Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

L'échelle du génome d'écran pour cibles des miRNA l'aide de l'ID de bibliothèque MISSION cible

Published: April 6, 2012 doi: 10.3791/3303
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Sigma-Aldrich
* These authors contributed equally

Summary

La Bibliothèque ID cible est une base de plasmide, l'échelle du génome de collecte de l'ADNc cloné utilisé pour identifier les cibles des miRNA. Ici, nous la preuve de son utilisation et l'application.

Abstract

La Bibliothèque ID cible est conçu pour aider à la découverte des cibles et l'identification des microARN (miARN). La Bibliothèque ID cible est une base de plasmide, l'échelle du génome ADNc cloné dans les 3'UTR aval de la protéine de fusion à double sélection, la thymidine kinase-zéocine (TKzeo). Le premier tour de sélection est pour les transformants stables, suivie avec l'introduction d'un miRNA d'intérêt, et enfin, la sélection pour les ADNc contenant la cible du miRNA de. ADNc sélectionnés sont identifiés par séquençage (voir la figure 1-3 pour Workflow Library ID cible et les détails).

Pour assurer une large couverture du transcriptome humain, ID cible Bibliothèque ADNc ont été générés via oligo-dT amorçage utilisant un pool d'ARN total préparé à partir de plusieurs tissus humains et des lignées cellulaires. Résultant gamme d'ADNc de 0,5 à 4 ko, avec une taille moyenne de 1,2 kb, et ont été clonés dans le p3TKzeo double plasmide de sélection (voir la figure 4 pour une carte de plasmide). Les gènes cibles représentées dans le lithèque peut être trouvée sur la page web de Sigma-Aldrich. Les résultats de séquençage Illumina (tableau 3), montrent que la bibliothèque comprend 16 922 des 21,518 gènes uniques dans UCSC RefGene (79%), ou 14.000 gènes avec 10 ou plus de lectures (66%).

Protocol

1. La transfection avec Bibliothèque ID cible et la sélection de lignées cellulaires stables

1. Zéocine Tuer Curve

Zéocine est utilisé pour sélectionner des cellules transfectées de façon stable. Toutefois, la zéocine excès entraîne indésirables réponses phénotypiques dans la plupart des types cellulaires. Par conséquent, une analyse de la courbe kill doit être effectuée pour établir la dose létale minimale.

  1. Plaque 1,6 x 10 4 cellules dans les puits d'une plaque de 96 puits dans 120 ul de médias.
  2. Le lendemain, ajouter la zéocine dans des concentrations croissantes allant de 50 pg / ml à 1 mg / ml dans les puits appropriés.
  3. Examiner la viabilité tous les 2 jours.
  4. Remplacez le support contenant la zéocine tous les 3 jours. La concentration minimale de réactif de sélection qui provoque la mort cellulaire complète après le moment souhaité doit être utilisé pour ce type de cellule et d'expérimentation. Nos résultats montrent que 500 pg / ml zéocine est optimale pour A549, HeLa, et les cellules MCF7.

2.Transfection Bibliothèque via nucléofection et sélection

  1. Sélectionnez une lignée cellulaire qui ne soit pas exprimer ou exprime des niveaux faibles de votre miRNA d'intérêt. Le miARN sera présenté dans la section B de sélection des cibles après l'expression stable de la Bibliothèque ID cible est atteint.
  2. Culture / multiplier des cellules. Nous avons obtenu d'excellents résultats avec 2 x 10 7 cellules par transfection de la bibliothèque.
  3. Trypsiniser cellules qui sont à> 80% de confluence, et transférer 2 x 10 7 cellules à un des tubes stériles 15 ml à vis à sommet.
  4. Pellet trypsinisées cellules à 200 xg pendant 5 min.
  5. Evacuer le milieu et laver culot cellulaire avec HBSS ou 1X PBS.
  6. Centrifuger à 200 xg pendant 5 min et aspirer lavage.
  7. Répétez étape de lavage du culot cellulaire.
  8. Préchauffer plaques 6 puits avec 2 ml de milieu complet à 37 ° C.
  9. Ajouter 2 ug d'ID cible Bibliothèque (à ne pas dépasser 10 pi) par 0,5 ml tube pour chaque transfection.
  10. Resuspendre les cellules dans le tube de 15 ml d'en haut avec 100 ul de la solution nucléofection Amaxa (cellule spécifique) par 2 x 10 6 cellules. Par exemple, pour 10 Nucleofections ajouter 1 ml de réactif.
  11. Une réaction à un moment, ajouter 100 ul de cellules à l'pg 2 de plasmide. Mélanger à la pipette.
  12. Transférer le mélange dans une cuvette Nucleofector.
  13. Introduire la cuve dans l'instrument Nucleofector et exécuter le programme optimisé approprié pour la lignée cellulaire (High Efficiency préféré sur la viabilité cellulaire).
  14. Remplir une pipette de transfert pré-chauffé à moyen terme. Prenez place dans les cellules même pipette et le transfert à des plaques 6 puits. Répétez l'opération pour chaque nucléofection, un par puits.
  15. Retour à la chambre de croissance pour une nuit d'incubation.
  16. Le lendemain, remplacer à moyen et à permettre aux cellules de récupérer pendant 3-5 jours.
  17. Remplacer milieu avec un milieu complet contenant le niveau approprié de la zéocine, tel que déterminé par l'analyse de la courbe kill.
  18. Mocellules NITOR pour la sélection des cellules zéocine (mourir).
  19. Remplacer moyenne avec zéocine tous les 2-3 jours.
  20. Une fois confluentes dans des plaques 6 puits, passage, une piscine et d'étendre les cellules dans les grandes fioles.
  21. Longueur de temps pour l'expansion des cellules est facile à utiliser et la lignée cellulaire dépendante, mais il est fortement recommandé d'élargir la zéocine cellules résistantes à générer des cryo-actions pour le dépistage futur (~ 2-3 semaines; lignée cellulaire dépendante).

2. Cellules Bibliothèque transfecter avec miARN-construction d'expression, pour Sélectionnez lignée cellulaire stable, et sélectionner les cibles des miRNA

Remarque: La sélection Zéocine n'est plus nécessaire ou souhaité. L'exposition de cellules à la zéocine lors de l'expression des miARN et le ganciclovir (cible) de sélection peut entraîner une perte de cibles des miRNA.

3. Puromycine, G418, et le ganciclovir Courbes kill

  1. Effectuer une courbe kill ganciclovir avec des cellules exprimant de façon stable la Bibliothèque ID cible et à la puromycine ou G418 de type sauvagecellules.
  2. Plaque 1,6 x 10 4 cellules dans les puits d'une plaque de 96 puits avec 120 ul de milieu frais. Le lendemain, ajouter de 0,1 à 10 pg / ml de puromycin/G418, ou 2 à 32 uM ganciclovir aux puits sélectionnés.
  3. Examiner la viabilité tous les 2 jours. Remplacez le support contenant réactif de sélection tous les 3 jours. La concentration minimale de réactif de sélection qui provoque complet * la mort cellulaire après l'heure souhaitée, devrait être utilisé pour ce type de cellule et de l'expérience. Nos résultats montrent que 0,25 à 1 ug / ml de puromycine est optimale pour A549, HeLa, et les cellules MCF7, 0,3 pg / ml de G418 pour les cellules MCF7 et 8-16 uM ganciclovir sont optimales pour les A549, Hela, et MCF7.

    * Remarque: Avec une sélection ganciclovir, la croissance des cellules lent ou pas peut être observée sans mort cellulaire complète. Observer les cellules par rapport au traitement de plusieurs jours pour vérifier qu'ils ne sont pas en division active. Si tel est le cas, alors le rouge de phénol dans le milieu reste rouge. Il peut également être nécessaire d'effectuer un kianalyse de la courbe ll de la bibliothèque ID cible des cellules transfectées si une modification de la sensibilité est observée. Toutefois, cela devra être déterminé sur une base type de cellule spécifique.

4. Transfection miARN par l'intermédiaire nucléofection et Target Selection

  1. Croissance / multiplier des cellules cibles ID de la bibliothèque pour atteindre 2 x 10 7 cellules, et lorsque les cellules sont trypsiniser à> 80% de confluence.
  2. Transfert 2 x 10 7 cellules à une vis de 15 ml stérile surmonté tube et granulés à 200 xg pendant 5 minutes.
  3. Evacuer le milieu et laver culot cellulaire avec HBSS ou 1X PBS.
  4. Centrifuger à 200 xg pendant 5 min et aspirer lavage.
  5. Répétez étape de lavage du culot cellulaire.
  6. Préchauffer plaques 6 puits avec 2 ml de milieu complet par puits à 37 ° C.
  7. Ajouter 2 ug de l'expression du miARN plasmide (à ne pas dépasser 10 pi) par 0,5 ml tube pour chaque transfection. Les plasmides d'expression du microARN Origène (néomycine - G418 sélection) ou des gènes de miRNA auto-clonés dans pBABE-Puro (plasmide 1764; Addgene) ont été utilisés avec succès. Pour ce dernier, l'épingle à cheveux miARN avec ~ 200 pb de chaque côté a été cloné à partir de PCR ADN humain.
  8. Resuspendre les cellules dans le tube de 15 ml d'en haut avec 100 ul de la solution nucléofection Amaxa (cellule spécifique) par 2 x 10 6 cellules. Par exemple: Pour 10 Nucleofections, ajouter 1 ml de réactif.
  9. Une réaction à un moment, ajouter 100 ul de cellules à l'pg 2 de plasmide. Mélanger à la pipette.
  10. Transférer le mélange dans une cuvette Nucleofector.
  11. Introduire la cuve dans l'instrument Nucleofector et exécuter le programme optimisé approprié pour la lignée cellulaire (haute efficacité préférable à la viabilité des cellules).
  12. Remplir une pipette de transfert pré-chauffé à moyen terme. Prenez place dans les cellules même pipette et le transfert à des plaques 6 puits. Répétez l'opération pour chaque nucléofection, un par puits.
  13. Retour à la chambre de croissance pour une nuit d'incubation.
    14. <li> Remplacer moyen et permettent aux cellules de récupérer pendant 3-5 jours.
  14. Remplacer milieu avec un milieu complet contenant le niveau approprié de la puromycine ou G418 tel que déterminé par l'essai de courbe kill effectué avant la transfection avec le miARN construire.
  15. Surveiller les cellules pour la puromycine / G418 sélection (cellules meurent).
  16. Remplacer milieu avec puromycine / G418 tous les 2-3 jours.
  17. Une fois confluentes dans des plaques 6 puits, passage, une piscine et d'étendre les cellules dans les grandes fioles.
  18. Longueur de temps pour l'expansion des cellules est facile à utiliser dépend, mais il est fortement recommandé d'élargir la puromycine / G418 cellules résistantes à générer des cryo-actions pour le dépistage futur (~ 2-3 semaines; lignée cellulaire dépendante).
  19. Remplacer milieu avec les niveaux appropriés de ganciclovir (GCV) et la puromycine / G418, tel que déterminé à partir de l'essai de courbe kill effectué avant la transfection avec le miARN construire.
  20. Surveiller les cellules pour la sélection des cellules (dying, les miARN de ciblage et de knockdown des savoirs traditionnels-ZEO).
  21. Développer des cellules en présence de GCV et la puromycine / G418.
  22. Préparer l'ADN génomique à partir des cellules sélectionnées GCV.
  23. Amplifier par PCR des inserts avec kit amorces (voir amplification par PCR).
  24. Clone dans le vecteur TOPOTA (Invitrogen) pour le séquençage standard ou présenter des produits de PCR pour le séquençage en profondeur.

3. PCR-amplifier Insère la bibliothèque sélectionnée et des séquences

Remarque: Cette procédure est effectuée à la PCR-amplifier les objectifs de la bibliothèque qui ont survécu à la sélection du ganciclovir.

5. Recueillir des ganciclovir cellules choisis pour préparer l'ADN chromosomique utilisant un mammifère GenElute ADN génomique Miniprep Kit (G1N10 numéro de catalogue) ou l'équivalent. Nous recommandons de préparer l'ADN de la lignée cellulaire parent qui ne contient pas la bibliothèque ID cible pour l'utiliser comme un contrôle négatif pour la comparaison avec l'ADN de cellules cibles sélectionnées dans la PCR.

  1. PCR Amplifier l'ADN génomique avec 1 amorce d'amplification et 2 amorce d'amplification. D'amplification réussie a été obtenu avec JumpStart REDTaq Mélange réactionnel Readymix - pour la PCR (Numéro de catalogue P0982). Optimisation des conditions de peut être nécessaire si une autre polymérase est utilisée. Se reporter au tableau 1 pour un exemple de configuration PCR et le tableau 2 pour les conditions de cyclisme PCR.
  2. Résoudre 2-5 ul du produit de PCR sur un gel d'agarose 1%. Le produit attendu devrait être un frottis avec de l'ADN visible de baguage. Comparer à contrôler le produit PCR de l'ADN génomique de cellules sans la Bibliothèque ID cible.
  3. Procéder avec le clonage et / ou le séquençage en profondeur du produit de PCR. Si aucun produit d'amplification est observé ou est identique à contrôler l'ADN, l'optimisation des conditions d'amplification par PCR (concentration amorce, la température de recuit, et les cycles).

6. Clonage et séquençage

Remarque: Nous recommandons fortement le clonage du produit PCRs et en effectuant ensuite séquençage norme d'au moins 96 des clones en utilisant des amorces d'amplification fournies dans le kit. Cette procédure a été effectuée avec succès en utilisant 96 puits cultures de la nuit et des systèmes de purification de plasmides. Même si le séquençage en profondeur est souhaitée, les résultats préliminaires de clonage et le séquençage standard peut être utilisé comme un contrôle de qualité afin de déterminer si la dépense supplémentaire de séquençage en profondeur est nécessaire.

  1. Suivre le protocole TA cloning kit fabrication pour les produits d'amplification par PCR (clonage ci-dessus).
  2. Transformez clones dans des cellules bactériennes compétentes et sélectionnez une nuit sur un milieu contenant un antibiotique.
  3. Isoler et à cultiver des colonies individuelles dans une culture liquide contenant des antibiotiques appropriés.
  4. Purifier l'ADN plasmidique. 6,5. Effectuer des réactions de séquençage avec amorces d'amplification.
  5. Identifier les gènes cibles par l'alignement de séquences avec BLAST transcriptome humain (pour les transcriptions connues) et du génome humain (pour le roman transcripts) *.

* Le clonage de dépannage: Si un nombre élevé de plaquettes de séquençage sont séquence plasmidique, optimiser les conditions de clonage / séquençage en tant que telle:

  • Amplification PCR produit (insert) la qualité et la quantité
  • Réaction de ligature
  • Plasmide de préparation (qualité et quantité)
  • Les conditions de réaction de séquençage

4. Les résultats représentatifs

Écran Bibliothèque pour miR-373 cibles
Pour évaluer la performance de la Bibliothèque Mission ID cible, miR-373 cibles ont été sélectionnés à partir de cellules MCF-7 exprimant la bibliothèque. MCF-7 a été choisi parce qu'il exprime peu ou pas détectable miR-373 (données non présentées). miR-373 a été choisi pour son intérêt biologique. miR-373 expression favorise l'invasion tumorale et les métastases dans MCF-7, normalement d'une lignée cellulaire non-métastatique [2]. Par ailleurs, miR-373 orthologues de la souris miR-290 du cluster sont impliqués dans la souris souches embryonnairesl'entretien des cellules [3], et le miR-373 membre de la famille, miR-372, la promotion des fibroblastes reprogrammation de cellules souches pluripotentes induites [4]. Enfin, nous avons utilisé nucléases à doigt de zinc pour insérer un promoteur PGK-miR-373 construction d'expression dans le site AAVS1 en cellules MCF-7, et a généré une liste de potentiels miR-373 cibles par l'ARN microarray d'analyse (données non présentées).

La Bibliothèque ID cible a été transfecté dans les cellules MCF-7, et une population stable de cellules a été sélectionné et amplifié dans un milieu contenant la zéocine. Les cellules résultantes (MCF-7 Library) ont été transfectées de façon stable avec une construction miR-373 exprimer et sélectionné dans un milieu contenant du ganciclovir à enrichir des cellules exprimant miR-373 cibles. Nous avons observé que le contrôle négatif des cellules MCF-7 Library (sans miR-373) ne se détache pas et s'arrondissent comme prévu pour les cellules mortes. Cependant, ils ont cessé de croître, ce qui a été facilement détectée parce que le rouge de phénol milieu contenant n'a pas à l 'orange-jaune comme on l'observe focellules exprimant miR r-373 (figure 5). Les cellules ont été élargies en ganciclovir milieu contenant, et les séquences cibles ont été isolés par PCR avec des amorces flanquant les inserts ID cible banque d'ADNc et d'ADN préparés à partir des cellules survivantes. Les produits de PCR ont été séquencés Illumina.

Comme le montre le tableau 4, nous avons obtenu 17.740.719 lectures d'ADNc, qui a cartographié à 11,076 gènes uniques. Parmi ces gènes uniques, 2898 ont été détectés avec plus de 40 lectures, et ont donc été considérées comme fiables succès. Le vecteur 13.106.469 lit étaient attendus parce que les amorces de PCR utilisées pour amplifier inserts d'ADNc sont 40 et 300 bases en dehors du site d'insertion. En tant que tel, il est prévu que les séquences les plus en résulteraient seraient à partir du vecteur différence plus profonde séquençage traditionnel de matériel génomique. Quatorze pour cent ne correspond pas à soit vecteur ou de l'ADNc, mais ne rallient à la NCBI base de données non redondante de nucléotides (c.-à-coup NR), et seulement 1% n'ont pas d'insertion d'ADNc.

Une première comparaison a révélé que 10 des gènes uniques identifiés avec la Bibliothèque ID cible sont également dans la liste des préalablement identifiés miR-373 cibles dans TarBase (tableau 5). Ces 10 miR-373 cibles ont déjà été identifiés par puce à ADN à l'ARN à partir de cellules HeLa transfectées transitoirement avec un synthétique miR-373 imiter [5]. En outre, nous avons détecté ces 10 mêmes gènes régulés à la baisse dans les cellules MCF-7 exprimant miR-373 à partir du site AAVS1 (données non présentées). Par conséquent, ces 10 sont susceptibles de cibles valides miR-373. Le travail est en cours pour caractériser la liste des cibles potentielles et tenter de valider succès sélectionnés expérimentalement par RT-qPCR, Western blot, et dosage rapporteur de la luciférase.

Figure 1
Figure 1. Workflow pour la bibliothèque ID cible. Les articles AC: Se reporter aux sections dans la procédure. Chaque étape est illustrée et décrite en détail dans 3.

Figure 2
Figure 2. La transfection et la sélection Zéocine. La bibliothèque d'identification cible est un groupe de plasmides (A), chacune avec un ADNc humaine inséré dans le 3'-UTR après une protéine thymidine kinase de fusion-zéocine (TKzeo; Fig 4). Les cellules sont transfectées avec ID cible Bibliothèque (B) et a permis de récupérer pendant 3-5 jours. Les constructions peuvent s'intégrer dans le génome au cours de cette période de récupération (C), et d'exprimer la transcription codée (D). Après la récupération, les cellules sont exposées à la zéocine (E). Les cellules exprimant la protéine de fusion de TKzeo intégré de manière stable des constructions ID cibles survivre à la sélection zéocine (F). Cellules non transfectées meurent (G). En outre, toutes les cellules contenant une construction qui est une cible pour un miRNA endogène ou toute OTHfacteur er exprimé dans la cellule qui inhibe l'expression de TKzeo de l'ID cible construction va mourir (H).

Figure 3
Cellules Figure 3. Transfection miARN et la sélection du ganciclovir. Contenant l'ID cible Bibliothèque (c.-à-zéocine cellules sélectionnées) sont transfectées avec une expression de microARN sélectionnable construire (A). Lors de la récupération, la construction d'expression miARN peut intégrer (B) et d'exprimer le marqueur sélectionnable codé sur la miARN construire. Après la sélection pour l'intégration stable (C) et l'expansion des cellules, les cellules sont traitées avec le ganciclovir (D). Les cellules productrices de la thymidine kinase (TK), en présence de ganciclovir (c.-à-cellules exprimant TKzeo constructions non ciblés par le miRNA) vont mourir (E) D'autre part, les cellules contenant des constructions de bibliothèque avec miRNA cible s ites ne produira pas les savoirs traditionnels, et, par conséquent, sera survivre à la sélection ganciclovir (F). Cellules survivantes peuvent être cultivés, ADNg isolé, et les ADNc contenant des sites cibles des miRNA amplifié par PCR en utilisant les amorces d'amplification ID cible. Les produits de PCR peut être séquencée et aligné avec le génome humain pour identifier les cibles des miRNA.

Figure 4
Figure 4. Carte plasmide et l'emplacement d'amorces d'amplification. Sfi I sont des sites de clonage de l'ADNc.

Les séquences des amorces

Objectif de la mission d'amplification ID amorce 1

5 ACGACGTGACCCTGTTCATC 3

Objectif de la mission d'amplification ID amorce 2

5 TAAAACGACGGCCAGTGAAT 3

ig5.jpg "alt =" Figure 5 "/>
Figure 5. Effet ganciclovir sur la croissance cellulaire. Vingt-quatre plaques à puits ont été ensemencées avec 2-100000 cellules MCF-7 ou cellules MCF-7 contenant la Bibliothèque ID cible. Vingt-quatre heures plus tard, le milieu a été remplacé par du milieu contenant 0, 8 ou 16 uM ganciclovir. Après 15 jours, la plaque a été photographiée (6 puits supérieurs), puis les puits lavés avec du HBSS et colorées avec Brilliant Solution coloration au bleu de R (B6529) (6 puits inférieurs). Notez que le ganciclovir n'a aucun effet sur cellules MCF-7, sans bibliothèque, car ils n'expriment pas la thymidine kinase (TK). D'autre part, les cellules MCF-7 Library faire exprès savoirs traditionnels, mais ne sont pas complètement tué par ganciclovir à 8 ou 16 uM, comme le montrent les cellules vivantes qui prennent place Brillinat Bleu. Cependant, les cellules de bibliothèque ne cesse de croître dans le ganciclovir, comme en témoigne la couleur du colorant rouge de phénol dans leur milieu. Les cellules ne sont pas arrêtés acidifier leur milieu, et la couleur reste rouge au lieu de changer ouange-jaune.

Réactif Volume / Réaction
Jumpstart REDTaq mélange réactionnel Readymix 10 pl
1 amorce d'amplification (25 uM) 0,2 ul
2 amorce d'amplification (25 uM) 0,2 ul
L'ADN génomique 50-200 ng
L'eau, la biologie moléculaire à 20 pi

Tableau 1.

Étape Temp. Temps Cycles
Dénaturation initiale 95 ° C 5 min. 1
Dénaturation 95 ° C 30 secondes. PAN = "3"> 40 cycles
Recuit * 62 ° C 30 secondes.
Extension 68 ° C 2 min.
Extension final 68 ° C 5 min. 1
Tenir 4 ° C Tenir

Tableau 2.

* Les températures de recuit peut varier, mais nous avons observé les meilleurs produits d'amplification avec des températures de recuit comprises entre 53 et 64 ° C.

Tableau 3

Tableau 3. Contenu de la bibliothèque ID cible par séquençage Illumina.

Tableau 4

Tableau 4. MiR-373 cibles choisies par séquençage Illumina.

les/ftp_upload/3303/3303table5.jpg "alt =" Tableau 5 "/>

Tableau 5. 10 cibles préalablement identifiées par l'ARN microarray.

Discussion

microARN sont des ARN 20-24 nucléotides qui régulent l'expression génique post-transcriptionnelle par inhibition de la traduction des ARNm, et souvent, la déstabilisation de l'ARNm ciblé (revue dans [6]). Un seul miARN peuvent réguler plusieurs centaines ARNm pour contrôler la réponse d'une cellule à signaux développement et d'environnement. Identifier et valider les ARNm cibles est essentielle pour déterminer le rôle d'un miARN et de la fonction dans ces voies. Cependant, l'identification des cibles n'est pas simple parce que, chez les animaux, les miRNAs et de leurs sites cibles ne sont pas tout à fait complémentaire. La «graine» région, fonde 2 à 7 de l'extrémité 5 'du miRNA, est généralement complémentaire à ses objectifs. Cependant, il ya de nombreuses exceptions à la règle de semences, et en aval d'appariement de bases peut compenser pour un match de semences imparfaite. Un certain nombre d'algorithmes informatiques ont été développés pour prédire les cibles des miRNA sur la base de correspondance de semences et de compensation en aval, la structure cible d'unla position d, conservation de la séquence, et divers autres paramètres qui ont été observées pour des cibles validées expérimentalement (revue dans [7]). Bien que les prédictions in silico sont pratiques et permettent d'identifier de nombreuses cibles des miRNA valides, la plupart des gènes prédit échouent aux tests de validation expérimentale, et de nombreux objectifs réels ne sont pas prévues. En outre, parce que les algorithmes informatiques sont basés sur les caractéristiques cibles préalablement déterminées, elles ne permettent pas de découverte de cibles qui s'écartent de ce qui est déjà connu.

Un certain nombre de systèmes expérimentaux ont été utilisés avec succès pour identifier ou de découvrir des cibles des miRNA fonctionnels dans les cellules vivantes. Ces méthodes de dépistage mondiaux comprennent les microréseaux et séquençage de l'ARN, l'ARN co-immunoprécipitation (RIP), et l'étiquetage des isotopes stables avec les acides aminés en culture cellulaire (SILAC), une méthode protéomique (revue dans [7]). Chaque méthode a ses avantages et ses inconvénients. Depuis miARN ciblant déstabilise souvent un ARNm et conduit à sa dégradation, la perte ogain de r dans le niveau d'ARNm après l'introduction d'un miRNA imiter ou d'un inhibiteur, respectivement, peuvent identifier les cibles des miRNA. Cette perte ou le gain de l'ARNm est facilement détectée par puces à ADN ou par séquençage en profondeur. Bien que les méthodes de détection d'ARNm sont plus simples et plus sensible que les méthodes de détection de protéines, de détection d'ARNm va manquer les cibles des miRNA qui ne sont pas dégradées. Des rapports récents du laboratoire Bartell comparant les résultats cibles des miRNA de détection de l'ARN avec ceux de SILAC [8] ou le profilage des ribosomes [9] indiquent que les miRNAs mammifères principalement agissent en réduisant les niveaux d'ARNm cibles. Cependant, de nombreux autres laboratoires qui travaillent avec des objectifs individuels miARN ont détecté le changement dans la protéine, mais aucun changement dans le niveau d'ARNm. Rapports de ce qui semble être régulation de la traduction sans perte ARNm détectable comprennent: miR-10b sur HOXD10 [10], miR221/222 sur p27kip1 [11], miR-21 sur Pdcd4 [12], miR-126 sur p85β [13] , miR-34 sur SIRT1 [14], miR-21 sur PTEN [15], miR-302d sur Arid4b [16], miR-200c sur JAG1 [17], et miR-299, 297, 567, une 609 sur VEGFA [18]. En outre, Clancy et al [19] a récemment rapporté que la réglementation en translation par let-7 a été détectée lorsque isoformes d'ARNm individuels qui contiennent le site let-7 ont été détectés cible de manière sélective. Celui-ci suggère que, au moins dans certains cas, régulation de la traduction peut être négligé dans un profil composite - qui est, lorsque toutes les isoformes d'ARNm sont détectés comme un ARNm - obtenue avec un microréseau nombreux et analyses de séquences. Co-immunoprécipitation des miARN-ARNm complexes via Argonaute (généralement Ago2) ou d'une autre protéine associée (ARN immunoprécipitation, ou RIP) permet d'isoler les cibles des miRNA indépendamment du mécanisme de règlement. En outre, RIP détecte endogène, et probablement biologiquement pertinente, les interactions. Cependant, on ne sait pas si toutes les interactions miARN-ARNm sont fonctionnels, et RIP serait manquer aucun ARNm cibles qui associent uniquement de façon transitoire ou sont rapidement dégradées. En outre, spécifiques miARN-ARNm des partenaires doit être déduite bioinformatiment parce que toutes les paires de miARN-ARNm co-précipités ensemble. Enfin, SILAC identifie directement le produit final de la réglementation miRNA, la protéine elle-même, mais elle est insensible et manque donc de protéines rares et de petits changements de pliage dans les taux de protéines.

À la lumière des limites des méthodes actuelles d'identification des miRNA cibles, nous nous sommes sentis un test global supplémentaire pour identifier les cibles des miRNA fonctionnelles par un autre mécanisme a été nécessaire. Pour répondre à ce besoin, nous sous licence une technologie inventée par Joop Gaken et Azim Mohamedali du Kings College de Londres. Leur invention est une protéine de fusion double sélection, en particulier, une thymidine kinase-zéocine fusion, régie par une banque d'ADNc de séquences cibles potentielles de miARN dans son 3'UTR. Les cellules transfectées de façon stable avec et exprimant TKzeo-ADNc constructions peuvent être sélectionnés avec la zéocine, comme illustré dans la figure 2. Après avoir exprimé un miRNA d'intérêt, les objectifs que miARN peuvent être sélectionnés wie ganciclovir, comme l'illustre la figure 3. Ganciclovir tue les cellules exprimant la thymidine kinase, qui est, toutes les cellules exprimant TKzeo-ADNc défaut une cible pour la miARN d'intérêt. Ciblée d'ADNc peut être isolé par amplification par PCR de l'ADN à partir de cellules qui survivent au ganciclovir en utilisant des amorces qui flanquent les produits d'ADNc et la PCR peut être séquencés pour identifier les cibles.

Nous avons développé une technologie Collège du Roi dans un nouvel outil pour l'identification globale et la découverte de cibles fonctionnelles miRNA humains - la Bibliothèque ID MISSION cible. Avec la Bibliothèque ID cible, les utilisateurs peuvent isoler des cibles des miRNA par une série de transfection de culture cellulaire de mammifère et des mesures de sélection des médicaments. La bibliothèque est complète, et contient 66-79% des gènes humains. Les premiers résultats indiquent que les deux précédemment découvert ainsi que de nouvelles cibles peuvent être isolés de la Bibliothèque ID MISSION cible.

Bien que le protocole est d'une certaine longueur,l'utilisation de la Bibliothèque ID cible nécessite des techniques standard de laboratoire moléculaires - culture cellulaire de mammifère, la transfection, la sélection des médicaments, la PCR et le séquençage - et, par conséquent, devraient être bien dans les moyens de la plupart des biologistes. Nous suggérons qu'une attention suffisante soit accordée à la conception expérimentale proprement dite, l'optimisation des conditions de culture, et surtout, de pré-tester chaque nouveau type de cellule pour déterminer les niveaux de médicaments optimales pour les étapes de sélection (kill-courbes) pour assurer le succès avec la Bibliothèque ID cible.

Comme avec les méthodes d'identification des miRNA tous les cibles, il est fortement recommandé que les objectifs identifiés par criblage de la bibliothèque ID cible être validée par une deuxième méthode, tels que puces, qRT-PCR, test rapporteur (c.-à-luciférase), ou l'analyse de l'Ouest.

Disclosures

Les auteurs déclarent des relations financières avec des entités commerciales qui ont un intérêt dans le travail présenté.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier toute la vie Sigma sciences cible Mission ID développement équipe de la Bibliothèque, en particulier Kevin Gutshall pour trouver la technologie et de la négociation des conditions de licence, et Heather Holemon pour son soutien et la participation à des discussions fructueuses de dépannage. Nous remercions également le Dr Joop Gäken du Kings College de Londres pour partager librement les résultats non publiés et des suggestions, et Qazi Hamid RxBiosciences pour la préparation d'un lot de grande ADNc et sa persistance à l'obtenir cloné. Nous tenons à remercier Nan Lin et Scott Bahr de SAFC pour effectuer des puces à ADNc et l'analyse des données.

MISSION est une marque déposée de Sigma-Aldrich Biotechnology LP

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JumpStart REDTaq ReadyMix Sigma-Aldrich P0982
Ganciclovir Sigma-Aldrich G2536
G418 Sigma-Aldrich G8168
Puromycin Sigma-Aldrich P9620
Topo TA Invitrogen KNM4500-01
GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit Sigma-Aldrich G1N10
Cell Specific Nucleofection kit Lonza Inc.
Nucleofector Lonza Inc. AAD-1001
Zeocin Invitrogen R250-01
Target ID Library Sigma-Aldrich MREH01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Target ID Library Technical Bulletin, Catalog # MREH01. [Internet]. , Sigma Aldrich. St Louis. Available from: http://www.sigma-aldrich.com (2012).
  2. Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis. Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).
  3. Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells. Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).
  4. Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).
  5. Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).
  6. Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).
  7. Thomas, M. Desperately seeking microRNA targets. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).
  8. Baek, D. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).
  9. Guo, H. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).
  10. Ma, L. Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer. Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).
  11. Visone, R., et al. MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle. Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).
  12. Lu, Z., et al. MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene. Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).
  13. Guo, C., et al. The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers. Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).
  14. Yamakuchi, M., et al. miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).
  15. Wickramasinghe, N. S., et al. Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells. Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 Forthcoming.
  16. Ciaudo, C., et al. Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation. PLoS Genetics. 5, e1000620 (2009).
  17. Vallejo, D. M., et al. Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells. EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).
  18. Jafarifar, F., et al. Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP. L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).
  19. Clancy, J. L., et al. mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation. RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).

Tags

Génétique Numéro 62 ID cible miRNA ARNnc RNAi la génomique
L&#39;échelle du génome d&#39;écran pour cibles des miRNA l&#39;aide de l&#39;ID de bibliothèque MISSION cible
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Coussens, M. J., Forbes, K.,… More

Coussens, M. J., Forbes, K., Kreader, C., Sago, J., Cupp, C., Swarthout, J. Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library. J. Vis. Exp. (62), e3303, doi:10.3791/3303 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter