Summary
ספריית מזהה היעד הוא פלסמיד מבוסס, הגנום כולו אוסף של cDNA משובטים לשמש לזיהוי מטרות מירנה. כאן אנו מדגימים את השימוש והיישום.
Abstract
ספריית מזהה יעד נועד לסייע מטרות גילוי וזיהוי של microRNA (מירנה). ספריית מזהה היעד הוא פלסמיד מבוסס, הגנום כולו ספריית cDNA משובטים לתוך הזרם 3'UTR של חלבון מבחר כפול היתוך, תימידין קינאז-zeocin (TKzeo). הסיבוב הראשון של הברירה היא transformants יציבות, ואחריו עם הקדמה של מירנה עניין, ובסופו של דבר, בחירה עבור cDNAs המכילים היעד של מירנה. CDNAs נבחרים מזוהים על ידי רצף (ראה איור 1-3 עבור זרימת עבודה מזהה ספריית היעד לפרטים נוספים).
כדי להבטיח כיסוי רחב של transcriptome האנושי, יעד מזהה ספריית cDNAs נוצרו באמצעות תחול oligo-DT באמצעות מאגר של RNA הכל מוכן מרקמות אדם מספר רב של שורות תאים. וכתוצאה מכך מגוון cDNA מ 0.5 עד 4 קילו, עם גודל ממוצע של 1.2 קילו, והיו משובטים לתוך כפול מבחר p3TKzeo פלסמיד (ראה איור 4 על מפת הפלסמיד). הגן מטרות המיוצגות library ניתן למצוא באתר האינטרנט Sigma-Aldrich. תוצאות Illumina רצף (לוח 3), עולה כי הספרייה כולל 16,922 של 21,518 גנים ייחודיים UCSC RefGene (79%), או 14,000 גנים עם 10 או יותר קורא (66%).
Protocol
1. Transfection עם ספריית היעד מזהה בחירה של שורות תאים יציבות
1. Zeocin Curve Kill
Zeocin משמש כדי לבחור עבור תאים transfected ביציבות. עם זאת, zeocin עודף גורם לתגובות לא רצויות פנוטיפי של סוגי תאים ביותר. לכן, ניתוח עקומת ה-kill יש לבצע להקים מנה קטלנית המינימום.
- צלחת 1.6 x 10 4 תאים לתוך הבארות של צלחת 96-טוב ב 120 μl של התקשורת.
- למחרת להוסיף zeocin להגדיל ריכוזים הנעים בין 50 מיקרוגרם / מ"ל ל 1 מ"ג / מ"ל על בארות המתאימים.
- לבחון את כדאיות כל 2 ימים.
- החלף התקשורת המכילים zeocin כל 3 ימים. ריכוז מינימלי של מגיב בחירת הגורם מוות של תאים מלאה לאחר השעה הרצויה יש להשתמש עבור אותו סוג תא הניסוי. התוצאות שלנו מראות כי 500 מיקרוגרם / מ"ל zeocin הוא האופטימלי עבור A549, הלה MCF7 תאים.
2.ספריית transfection דרך Nucleofection ו בחירה
- בחר תא בשורה או לא להביע או מבטא רמות נמוכות של מירנה העניין שלך. מירנה יושקו בחלק ב 'של בחירת היעד לאחר ביטוי יציב של ספריית מזהה מטרה מושגת.
- תרבות / להרחיב תאים. השגנו תוצאות מצוינות עם 2 x 10 -7 תאים לכל transfection הספרייה.
- Trypsinize תאים הנמצאים ב> 80% confluency, ולהעביר 2 x 10 -7 תאים כמה צינורות 15 מ"ל בורג סטריליים מצופים.
- גלולה trypsinized תאים ב XG 200 דקות 5.
- הסר בינוני לשטוף את התא גלולה עם HBSS או 1X PBS.
- סרכזת ב XG 200 דקות 5 ו לשאוב הכביסה.
- חזור על לשטוף את השלב של התא גלולה.
- טרום חמים 6-גם צלחות עם 2 מ"ל של מדיום שלם ב 37 מעלות ג
- הוסף 2 מיקרוגרם של ספריית היעד מזהה (שלא יעלה על 10 μl) לכל צינור 0.5 מ"ל עבור transfection כל אחד.
- תאים Resuspend של צינור 15 מ"ל מלמעלה עם μl 100 הפתרון Nucleofection Amaxa (תאים ספציפיים) עבור 2 x 10 6 תאים. לדוגמה, במשך 10 Nucleofections להוסיף 1 מ"ל של ריאגנט.
- תגובה אחת בכל פעם, להוסיף 100 μl של תאים כדי מיקרוגרם 2 של הפלסמיד. מערבבים עם טפטפת.
- להעביר את התערובת קובט Nucleofector.
- הכנס קובט לכלי Nucleofector ולהפעיל תוכנית אופטימיזציה מתאימה לקו הנייד (יעילות גבוהה עדיף על כדאיות התא).
- מלאו פיפטה עם העברת בינוני מחומם מראש. קח את התאים פיפטה אותו ולהעביר לצלחת 6 היטב. חזור על הפעולה עבור כל Nucleofection, אחת בכל טוב.
- חזור אל החדר הצמיחה הדגירה לילה.
- למחרת, להחליף בינוני ולאפשר לתאים להתאושש במשך 3-5 ימים.
- החלף בינוני עם בינוני מלאה המכילה רמה נאותה של zeocin, כפי שנקבע על פי ניתוח עקומת ה-kill.
- מוnitor תאים לבחירת zeocin (תאים מתים).
- החלף בינוני עם zeocin כל 2-3 ימים.
- Confluent פעם 6-ובכן, בריכת צלחת, מעבר ולהרחיב את התאים צלוחיות גדולות יותר.
- משך הזמן להרחבת תאים הוא משתמש בקו התא תלוי, אבל מומלץ מאוד להרחיב תאים עמידים zeocin ליצור cryo-מניות להקרנה בעתיד (~~~HEAD=NNS 2-3 שבועות, תלוי בקו התא).
2. תאים Transfect ספריה Construct מירנה ביטוי, בחר את שורת תאים יציבה, לבחור מטרות מירנה
הערה: בחירת Zeocin ואין עוד צורך או הרצוי. חשיפה של תאים כדי zeocin במהלך הביטוי מירנה ובחירת ganciclovir (היעד) עלול לגרום לאובדן של מטרות מירנה.
3. Puromycin, G418, ועיקולים, רצח Ganciclovir
- לבצע עיקול להרוג בשביל ganciclovir עם תאים ביציבות להביע ספריית מזהה מטרה ועם puromycin או G418 עבור סוג בטבעתאים.
- צלחת 1.6 x 10 4 תאים לתוך בארות צלחת 96-היטב עם Media 120 μl טריים. למחרת להוסיף בין 0.1 ל 10 מיקרוגרם / מ"ל של puromycin/G418, או 2 עד 32 מיקרומטר ganciclovir לבארות שנבחרו.
- לבחון את כדאיות כל 2 ימים. החלף את המדיה המכילים מגיב מבחר כל 3 ימים. ריכוז מינימלי של מגיב הבחירה שגורמת * מלאה מוות של תאים לאחר השעה הרצויה, יש להשתמש עבור אותו סוג תא הניסוי. התוצאות שלנו מראות כי 0.25-1 מיקרוגרם / מ"ל puromycin הוא האופטימלי עבור A549, הלה MCF7 תאים, 0.3 מיקרוגרם / מ"ל G418 עבור MCF7 תאים 8-16 מיקרומטר ganciclovir הם האופטימלי עבור A549, הלה MCF7 תאים.
* הערה: כאשר בוחרים אפשרות ganciclovir, צמיחת תאים איטית, אם בכלל, אפשר לראות בלי מוות של תאים מלאה. שימו לב תאים על טיפול של כמה ימים כדי לוודא שהם לא פעיל לחלק. אם זה המקרה אז פנול אדום בתווך נותר אדום. זה יכול להיות גם צורך לבצע קיניתוח עקומת LL הספרייה מזהה יעד transfected תאים אם שינוי הרגישות הוא ציין. עם זאת, זה צריך להיקבע על בסיס תאים מסוג מסוים.
4. מירנה transfection דרך Nucleofection ואת בחירת יעד
- לגדול / להרחיב את זהות היעד תאים ספריית להשיג 2 x 10 -7 תאים, trypsinize כאשר תאים נמצאים> 80% confluency.
- העברת 2 x 10 -7 תאים לדפוק 15 מ"ל סטרילי עקף הצינור גלולה ב XG 200 במשך 5 דקות.
- הסר בינוני לשטוף את התא גלולה עם HBSS או 1X PBS.
- סרכזת ב XG 200 דקות 5 ו לשאוב הכביסה.
- חזור על לשטוף את השלב של התא גלולה.
- טרום חמים 6-גם צלחות עם 2 מ"ל של מדיום מלאה לכל גם ב 37 מעלות ג
- הוסף 2 מיקרוגרם הביטוי מירנה צינור פלסמיד (שלא יעלה על 10 μl) עבור 0.5 מ"ל עבור transfection כל אחד. MicroRNA Origene הביטוי פלסמידים (neomycin - G418 מבחר) או גנים מירנה עצמית משובטים ב-pBABE Puro (פלסמיד 1764; Addgene) שימשו בהצלחה. באפשרות השנייה, סיכת ראש עם מירנה ~~~HEAD=NNS 200 נ"ב משני הצדדים היה PCR לשכפל מ-DNA האנושי.
- תאים Resuspend של צינור 15 מ"ל מלמעלה עם μl 100 הפתרון Nucleofection Amaxa (תאים ספציפיים) עבור 2 x 10 6 תאים. לדוגמה: עבור 10 Nucleofections, הוסף 1 מ"ל של ריאגנט.
- תגובה אחת בכל פעם, להוסיף 100 μl של תאים כדי מיקרוגרם 2 של הפלסמיד. מערבבים עם טפטפת.
- להעביר את התערובת קובט Nucleofector.
- הכנס קובט לכלי Nucleofector ולהפעיל תוכנית אופטימיזציה מתאימה לקו הנייד (יעילות גבוהה עדיף על כדאיות התא).
- מלאו פיפטה עם העברת בינוני מחומם מראש. קח את התאים פיפטה אותו ולהעביר לצלחת 6 היטב. חזור על הפעולה עבור כל Nucleofection, אחת בכל טוב.
- חזור אל החדר הצמיחה הדגירה לילה. <li> החלף בינוני ולאפשר לתאים להתאושש במשך 3-5 ימים.
- החלף בינוני עם בינוני מלאה המכילה רמה נאותה של puromycin או G418 כפי שנקבע על פי מבחן עקומת להרוג ביצע לפני transfection עם מירנה לבנות.
- מעקב אחר התאים לבחירת puromycin / G418 (תאים מתים).
- החלף בינוני עם puromycin / G418 כל 2-3 ימים.
- Confluent פעם 6-ובכן, בריכת צלחת, מעבר ולהרחיב את התאים צלוחיות גדולות יותר.
- משך הזמן להרחבת תאים למשתמש תלוי, אבל מומלץ מאוד להרחיב puromycin / G418 תאים עמידים ליצור cryo-מניות להקרנה בעתיד (~~~HEAD=NNS 2-3 שבועות, תלוי בקו התא).
- החלף בינוני עם רמות מתאימות של ganciclovir (GCV) ו puromycin / G418, כפי שנקבע על פי מבחן עקומת להרוג ביצע לפני transfection עם מירנה לבנות.
- מעקב אחר התאים לבחירה (תאים הולך למותגרם, מירנה מיקוד מציאה של TK-ZEO).
- להרחיב את התאים בנוכחות GCV puromycin ו / G418.
- הכן את הדנ"א הגנומי מהתאים הנבחרים GCV.
- PCR להגביר מוסיף עם ערכת primers (ראה הגברה PCR).
- Clone לתוך וקטור TOPOTA (Invitrogen) עבור סידור רגיל או להגיש מוצר ה-PCR עבור סידור עמוק.
3. PCR-להגביר ספריית הוספת נבחרים ורצף
הערה: הליך זה מבוצע על PCR-להגביר את מטרות הספרייה ששרדו את הסלקציה ganciclovir.
5. איסוף התאים שנבחרו ganciclovir להכין DNA כרומוזומלי באמצעות GenElute היונקים הדנ"א הגנומי Miniprep Kit (מס 'קטלוגי G1N10) או שווה ערך. אנו ממליצים על הכנת ה-DNA מהקו הורה תא שאינו מכיל מזהה ספריית היעד להשתמש כביקורת שלילית להשוואה עם ה-DNA מתאי היעד שנבחרו ב-PCR.
- PCR Amplify הדנ"א הגנומי עם פריימר הגברה 1 ו פריימר הגברה 2. הגברה מוצלח התקבל בתערובת התחלה מהירה רדימיקס תגובה REDTaq - על PCR (מס 'קטלוגי P0982). אופטימיזציה של התנאים שיידרשו אם עוד פולימראז משמש. עיין בטבלה 1 להתקנה מדגם PCR ולוח 2 התנאים ה-PCR אופניים.
- לפתור 2-5 μl של מוצר ה-PCR על ג'ל agarose 1%. המוצר צפוי להיות כתם עם כמה רצועות DNA גלוי. השווה לשלוט מוצר ה-PCR של DNA גנומי מתאי ללא ספריית מזהה מטרה.
- להמשיך שיבוט ו / או רצף עמוק של מוצר ה-PCR. אם אין מוצר הגברה הוא ציין או זהה לשלוט DNA, לייעל את התנאים הגברה PCR (כלומר, ריכוז פריימר, הטמפרטורה חישול, מחזורי).
6. שיבוט וסדר
הערה: מומלץ מאוד השיבוט מוצר ה-PCRs ולאחר מכן ביצוע רצף רגיל של לפחות 96 של שיבוטים באמצעות primers הגברה המסופקים בערכה. הליך זה שבוצעה בהצלחה באמצעות 96 היטב תרבויות לילה ומערכות טיהור פלסמיד. גם אם רצף עמוק הוא הרצוי, תוצאות ראשוניות של השיבוט רצף רגיל יכול לשמש כבדיקה איכות כדי לקבוע אם הוצאה נוספת של רצף עמוקה היא מוצדקת.
- עקוב פרוטוקול ת"א ערכה של שיבוט וייצור של מוצרי ה-PCR שיבוט הגברה (לעיל).
- להפוך שיבוטים לתוך תאים חיידקיים המוסמכות ובחר לילה על מצע המכיל אנטיביוטיקה.
- לבודד ולגדל מושבות בודדים בתרבות נוזל המכילים אנטיביוטיקה מתאימה.
- לטהר את הדנ"א פלסמיד. 6.5. בצע תגובות רצף עם primers הגברה.
- לזהות מטרות הגן על ידי יישור פרץ של רצפים עם transcriptome האנושי (על תמלילי ידועים) ואת הגנום האנושי (על הרומן TRanscripts) *.
* שיבוט פתרון בעיות: אם מספר גבוה של מוסיף רצף של הם רצף הפלסמיד, לייעל את שיבוט / רצף התנאים ככזה:
- מוצר ה-PCR הגברה (הוספה) איכות וכמות
- קשירת התגובה
- הכנה פלסמיד (איכות וכמות)
- רצף התנאים התגובה
4. נציג תוצאות
ספריית המסך miR-373 יעדים
כדי להעריך את הביצועים של ספריית היעד Mission מזהה, miR-373 מטרות נבחרו מתוך MCF-7 תאים המבטאים הספרייה. MCF-7 נבחר משום שהוא מבטא מעט או ללא לגילוי miR-373 (מידע לא מוצג). miR-373 נבחר על ההתעניינות הביולוגי שלה. miR-373 הביטוי מקדם הפלישה גרורות ב MCF-7, בדרך כלל קו שאינו גרורתי תא [2]. יתר על כן, miR-373 orthologues של העכבר miR-290 באשכול מעורבים העכבר גזע עוברייםתחזוקת התא [3], ו miR-373 בן משפחה, miR-372, מקדם פיברובלסטים תכנות מחדש לתאי גזע המושרה גזע pluripotent [4]. לבסוף, השתמשנו אצבע אבץ nucleases להוסיף PGK האמרגן-miR-373 ביטוי לבנות את האתר AAVS1 ב MCF-7 תאים, שנוצר רשימה של miR-373 מטרות פוטנציאליות על ידי ניתוח microarray RNA (מידע לא מוצג).
ספריית מזהה היעד היה transfected אל MCF-7 תאים, אוכלוסייה יציבה של תאים נבחרה ומתעצם בינוני zeocin המכיל. התאים וכתוצאה מכך (MCF-7 Library) היו transfected ביציבות עם מבנה miR-373 להביע נבחרים במדיום ganciclovir המכיל להעשיר את התאים המבטאים miR-373 מטרות. הבחנו כי הביקורת השלילית MCF-7 תאים הספרייה (ללא miR-373) לא לנתק ולהיות מעוגלות כצפוי עבור תאים מתים. עם זאת, הם לא מפסיקים לגדול, אשר זוהתה בקלות בשל בינוני פנול אדום המכיל לא הפך כתום צהוב כפי שנצפה FOR-תאים המבטאים miR-373 (איור 5). הורחבו התאים במדיום המכיל ganciclovir, ואת רצפי היעד בודדו על ידי PCR עם פריימרים משני צדי מזהה היעד ספריית מוסיף cDNA ו-DNA שהוכנו מהתאים ששרדו. מוצרי ה-PCR היו Illumina רצף.
כפי שניתן לראות בלוח 4, השגנו 17740719 כניסות cDNA, אשר ממופה 11,076 גנים ייחודיים. אלה גנים ייחודיים, 2898 התגלו עם יותר מ 40 כניסות, ולכן נחשבו להיטים אמינים. וקטור 13106469 קורא ציפו כי primers ה-PCR נעשה שימוש כדי להגביר מוסיף cDNA הם 40 ו - 300 בסיסים מאתר הכנסת. לפיכך, צפוי כי רצפים המתקבלות ביותר יהיה בין וקטור בניגוד רצף יותר עמוק המסורתי של חומר גנטי. ארבע עשרה אחוזים לא ממופים וקטור או cDNA, אבל לא להתיישר עם מסד הנתונים של צמח השדה הלא מיותר נוקלאוטידים (כלומר, עם הלהיט ע"נ), ורק 1% לא להוסיף cDNA.
השוואה ראשונית נמצא כי 10 מהגנים ייחודיים המזוהים עם ספריית קוד זיהוי יעד גם ברשימת miR-373 מטרות שזוהו בעבר TarBase (לוח 5). 10 אלה miR-373 מטרות זוהו בעבר עם RNA על ידי microarray מתאי הלה transfected זמני עם סינתטי miR-373 לחקות [5]. יתר על כן, זיהינו אלה אותם 10 גנים למטה מווסתת MCF-7 תאים המבטאים miR-373 מאתר AAVS1 (מידע לא מוצג). לכן, אלה הם מטרות חוקיות 10 האפשריות של miR-373. העבודה מתבצעת לאפיין רשימה של יעדים פוטנציאליים, ומנסים לאמת להיטים שנבחרו באופן ניסיוני על ידי RT-QPCR, מערב כתם, וכן כתב בלוציפראז assay.
באיור 1. זרימת עבודה עבור ספריית מזהה מטרה. סעיפים AC: עיינו בסעיפים בהליך. כל צעד מודגם ותיאר בפרוטרוט
איור 2. Transfection ובחירת Zeocin. ספריית מזהה היעד הוא מאגר של פלסמידים (א '), כל אחד עם cDNA אדם מוכנס לתוך 3'-UTR אחרי חלבון תימידין קינאז zeocin-Fusion (TKzeo, איור 4). תאים transfected עם יעד מזהה הספרייה (ב ') ואיפשר להתאושש במשך 3-5 ימים. בונה יכול להשתלב בגנום בתקופה זו התאוששות (C), ולהביע את התמליל מקודד (ד '). לאחר התאוששות, התאים נחשפים zeocin (ה). התאים המבטאים את החלבון היתוך TKzeo מ ביציבות בונה זהות משולבים היעד לשרוד הבחירה zeocin (F). תאים Untransfected למות (G). בנוסף, תאים המכיל את כל מבנה שהוא יעד מירנה אנדוגני או כל othגורם אה לידי ביטוי התא מעכב ביטוי TKzeo מ מזהה מטרה לבנות ימותו (H).
באיור 3. Transfection מירנה ובחירת ganciclovir. תאים המכילים יעד מזהה הספרייה (כלומר, zeocin שנבחרו תאים) הם transfected עם הביטוי microRNA לבחירה לבנות (). במהלך השחזור, מבנה ביטוי מירנה יכול לשלב (ב ') להביע את הסמן לבחירה מקודד על מירנה לבנות. לאחר הבחירה לשילוב יציבה (C) והרחבת התא, תאים מטופלים עם ganciclovir (ד '). תאים המייצרים תימידין קינאז (TK) בנוכחות ganciclovir (כלומר, תאים להביע TKzeo לא בונה על הכוונת של מירנה) ימותו (ה) לעומת זאת, תאים המכילים בונה ספריה עם יעד של מירנה ites לא ייצרו TK, ועל כן, ישרוד הבחירה ganciclovir (F). התאים ששרדו ניתן לגדל, gDNA מבודד, ואת cDNA המכילים היעד אתרי מירנה PCR-הגברה באמצעות מזהה היעד primers הגברה. מוצרי ה-PCR יכול להיות רצף ולא מתואם עם הגנום האנושי כדי לזהות מטרות מירנה.
איור 4. מפת פלסמיד ומיקום primers הגברה. אני SFI הם האתרים של שיבוט cDNA.
פריימר רצפים
יעד המשימה מזהה הגברה פריימר 1
5 ACGACGTGACCCTGTTCATC 3
יעד המשימה מזהה הגברה פריימר 2
5 TAAAACGACGGCCAGTGAAT 3
ig5.jpg "alt =" איור 5 "/>
איור 5. Ganciclovir השפעה על גדילת התאים. עשרים וארבע צלחות גם היו זרע עם 2-100000 MCF-7 תאים או MCF-7 תאים המכילים ספריית מזהה מטרה. עשרים וארבע שעות לאחר מכן, המדיום הוחלף בינוני המכיל 0, 8 או 16 מיקרומטר ganciclovir. לאחר 15 ימים, את הצלחת צולם (6 בארות העליונות), ואז את בארות שטופים עם HBSS ומוכתמים פתרון מבריק R כחול מכתים (B6529) (6 בארות נמוכות). שים לב ganciclovir אין כל השפעה על MCF-7 תאים ללא ספריה, כי הם אינם מבטאים תימידין קינאז (TK). לעומת זאת, MCF-7 תאים ספריית מבטאים TK אבל לא נהרגים לחלוטין בגיל 8 או 16 מיקרומטר ידי ganciclovir, כפי שמוצג על ידי תאים חיים תופסים Brillinat כחול. עם זאת, התאים ספריית מפסיקים הגוברת ganciclovir, כפי שבא לידי ביטוי בצבע של צבע אדום פנול במדיום שלהם. התאים שנעצרו לא להפוך לחומצה בינוני שלהם, והצבע נשאר אדמדם במקום לשנות אוange-צהוב.
| מגיב | נפח / תגובה |
| Jumpstart REDTaq רדימיקס תערובת תגובה | 10 μl |
| הגברה פריימר 1 (25 מיקרומטר) | 0.2 μl |
| הגברה פריימר 2 (25 מיקרומטר) | 0.2 μl |
| ה-DNA הגנומי | 50-200 ng |
| , מים מולקולרית כיתה | כדי μl 20 |
טבלה 1.
| שלב | Temp. | זמן | מחזורי |
| ראשוני denaturation | 95 ° C | 5 דקות. | 1 |
| Denaturation | 95 ° C | 30 שניות. | פאן = "3"> 40 מחזורים |
| חישול * | 62 ° C | 30 שניות. | |
| הארכה | 68 ° C | 2 דקות. | |
| סופי הרחבה | 68 ° C | 5 דקות. | 1 |
| להחזיק | 4 ° C | להחזיק |
טבלה 2.
* Quick בטמפרטורות חישול עשוי להשתנות, אבל ראינו את המוצרים הטובים ביותר הגברה עם טמפרטורות הנעות בין חישול 53 עד 64 ° C.
3. לוח יעד מזהה ספריית תוכן לפי רצף Illumina.
לוח 4. MiR-373 מטרות שנבחרו על ידי רצף Illumina.
les/ftp_upload/3303/3303table5.jpg "alt =" לוח 5 "/>לוח 5. 10 מטרות שזוהו בעבר על ידי RNA microarray.
Discussion
מיקרו RNA הם 20-24 RNAs נוקלאוטיד המווסתים ביטוי גנים לאחר תעתיק של התרגום מעכב mRNA, ולעתים קרובות, ערעור היציבות mRNA ממוקד (בדיקה ב [6]). מירנה אחד יכול לווסת כמה מאות mRNAs לשלוט התגובה של התא אותות התפתחותיים וסביבתיים. זיהוי ואימות mRNAs יעד הכרחי בקביעת התפקיד של מירנה ותפקוד במסלולים אלה. עם זאת, זיהוי המטרה היא לא פשוטה, כי אצל בעלי חיים, miRNAs ואתרי היעד שלהם הם לא משלים באופן מלא. "הזרע" באזור, מבסס 2 עד 7 מסוף 5'-של מירנה, הוא בדרך כלל משלים מטרותיו. עם זאת, יש הרבה יוצאים מן הכלל זרע, במורד בסיס ההתאמה יכול לפצות על התאמה מושלמת זרע. מספר אלגוריתמים פותחו לחזות מטרות מירנה על בסיס התאמה זרע ופיצוי במורד הזרם, מבנה היעדעמדת D, שימור הרצף, ופרמטרים נוספים שונים נצפו על מטרות תוקף הניסוי (בדיקה ב [7]). בעוד סיליקו תחזיות נוח ולעשות רבות לזהות מטרות מירנה חוקיים, רובם חזו גנים להיכשל בדיקות אימות ניסיוני, ויעדים בפועל רבים אינם חזה. יתר על כן, מאז אלגוריתמים מבוססים על תכונות היעד שנקבעו קודם לכן, הם אינם מאפשרים גילוי של מטרות החורגות ממה שכבר ידוע.
מספר מערכות ניסיוניות שימשו בהצלחה לזהות או לגלות מטרות תפקודיות מירנה בתאים חיים. אלה שיטות ההקרנה גלובליים כוללים microarrays ו-RNA רצף, RNA שיתוף immunoprecipitation (RIP), וסימון איזוטופ יציב עם חומצות אמינו תרבית תאים (SILAC), שיטה proteomic (בדיקה ב [7]). לכל שיטה יש יתרונות וחסרונות. מאז מירנה מיקוד לעתים קרובות מערערת mRNA מוביל לזילות שלו, אובדן oרווח R ברמת mRNA לאחר החדרת מירנה לחקות או מעכב, בהתאמה, יכול לזהות מטרות מירנה. הפסד זה או רווח של mRNA מזוהה בקלות על ידי microarray או רצף עמוק. תוך גילוי שיטות mRNA הם פשוט רגישים יותר מאשר שיטות זיהוי חלבונים, זיהוי ה-mRNA יחמיץ שום מטרות מירנה שאינם מפורקים. דיווחים אחרונים של המעבדה Bartell השוואת יעד תוצאות מירנה מ איתור RNA עם אלה SILAC [8] או פרופיל הריבוזום [9] מצביעים על כך miRNAs יונקים בעיקר לפעול על ידי הפחתת רמות ה-mRNA המטרה. עם זאת, מעבדות רבים אחרים העובדים עם מטרות מירנה בודדים לא זוהה שינוי בחלבון אך לא חל שינוי ברמת ה-mRNA. דיווחים על מה שנראה תקנה translational ללא אובדן mRNA לגילוי כוללים: miR-10b על HOXD10 [10], miR221/222 על p27kip1 [11], miR-21 על Pdcd4 [12], miR-126 על p85β [13] , miR-34 על SIRT1 [14], miR-21 על PTEN [15], miR-302d על Arid4b [16], miR-200C על JAG1 [17], ו miR-299, 297, 567,nd 609 על VEGFA [18]. יתר על כן, קלנסי ואח' [19] לאחרונה דווח כי תקנה translational ידי בואו-7 התגלתה רק כאשר isoforms mRNA בודדים המכילים את האתר בואו-7 היעד התגלו באופן סלקטיבי. זה האחרון מצביע על כך, לפחות בחלק מהמקרים, רגולציה translational ניתן להתעלם בפרופיל מרוכבים - כלומר, כאשר כל isoforms mRNA מזוהים כמו mRNA 1 - כפי שנתקבל עם microarray רבים וניתוחים ברצף. שיתוף immunoprecipitation של מירנה-mRNA באמצעות מתחמי argonaute (בדרך כלל ago2) או חלבון אחר הקשור (RNA immunoprecipitation, או RIP) יהיה לבודד את מטרות מירנה ללא קשר מנגנון ויסות. בנוסף, RIP מזהה אנדוגני, ומן הסתם רלוונטי מבחינה ביולוגית, אינטראקציות. עם זאת, לא ידוע אם כל מירנה-mRNA אינטראקציות הם פונקציונליים, ולקרוע יחמיץ שום מטרות mRNA כי מקשרים רק זמני או מפורקים במהירות. יתר על כן, ספציפיים מירנה-mRNA שותפים יש להסיק bioinformatiקאלי משום שכל מירנה-mRNA זוגות שיתוף זירז יחד. לבסוף, SILAC ישירות מזהה את המוצר הסופי של התקנה מירנה, החלבון עצמו, אבל הוא לא רגיש ועל כן מתגעגע חלבונים נדירים ושינויים לקפל קטנים רמות החלבון.
לאור המגבלות הנוכחיות עם מירנה היעד שיטות הזיהוי, הרגשנו assay גלובלית נוספת כדי לזהות מטרות מירנה תפקודית על ידי מנגנון חלופי היה צורך. כדי למלא את הצורך הזה, אנחנו רישיון טכנולוגיה שהומצאה על ידי יופ Gaken ו עזים Mohamedali של לונדון בקינגס קולג'. ההמצאה שלהם הוא חלבון כפול היתוך הבחירה, באופן ספציפי, שילוב kinase-zeocin תימידין, מוסדר על ידי ספריית cDNA של פוטנציאל היעד רצפים מירנה ב 3'UTR שלה. תאים transfected ביציבות עם ולבטא TKzeo-cDNA בונה ניתן לבחור עם zeocin, כפי שמודגם באיור 2. לאחר הבעת עניין מירנה, מטרות של מירנה ניתן לבחור אינטרנטganciclovir ה, כפי שמודגם באיור 3. Ganciclovir הורג תאים להביע תימידין קינאז, כלומר, כל התאים לבטא TKzeo-cDNA חסר מטרה מירנה של עניין. ממוקד cDNA יכול להיות מבודד על ידי הגברה PCR של ה-DNA של תאים ששורדים primers באמצעות ganciclovir כי האגף מוצרים cDNA ו PCR יכול להיות רצף לזהות מטרות.
פיתחנו טכנולוגיה במכללת המלך לתוך כלי חדש לזיהוי הגילוי העולמי של מטרות תפקודיות מירנה אדם - יעד המשימה ספריית מזהה. עם הספרייה מזהה מטרה, משתמשים יכולים לבודד את מטרות מירנה על ידי שורה של transfection התרבות יונקים התא ובחירת צעדים סמים. הספרייה היא מקיפה, והוא מכיל 66-79% מכלל הגנים האנושיים. תוצאות ראשוניות מצביעות על כך גם גילה בעבר, כמו גם מטרות חדשות יכול להיות מבודד ספריית יעד המשימה מזהה.
אף על פי הפרוטוקול הוא באורך כלשהו,שימוש בספריית מזהה יעד מחייב תקן טכניקות מעבדה מולקולרית - תרבית תאים transfection יונקים,, בחירת התרופה, PCR, וסדר - ולכן, צריך להיות גם במסגרת האמצעים של רוב הביולוגים. אנו מציעים תשומת לב מספקת ישולם עיצוב ניסיוני נכונה, אופטימיזציה של תנאי התרבות, והכי חשוב, לפני בדיקה של כל סוג תא חדש כדי לקבוע רמות התרופה האופטימלי עבור צעדים הבחירה (kill של עקומות) כדי להבטיח הצלחה עם ספריית מזהה מטרה.
כמו בכל יעד מירנה שיטות הזיהוי, מומלץ מאוד כי מטרות שזוהו על ידי הקרנת ספריית מזהה מטרה להיות מאומת עם השיטה השנייה, כגון microarray, qRT-PCR, assay הכתב (כלומר, בלוציפראז), או ניתוח המערבי.
Disclosures
המחברים מצהירים יחסים כלכליים עם גורמים מסחריים בעלי עניין בעבודה שהוגש.
Acknowledgments
אנו מודים המדע כולו Sigma החיים המשימה יעד מזהה ספריית פיתוח צוות, במיוחד קווין Gutshall למציאת טכנולוגיה משא ומתן תנאי הרשיון, והת'ר Holemon על התמיכה שלה והשתתפות בדיונים לפתרון בעיות פוריות. כמו כן, אנו מודים לד"ר יופ Gäken של לונדון בקינגס קולג' בחופשיות על שיתוף שלא פורסמו התוצאות והצעות ו Qazi חמיד של RxBiosciences להכנת המנה הגדולה של cDNA וההתמדה שלו מקבל את זה משובטים. ברצוננו להודות נאן לין סקוט באהר מ SAFC לביצוע מערכי cDNA וניתוח נתונים.
המשימה הוא סימן מסחרי רשום של Sigma-Aldrich ביוטכנולוגיה LP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| JumpStart REDTaq ReadyMix |  Sigma-Aldrich |
P0982 | |
| Ganciclovir | Sigma-Aldrich | G2536 | |
| G418 | Sigma-Aldrich | G8168 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich |
P9620 | |
| Topo TA | Invitrogen | KNM4500-01 | |
| GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich |
G1N10 | |
| Cell Specific Nucleofection kit | Lonza Inc. | ||
| Nucleofector | Lonza Inc. | AAD-1001 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | |
| Target ID Library | Sigma-Aldrich | MREH01 |
References
- Target ID Library Technical Bulletin, Catalog # MREH01. [Internet]. , Sigma Aldrich. St Louis. Available from: http://www.sigma-aldrich.com (2012).
- Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis. Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).
- Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells. Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).
- Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).
- Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).
- Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).
- Thomas, M. Desperately seeking microRNA targets. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).
- Baek, D. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).
- Guo, H. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).
- Ma, L. Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer. Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).
- Visone, R., et al. MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle. Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).
- Lu, Z., et al. MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene. Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).
- Guo, C., et al. The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers. Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).
- Yamakuchi, M., et al. miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).
- Wickramasinghe, N. S., et al. Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells. Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 Forthcoming.
- Ciaudo, C., et al. Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation. PLoS Genetics. 5, e1000620 (2009).
- Vallejo, D. M., et al. Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells. EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).
- Jafarifar, F., et al. Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP. L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).
- Clancy, J. L., et al. mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation. RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).
