn bij muis embryonale stamcellencelonderhoud [3], en de miR-373 familielid, miR-372, bevordert fibroblast herprogrammering te geïnduceerde pluripotente stamcellen [4]. Tenslotte hebben we zinkvinger nucleasen het invoegen van een PGK promoter-miR-373 expressie-construct in de AAVS1 site in MCF-7 cellen en genereerden een lijst van mogelijke miR-373 doelstellingen door RNA microarray analyse (gegevens niet getoond).

De target ID bibliotheek werd getransfecteerd in MCF-7 cellen en een stabiele populatie van cellen werd geselecteerd en geamplificeerd in zeocine bevattend medium. De verkregen cellen (MCF-7 Library) werden stabiel getransfecteerd met een miR-373 expressie construct en gekozen ganciclovir-bevattend medium te verrijken cellen die miR-373 doelen. We hebben vastgesteld dat de negatieve controle MCF-7 cellen Bibliotheek (zonder miR-373) niet los te maken en worden afgerond zoals verwacht voor de dode cellen. Opvallend was echter wel stoppen met groeien, die gemakkelijk werd ontdekt, omdat de fenolrood-bevattend medium niet oranje-geel, zoals waargenomen for cellen die miR-373 (Figuur 5). Cellen werden uitgebreid ganciclovir bevattend medium en doelwitsequenties werden geïsoleerd door PCR met primers weerszijden van de doel-ID bibliotheek cDNA inserties en DNA bereid uit de overlevende cellen. PCR producten werden Illumina gesequentieerd.

Zoals blijkt uit tabel 4 hebben we verkregen 17.740.719 cDNA maal gelezen, die is toegewezen aan 11.076 unieke genen. Van deze unieke genen, werden 2898 ontdekt met meer dan 40 maal gelezen, en daarom werden betrouwbaar geacht hits. De 13.106.469 vector leest werden verwacht, omdat de PCR-primers gebruikt om cDNA-inserts te versterken zijn 40 en 300 basissen uit de buurt van de plaats van inbrengen. Als zodanig wordt verwacht dat de meeste verkregen sequenties zou de vector tegenstelling traditionele diepe opeenvolging van genomisch materiaal. Veertien procent niet toewijzen aan een vector-of cDNA, maar wist af te stemmen op NCBI de niet-redundante nucleotide database (dat wil zeggen, met NR hit), en slechts 1% had geen cDNA-insert.

Een eerste vergelijking gevonden dat 10 het unieke genen geïdentificeerd met Target ID bibliotheek ook in de lijst van eerder genoemde miR-373 doelstellingen TarBase (tabel 5). Deze 10 miR-373 targets zijn eerder geïdentificeerd door middel van microarray met RNA van HeLa-cellen tijdelijk getransfecteerd met een synthetische miR-373 na te bootsen [5]. Verder hebben we ontdekt dezelfde 10 genen downgereguleerd in MCF-7 cellen die miR-373 van AAVS1 site (gegevens niet getoond). Daarom zijn deze 10 zijn waarschijnlijk geldig doelwit van miR-373. Er wordt gewerkt te karakteriseren de lijst van potentiële doelen en poging om experimenteel te valideren geselecteerde hits van RT-qPCR, Western blot, en luciferase reporter assay.

Figuur 1
Figuur 1. Workflow voor Target ID Bibliotheek. Secties AC: Zie de secties in de procedure. Elke stap wordt geïllustreerd en in detail beschreven in 3.

Figuur 2
Figuur 2. Transfectie en Zeocine selectie. De target ID Library een pool van plasmiden (A), elk met een menselijk cDNA ingevoegd in de 3'-UTR na thymidine kinase zeocine fusie-eiwit (TKzeo; fig. 4). Cellen getransfecteerd met Target ID Library (B) en om te herstellen gedurende 3-5 dagen. Constructen kunnen integreren in het genoom in deze herstelperiode (C) en drukken de gecodeerde transcriptie (D). Na herstel worden cellen blootgesteld aan zeocine (E). Cellen die de TKzeo fusieproteïne uit stabiel geïntegreerde Target ID constructen overleven zeocine selectie (F). Ongetransfecteerde cellen afsterven (G). Bovendien zijn alle cellen met een construct dat is een doelwit voor een endogene miRNA of OTHre factor uitgedrukt in de cel dat de expressie van TKzeo remt van de Target ID construct zal sterven (H).

Figuur 3
Figuur 3. MiRNA transfectie en ganciclovir selectie. Cellen die de doel-ID Library (bijvoorbeeld zeocine geselecteerde cellen) worden getransfecteerd met een instelbare microRNA expressieconstruct (A). Tijdens het herstel, kan de miRNA expressie-construct te integreren (B) en die de selecteerbare merker gecodeerd op de miRNA te bouwen. Na selectie van stabiele integratie (C) en celexpansie worden cellen behandeld met ganciclovir (D). Cellen die thymidine kinase (TK) in de aanwezigheid van ganciclovir (dwz cellen die TKzeo constructen niet de doelgroep van de miRNA) zal sterven (E) Aan de andere kant, cellen die Bibliotheek constructen met miRNA doelgroep s ites zal geen TK en daarom zal ganciclovir selectie (F) overleven. Overlevende cellen kunnen worden gekweekt, gDNA geïsoleerd, en het cDNA bevatten miRNA doelsites PCR-geamplificeerd met de Target ID amplificatieprimers. PCR producten kunnen worden gesequenced en uitgelijnd met het menselijk genoom miRNA targets te identificeren.

Figuur 4
Figuur 4. Plasmide kaart en locatie van amplificatieprimers. Sfil zijn de sites van cDNA klonen.

Primersequenties

MISSIE Target ID amplificatieprimer 1

5 ACGACGTGACCCTGTTCATC 3

MISSIE Target ID amplificatieprimer 2

5 TAAAACGACGGCCAGTGAAT 3

ig5.jpg "alt =" Figuur 5 "/>
Figuur 5. Ganciclovir effect op celgroei. Vierentwintig en platen werden gezaaid met twee-honderdduizend MCF-7 cellen of MCF-7 cellen met de Target ID Bibliotheek. Vierentwintig uur later werd het medium vervangen door medium dat 0, 8 of 16 pM ganciclovir. Na 15 dagen werd de plaat gefotografeerd (6 wells bovenste) en de putjes gewassen met HBSS en gekleurd met Brilliant Blue R Kleuroplossing (B6529) (6 lager wells). Merk op dat ganciclovir geen effect op MCF-7 cellen heeft zonder Library omdat ze niet uit thymidine kinase (TK). Anderzijds, MCF-7 Library cellen doen express TK maar niet volledig gedood door ganciclovir 8 of 16 uM, zoals blijkt uit de levende cellen opnemen Brillinat Blue. Echter, de Bibliotheek cellen stoppen met groeien in ganciclovir, zoals blijkt uit de kleur van de fenol rode kleurstof in hun medium. De aangehouden cellen niet verzuren hun medium, en de kleur blijft rood in plaats van het overschakelen op ofange-geel.

Reagens Volume / Reactie
Jumpstart REDTaq Readymix Reactie mix 10 pi
Amplificatie Primer 1 (25 uM) 0,2 pl
Amplificatie Primer 2 (25 uM) 0,2 pl
Genomisch DNA 50-200 ng
Water, moleculair-biologische kwaliteit 20 pi

Tabel 1.

Stap Temp. Tijd Cycles
Initiële denaturatie 95 ° C 5 min. 1
Denaturatie 95 ° C 30 sec. pan = "3"> 40 cycli
Gloeien * 62 ° C 30 sec.
Uitbreiding 68 ° C 2 min.
Laatste verlenging 68 ° C 5 min. 1
Houden 4 ° C Houden

Tabel 2.

* Gloeien temperaturen kunnen variëren, maar we hebben gezien de beste amplificatieproducten met gloeien temperaturen variërend tussen 53 en 64 ° C.

Tabel 3

Tabel 3. Target ID Bibliotheek inhoud door Illumina sequencing.

Tabel 4

Tabel 4. MiR-373 geselecteerde doelen door Illumina sequencing.

les/ftp_upload/3303/3303table5.jpg "alt =" tabel 5 "/>

Tabel 5. 10 targets eerder door RNA-microarray.

Discussion

microRNA's zijn 20-24 nucleotide RNA's die de genexpressie reguleren post-transcriptie door remming van mRNA vertaling, en vaak, destabilisatie van de beoogde mRNA (besproken in [6]). Een enkele miRNA kunnen zelf een paar honderd mRNA naar een cel reageert op ontwikkelings-en signalen uit de omgeving te controleren. Het identificeren en valideren van doelwit mRNA's is essentieel in het bepalen van een miRNA de rol en functie in deze routes. Echter, target identificatie is niet eenvoudig, omdat, in dieren, miRNAs en hun doel sites zijn niet volledig complementair. De "zaad" gebied, gebaseerd 2 tot 7 van het 5'-uiteinde van de miRNA, meestal complementair aan de doelstellingen. Er zijn echter vele uitzonderingen op het zaad regel-en downstream-base-paring kan compenseren voor een onvolmaakte zaad wedstrijd. Een aantal van de computer algoritmes zijn ontwikkeld om miRNA doelen op basis van zaad matching-en downstream-compensatie, doelstructuur voorspellen eend positie, volgorde behoud, en verschillende andere parameters die zijn waargenomen voor experimenteel gevalideerde targets (besproken in [7]). Terwijl in silico voorspellingen zijn handig en doen identificeren aan geldige miRNA doelen, de meeste voorspelde genen niet experimentele validatie testen, en veel feitelijke prestatiedoelstellingen worden niet voorspeld. Aangezien computeralgoritmen gebaseerd op vooraf bepaalde doel functies ze niet toe ontdekking targets die afwijken van hetgeen reeds bekend.

Een aantal experimentele systemen zijn met succes gebruikt om te identificeren of te ontdekken functionele miRNA doelen in levende cellen. Deze globale screening methoden omvatten microarrays en RNA-sequencing, RNA co-immunoprecipitatie (RIP), en stabiele isotopen Labeling met aminozuren in Cell cultuur (SILAC), een proteomics methode (beoordeeld in [7]). Elke methode heeft voor-en nadelen. Aangezien miRNA gericht destabiliseert vaak een mRNA en leidt tot de afbraak, verlies or winst in mRNA niveau na de invoering van een miRNA na te bootsen of remmer respectievelijk, kan identificeren miRNA doelen. Dit verlies of winst van mRNA wordt gemakkelijk gedetecteerd door middel van microarray of diep-sequencing. Terwijl mRNA detectiemethoden zijn eenvoudiger en gevoeliger dan eiwitten detectiemethoden, zal mRNA detectie missen elke miRNA targets die niet worden afgebroken. Recente rapporten van de Bartell lab vergelijken van miRNA doel de resultaten van RNA-detectie met die van SILAC [8] of ribosoom profilering [9] blijkt dat zoogdieren miRNAs voornamelijk te handelen door het verminderen van doel-mRNA niveaus. Maar veel andere laboratoria werken met individuele miRNA waargenomen doelen verandering in de eiwitten, maar geen verandering in mRNA niveau. Verslagen van wat lijken te translationeel regelgeving zonder waarneembare mRNA verlies zijn onder andere: miR-10b op HOXD10 [10], miR221/222 op p27kip1 [11], miR-21 op Pdcd4 [12], miR-126 op p85β [13] , miR-34 op SIRT1 [14], miR-21 op PTEN [15], miR-302d op Arid4b [16], miR-200C op JAG1 [17], en miR-299, 297, 567, eene 609 voor VEGFA [18]. Bovendien Clancy et al. [19] onlangs gemeld dat translationele regulatie door laten we-7 werd pas ontdekt wanneer individuele mRNA isovormen dat het laat-7 doelplaats bevatten werden selectief gedetecteerd. Dit laatste blijkt dat, tenminste in sommige gevallen translationele regeling kan worden vergeten een samengesteld profiel - dat, wanneer alle mRNA isovormen gedetecteerd als een mRNA - zoals verkregen met vele microarray en sequentie-analyses. Co-immunoprecipitatie van miRNA-mRNA-complexen via Argonaute (meestal ago2) of een andere geassocieerd eiwit (RNA immunoprecipitatie, of RIP) zal isoleren miRNA doelen los van Verordening mechanisme. Daarnaast, RIP detecteert endogene, en vermoedelijk biologisch relevante, interacties. Het is echter niet bekend of alle miRNA-mRNA interacties functioneel zijn, en RIP zou missen mRNA doelen die associëren slechts tijdelijk of snel afgebroken. Bovendien moeten bepaalde miRNA-mRNA partners worden afgeleid bioinformatitisch omdat alle miRNA-mRNA paar co-neergeslagen bij elkaar. Tot slot, SILAC identificeert direct het eindproduct van miRNA regelgeving, het eiwit zelf, maar is ongevoelig en daardoor mist zeldzame eiwitten en kleine vouw veranderingen in eiwit niveaus.

In het licht van de beperkingen met de huidige miRNA target identificatie methoden, voelden we ons een extra wereldwijde test om functionele miRNA targets te identificeren door een alternatief mechanisme nodig was. Om aan deze behoefte te voldoen, hebben we een vergunning een technologie uitgevonden door Joop Gaken en Azim Mohamedali van King's College in Londen. Hun uitvinding is een dubbele selectie fusie-eiwit, in het bijzonder, een thymidine kinase-zeocine fusie, gereguleerd door een cDNA-bibliotheek van de potentiële miRNA doelsequenties in zijn 3'UTR. Stabiel getransfecteerde cellen met expressie en TKzeo-cDNA constructen kunnen worden geselecteerd zeocine, zoals in figuur 2. Na het uiten van een miRNA van belang, kan dat miRNA's doelstellingen worden gekozen with ganciclovir, zoals in figuur 3. Ganciclovir doodt cellen die thymidine kinase, dat wil zeggen, alle cellen die TKzeo-cDNA ontbreekt een streefcijfer voor de miRNA van belang. Gerichte cDNA kan worden geïsoleerd door PCR amplificatie van DNA uit cellen die ganciclovir behulp van primers die de flank cDNA en PCR-producten kunnen worden gesequenced om targets te identificeren overleven.

Wij hebben de King's College in technologie in een nieuwe tool voor wereldwijde identificatie en de ontdekking van functionele menselijke miRNA doelen - De opdracht Target ID Library. Met de Target ID Bibliotheek, kunnen gebruikers isoleren miRNA doelstellingen door een reeks van zoogdiercelculturen transfectie en drugs selectie stappen. De bibliotheek is zeer uitgebreid, en bevat 66-79% van de menselijke genen. De eerste resultaten geven aan dat beide eerder ontdekt en nieuwe doelen kunnen worden geïsoleerd van de MISSION Target ID Library.

Hoewel het protocol van enige lengte,het gebruik van de Target ID bibliotheek moet een standaard moleculaire lab technieken - zoogdiercellen cultuur, transfectie, drugs-selectie, PCR en sequencing - en daarom moet goed van de mogelijkheden van de meeste biologen. Wij stellen voor dat voldoende aandacht wordt besteed aan een goede opzet van het experiment, het optimaliseren van kweekomstandigheden, en vooral, pre-testen van elk nieuw type cel optimaal geneesmiddel te bepalen voor de selectie stappen (kill-curves) naar succes met de Target ID Bibliotheek te garanderen.

Zoals bij alle miRNA target identificatie methoden, is het sterk aanbevolen om doelstellingen die zijn geformuleerd screening van de Target ID Library worden gevalideerd met een tweede methode, zoals microarray, qRT-PCR, reporter assay (dat wil zeggen, luciferase), of West-analyse.

Disclosures

Auteurs verklaren financiële relaties met commerciële instellingen die belang hebben bij het ingezonden werk te hebben.

Acknowledgments

Wij danken het hele Sigma Life Science Mission Target ID Bibliotheek development team, in het bijzonder Kevin Gutshall voor het vinden van de technologie en het onderhandelen over de licentievoorwaarden, en Heather Holemon voor haar steun en deelname aan het oplossen van problemen vruchtbare discussies. We danken ook dr. Joop Gäken van King's College in Londen voor het vrij delen van niet-gepubliceerde resultaten en suggesties, en Qazi Hamid van RxBiosciences voor het bereiden van een grote partij van cDNA en zijn persistentie in het krijgen van het gekloond. We willen Nan Lin en Scott Bahr erkennen van SAFC voor het uitvoeren van cDNA arrays en data-analyse.

Missie is een geregistreerd handelsmerk van Sigma-Aldrich Biotechnologie LP

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JumpStart REDTaq ReadyMix Sigma-Aldrich P0982
Ganciclovir Sigma-Aldrich G2536
G418 Sigma-Aldrich G8168
Puromycin Sigma-Aldrich P9620
Topo TA Invitrogen KNM4500-01
GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit Sigma-Aldrich G1N10
Cell Specific Nucleofection kit Lonza Inc.
Nucleofector Lonza Inc. AAD-1001
Zeocin Invitrogen R250-01
Target ID Library Sigma-Aldrich MREH01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Target ID Library Technical Bulletin, Catalog # MREH01. [Internet]. , Sigma Aldrich. St Louis. Available from: http://www.sigma-aldrich.com (2012).
  2. Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis. Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).
  3. Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells. Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).
  4. Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).
  5. Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).
  6. Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).
  7. Thomas, M. Desperately seeking microRNA targets. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).
  8. Baek, D. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).
  9. Guo, H. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).
  10. Ma, L. Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer. Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).
  11. Visone, R., et al. MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle. Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).
  12. Lu, Z., et al. MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene. Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).
  13. Guo, C., et al. The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers. Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).
  14. Yamakuchi, M., et al. miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).
  15. Wickramasinghe, N. S., et al. Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells. Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 Forthcoming.
  16. Ciaudo, C., et al. Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation. PLoS Genetics. 5, e1000620 (2009).
  17. Vallejo, D. M., et al. Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells. EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).
  18. Jafarifar, F., et al. Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP. L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).
  19. Clancy, J. L., et al. mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation. RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).

Tags

Genetica Target ID miRNA ncRNA RNAi genomics
Genoom-brede scherm voor miRNA Doelen Met behulp van de MISSION Target ID Bibliotheek
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Coussens, M. J., Forbes, K.,… More

Coussens, M. J., Forbes, K., Kreader, C., Sago, J., Cupp, C., Swarthout, J. Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library. J. Vis. Exp. (62), e3303, doi:10.3791/3303 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter