Genome-wide Screen for miRNA Targets Bruke MISSION Target ID Library

Summary

Målet ID Library er en plasmid-basert, genom-wide samling av klonet cDNA brukes til å identifisere miRNA mål. Her har vi demonstrere sin bruk og anvendelse.

Abstract

Målet ID Library er utviklet for å hjelpe i funn og identifisering av mikroRNA (miRNA) mål. Målet ID Library er en plasmid-basert, genom-wide cDNA bibliotek klonet inn i 3'UTR nedstrøms fra dual-utvalget fusion protein, tymidinkinase-zeocin (TKzeo). Den første runden av valget er for stabile transformants, fulgte med innføringen av en miRNA av interesse, og til slutt, velge for cDNAs inneholder miRNA mål. Valgte cDNAs identifiseres ved sekvensering (se figur 1-3 for Target ID Library Arbeidsflyt og detaljer).

For å sikre bred dekning av det menneskelige transkriptom ble Target ID Library cDNAs genereres via oligo-dT priming ved hjelp av en pool av total RNA forberedt fra flere menneskelige vev og cellelinjer. Resulterende cDNA varierer fra 0,5 til 4 kb, med en gjennomsnittlig størrelse på 1,2 kb, og ble klonet inn i p3TKzeo dual-utvalget plasmid (se figur 4 for plasmid kart). Genet målene representert i library kan bli funnet på Sigma-Aldrich nettside. Resultater fra Illumina sekvensering (tabell 3), viser at biblioteket inneholder 16 922 av de 21,518 unike gener i UCSC RefGene (79%), eller 14.000 gener med 10 eller flere leser (66%).

Protocol

1. Transfeksjon med Target ID Bibliotek og markering for Stabile cellelinjer

1. Zeocin Kill Curve

Zeocin brukes til å velge for stabilt transfekterte celler. Imidlertid fører overflødig zeocin uønskede fenotypiske responser i de fleste celletyper. Derfor må en kill kurve analyse utføres for å etablere minimum dødelig dose.

1. Plate 1.6 x 10 ⁴ celler i brønnene til en 96-brønns plate i 120 mL av media.
2. Dagen legge zeocin i økende konsentrasjoner fra 50 mikrogram / ml til 1 mg / ml til de aktuelle brønnene.
3. Undersøke levedyktigheten hver 2 dager.
4. Bytt medier som inneholder zeocin hver 3. dag. Minste konsentrasjon av utvalget reagens som fører komplett celledød etter ønsket tid bør brukes for at celletype og eksperiment. Våre resultater viser at 500 mikrogram / ml zeocin er optimal for A549, HelÃ, og MCF7 celler.

2.Bibliotek Transfeksjon via Nucleofection og utvelgelse

1. Velg en cellelinje som enten ikke uttrykke eller uttrykker lave nivåer av din miRNA av interesse. Den miRNA vil bli innført i seksjon B for mål utvalg etter stabil uttrykk for Target ID Library er oppnådd.
2. Kultur / utvide celler. Vi har oppnådd gode resultater med 2 x 10 ⁷ celler per bibliotek transfeksjon.
3. Trypsinize celler som er på> 80% confluency, og overføre 2 x 10 ⁷ celler til en 15 ml sterilt skrue toppet rør.
4. Pellet trypsinized cellene ved 200 xg i 5 min.
5. Fjern medium og vask cellepelleten med HBSS eller 1X PBS.
6. Sentrifuger ved 200 xg i 5 min og aspirer vask.
7. Gjenta vaske steg cellepelleten.
8. Pre-varme seks-brønns plater med 2 ml komplett medium ved 37 ° C.
9. Tilsett 2 mikrogram Target ID Library (må ikke overstige 10 mL) per 0,5 ml rør for hver transfeksjon.
10. Resuspender cellene i 15 ml tube fra over med 100 mL av Amaxa Nucleofection Solution (celle spesifikke) per 2 x 10 ⁶ celler. For eksempel for 10 Nucleofections legge til 1 ml av reagens.
11. En reaksjon gangen, tilsett 100 mL av celler til to mikrogram av plasmid. Bland med pipette.
12. Overfør blandingen til en Nucleofector kyvette.
13. Sett kyvetten inn Nucleofector instrument og kjøre optimalisert program hensiktsmessig for cellelinje (High Efficiency foretrekke fremfor celleviabilitet).
14. Fyll overføringspipetten med forvarmes medium. Ta opp celler i samme pipette og overføre til 6-brønnen plate. Gjenta for hver Nucleofection, en per brønn.
15. Tilbake til vekst kammer for overnatting inkubasjon.
16. Dagen erstatte medium og lar cellene til å gjenopprette i 3-5 dager.
17. Erstatt medium med fullstendig medium som inneholder riktig nivå av zeocin, som bestemmes av kill kurven analysen.
18. Monitor celler for zeocin utvalg (celler dør).
19. Erstatt medium med zeocin hver 2-3 dager.
20. Når konfluent i seks-brønns plate, passasje, basseng og utvide cellene i større kolber.
21. Lang tid for utvidelse av celler er brukervennlig og cellelinje avhengig, men det er sterkt anbefalt å utvide zeocin resistente cellene til å generere Cryo-aksjer for fremtidig screening (~~~HEAD=NNS 2-3 uker; cellelinje avhengige).

2. Transfektere Bibliotek Celler med miRNA-Expression Construct, Velg for stabil cellelinje, og velg miRNA Targets

Merk: Zeocin utvalg ikke lenger er nødvendig eller ønsket. Eksponering av celler til zeocin under miRNA uttrykk og ganciklovir (target) utvalg kan resultere i tap av miRNA mål.

3. Puromycin, G418, og ganciklovir Kill Curves

1. Utfør en kill kurve for ganciklovir med celler stabilt uttrykker Target ID Library og med puromycin eller G418 for villtypeceller.
2. Plate 1.6 x 10 ⁴ celler i brønnene til en 96-brønns plate med 120 mL ferske media. Dagen legge 0,1 til 10 mikrogram / ml puromycin/G418, eller 2 til 32 mM ganciklovir til utvalgte brønner.
3. Undersøke levedyktigheten hver 2 dager. Bytt medier som inneholder utvalg reagens hver 3. dag. Minste konsentrasjon av utvalget reagens som fører komplett celledød * etter ønsket tid, bør brukes for at celletype og eksperiment. Våre resultater viser at 0,25 til 1 mg / ml puromycin er optimal for A549, HelÃ, og MCF7 celler, 0,3 mikrogram / ml G418 for MCF7 celler og 8-16 mM ganciklovir er optimal for A549, Helà og MCF7 celler.
   
   * Merk: Med ganciklovir valg, kan treg eller ingen cellevekst følges uten fullstendig celledød. Observer celler over flere dagers behandling for å kontrollere at de ikke aktivt å dele seg. Hvis dette er tilfelle så fenol rødt i mediet fortsatt rødt. Det kan også være nødvendig å utføre en kill kurve analyse av Target ID biblioteket tilført celler hvis en endring i følsomhet er observert. Dette vil imidlertid må fastsettes på en celletype bestemt basis.

4. miRNA Transfeksjon via Nucleofection og Target Selection

1. Øk / utvide Target ID Bibliotek celler for å oppnå 2 x 10 ⁷ celler, og trypsinize når cellene er på> 80% confluency.
2. Transfer 2 x 10 ⁷ celler til en 15 ml sterilt skrue toppet rør og pellet ved 200 xg i 5 minutter.
3. Fjern medium og vask cellepelleten med HBSS eller 1X PBS.
4. Sentrifuger ved 200 xg i 5 min og aspirer vask.
5. Gjenta vaske steg cellepelleten.
6. Pre-varme seks-brønns plater med 2 ml komplett medium per brønn ved 37 ° C.
7. Tilsett 2 mikrogram av miRNA uttrykk plasmid (ikke overstige 10 mL) per 0,5 ml rør for hver transfeksjon. Origene mikroRNA Expression Plasmider (Neomycin - G418 utvalg) eller selvstendig klonede miRNA gener i pBABE-Puro (Plasmid 1764; Addgene) har blitt brukt med hell. For sistnevnte ble miRNA hårnål med ~~~HEAD=NNS 200 bp på hver side PCR klonet fra menneskelig DNA.
8. Resuspender cellene i 15 ml tube fra over med 100 mL av Amaxa Nucleofection Solution (celle spesifikke) per 2 x 10 ⁶ celler. For eksempel: For 10 Nucleofections, tilsett 1 ml av reagens.
9. En reaksjon gangen, tilsett 100 mL av celler til to mikrogram av plasmid. Bland med pipette.
10. Overfør blandingen til en Nucleofector kyvette.
11. Sett kyvetten inn Nucleofector instrument og kjøre optimalisert program hensiktsmessig for cellelinje (High Efficiency foretrekke fremfor celleviabilitet).
12. Fyll overføringspipetten med forvarmes medium. Ta opp celler i samme pipette og overføre til 6-brønnen plate. Gjenta for hver Nucleofection, en per brønn.
13. Tilbake til vekst kammer for overnatting inkubasjon.
<li> Erstatt medium og la cellene til å gjenopprette i 3-5 dager.
14. Erstatt medium med fullstendig medium som inneholder riktig nivå av puromycin eller G418 som bestemmes fra kill kurven test utført før transfeksjon med miRNA konstruere.
15. Overvåk celler for puromycin / G418 seleksjon (celler dør).
16. Erstatt medium med puromycin / G418 hver 2-3 dag.
17. Når konfluent i seks-brønns plate, passasje, basseng og utvide cellene i større kolber.
18. Lang tid for utvidelse av cellene er brukerens avhengig, men det er sterkt anbefalt å utvide puromycin / G418 resistente cellene til å generere Cryo-aksjer for fremtidig screening (~~~HEAD=NNS 2-3 uker; cellelinje avhengige).
19. Bytt medium med de aktuelle nivåer av ganciklovir (GCV) og puromycin / G418, som bestemmes av kill kurven test utført før transfeksjon med miRNA konstruere.
20. Overvåk celler for seleksjon (celler dying, Mirna målretting og knockdown av TK-Zeo).
21. Utvid celler i nærvær av GCV og puromycin / G418.
22. Forbered Genomisk DNA fra GCV valgte cellene.
23. PCR forsterke innsatser med kit primere (se PCR Amplification).
24. Clone inn TOPOTA vektor (Invitrogen) for standard sekvensering eller send PCR produkt for dyp-sekvensering.

3. PCR-forsterker Valgte Bibliotek Innsatser Sequence

Merk: Denne prosedyren er utført for å PCR-forsterke bibliotekets mål som har overlevd den ganciklovir utvalget.

5. Samle ganciklovir merkede cellene til å forberede kromosomale DNA ved hjelp av en GenElute pattedyr Genomisk DNA Miniprep Kit (Catalog Number G1N10) eller tilsvarende. Vi anbefaler å forberede DNA fra den overordnede cellelinje som ikke inneholder Target ID Library å bruke som en negativ kontroll for sammenligning med DNA fra target-merkede celler i PCR.

1. PCR Amplify den genomisk DNA med Amplification Primer 1 og Amplification Primer to. Vellykket forsterkning er hentet med JumpStart REDTaq ReadyMix Reaction Mix - for PCR (Catalog Number P0982). Optimalisering av forholdene kan være nødvendig hvis en annen polymerase brukes. Se tabell 1 for en prøve PCR oppsett og tabell 2 for PCR sykkelforholdene.
2. Løse 2-5 mL av PCR produktet på en 1% agarose gel. Den forventede produktet bør være en smear med noen synlig DNA banding. Sammenlign med kontroll PCR produkt av genomisk DNA fra celler uten Target ID Library.
3. Fortsett med kloning og / eller dyp-sekvensering av PCR produktet. Hvis ingen forsterkning produktet er observert eller er identisk å styre DNA, optimalisere PCR forsterkningsbehov forhold (dvs. primer konsentrasjon, avspenning temperatur, og sykluser).

6. Kloning og sekvensering

Merk: Vi anbefaler å klone PCR produktets og deretter utfører standard sekvensering fra minst 96 av de kloner ved hjelp av amplifiseringsprimere gitt i settet. Denne prosedyren har blitt utført med hell bruker 96-brønn natten kulturer og Plasmid rensesystemer. Selv om dyp-sekvensering er ønskelig, kan de foreløpige resultatene fra kloning og sekvensering standard brukes som en kvalitetskontroll for å avgjøre om den ekstra kostnaden av dyp-sekvensering er berettiget.

1. Følg TA kloning kit produksjon protokoll for kloning PCR forsterkning produkter (ovenfor).
2. Forvandle kloner inn kompetente bakterieceller og velger overnatting på antibiotika holdig medium.
3. Isolere og dyrke enkelte kolonier i flytende kultur inneholder riktig antibiotika.
4. Rense plasmid DNA. 6.5. Utfør sekvensering reaksjoner med amplifiseringsprimere.
5. Identifiser genet mål etter BLAST justering av sekvenser med menneskelig transkriptom (for kjente avskrift) og menneskelige genom (for romanen transcripts). * Er

* Kloning feilsøking: Hvis et høyt antall av innstikk fra sekvensering er plasmid sekvens, optimalisere kloning / sekvensering vilkår som sådan:

• PCR Amplification produkt (insert) kvalitet og kvantitet
• Ligation reaksjon
• Plasmidet forberedelse (kvalitet og kvantitet)
• Sekvensering reaksjon forhold

4. Representative Resultater

Bibliotek-skjermen for Mir-373 mål
For å vurdere resultatene av Mission Target ID Library, ble Mir-373 mål valgt fra MCF-7 biblioteket uttrykke celler. MCF-7 ble valgt fordi det uttrykker liten eller ingen påvisbare Mir-373 (data ikke vist). Mir-373 ble valgt for sin biologisk interesse. Mir-373 uttrykk fremmer tumor invasjon og metastasering i MCF-7, normalt en ikke-metastatisk cellelinje [2]. Videre Mir-373 orthologues fra musen Mir-290 klynge er involvert i mus embryonale stamcellercelle vedlikehold [3], og Mir-373 familiemedlem, mir-372, fremmer fibroblast omprogrammering til induserte pluripotent stamceller [4]. Til slutt brukte vi zink finger nukleaser å sette inn en PGK promoter-Mir-373 uttrykk konstruere inn i AAVS1 nettstedet i MCF-7 celler, og genererte en liste over potensielle Mir-373 mål av RNA microarray analyse (data ikke vist).

Target ID Library ble tilført i MCF-7 celler, og en stabil populasjon av celler ble valgt og forsterket i zeocin-holdig medium. De resulterende cellene (MCF-7 Library) ble stabilt tilført med en mir-373 uttrykke konstruksjonen og valgt i ganciklovir-holdig medium for å berike for celler som uttrykker Mir-373 mål. Vi observerte at den negative kontrollen MCF-7 Library celler (uten Mir-373) ikke løsner og blir avrundet som forventet for døde hudceller. Men gjorde de slutter å vokse, som ble lett oppdaget fordi fenol rød-holdig medium ikke bli oransje-gul som observert FOr celler uttrykker Mir-373 (fig 5). Celler ble utvidet i ganciklovir-holdig medium, og målet sekvenser ble isolert ved PCR med primere flankerer de Target ID Library cDNA innstikk og DNA tilberedt fra de overlevende celler. PCR produktene var Illumina sekvensert.

Som vist i Tabell 4, fikk vi 17740719 cDNA lesninger, som tilordnet 11,076 unike gener. Av disse unike gener, ble 2898 oppdaget med mer enn 40 lesninger, og derfor ble ansett pålitelige treff. Den 13.106.469 vektor leser var ventet fordi PCR primere som brukes til å forsterke cDNA innstikk er 40 og 300 baser bort fra innstikkstedet. Som sådan er det forventet at de fleste resulterende sekvenser vil være fra vektoren motsetning mer tradisjonelle dyp-sekvensering av genomisk materiale. Fjorten prosent ikke tilordne til enten vektor eller cDNA, men fikk justert med NCBI ikke-redundante nukleotid database (dvs. med NR hit), og bare 1% hadde ingen cDNA innsatsen.

En første sammenligning fant at 10 av de unike gener identifisert med Target ID Library er også på listen over tidligere identifiserte Mir-373 mål i TarBase (tabell 5). Disse 10 Mir-373 målene ble tidligere identifisert ved microarray med RNA fra Jakten celler forbigående transfekterte med en syntetisk Mir-373 etterligne [5]. Videre oppdaget vi de samme 10 genene nedregulert i MCF-7 celler uttrykker Mir-373 fra AAVS1 hotellet (data ikke vist). Derfor er disse 10 er sannsynlig gyldige mål for Mir-373. Arbeid pågår for å karakterisere listen over potensielle mål og forsøke å validere utvalgte treff eksperimentelt ved RT-qPCR, Western blot, og luciferase reporter analysen.

Figur 1. Workflow for Target ID Library. Seksjoner AC: Se seksjoner i prosedyren. Hvert trinn er illustrert og beskrevet i detalj i 3.

Figur 2. Transfeksjon og Zeocin valg. Målet ID Library er en pool av plasmider (A), hver med en menneskelig cDNA settes inn i 3'-UTR etter en tymidinkinase-zeocin fusion protein (TKzeo; Fig 4). Cellene blir tilført med Target ID Library (B) og lov til å komme seg i 3-5 dager. Konstruerer kan integreres i genomet i denne utvinning periode (C), og uttrykker den kodede karakterutskrift (D). Etter utvinning, blir cellene eksponert for zeocin (E). Celler som uttrykker TKzeo fusion protein fra stabilt integrerte Target ID konstruerer overleve zeocin utvalg (F). Untransfected celler dør (G). I tillegg til noen celler som inneholder en konstruksjon som er et mål for en endogen miRNA eller othER faktor uttrykt i cellen som hemmer uttrykk av TKzeo fra Target ID konstruktet vil dø (H).

Figur 3. MiRNA transfeksjon og ganciklovir utvalg. Celler som inneholder Target ID Library (dvs. zeocin-merkede celler) er tilført med en valgbar mikroRNA uttrykk konstruere (A). Under utvinning, kan miRNA uttrykket begrepet integrere (B) og uttrykke valgbar markør kodet på miRNA konstruere. Etter valget for stabil integrering (C) og celle ekspansjon, blir cellene behandles med ganciklovir (D). Celler som produserer tymidinkinase (TK) i nærvær av ganciklovir (dvs. celler uttrykker TKzeo konstruerer ikke målrettet av miRNA) vil dø (E) På den annen side, celler som inneholder Bibliotek konstruksjoner med miRNA mål s ITES vil ikke produsere TK, og derfor vil overleve ganciklovir utvalg (F). Overlevende celler kan dyrkes, gDNA isolert, og de cDNA holdige miRNA målwebområder PCR-forsterket ved hjelp av Target ID amplifiseringsprimere. PCR produktene kan bli sekvensert, og på linje med det menneskelige genom for å identifisere miRNA mål.

Figur 4. Plasmid Kart og plassering av amplifiseringsprimere. SFI Jeg er nettstedene til cDNA kloning.

Primer Sekvenser

MISSION Target ID Amplification Primer 1

5 ACGACGTGACCCTGTTCATC 3

MISSION Target ID Amplification Primer 2

5 TAAAACGACGGCCAGTGAAT 3

ig5.jpg "alt =" Figur 5 "/>
Figur 5. Ganciklovir effekt på cellevekst. Tjuefire vel platene ble sådd med 2-100000 MCF-7 celler eller MCF-7 celler som inneholder Target ID Library. Tjuefire timer senere ble det medium erstattet med medium med 0, 8 eller 16 mM ganciklovir. Etter 15 dager ble platen fotografert (6 øvre brønner), deretter brønnene vaskes med HBSS og beiset med Brilliant Blue R Farging Solution (B6529) (6 nedre brønner). Merk at ganciklovir har ingen effekt på MCF-7 celler uten bibliotek fordi de ikke uttrykker tymidinkinase (TK). På den annen side, MCF-7 Bibliotek celler gjør uttrykkelig TK, men er ikke helt drept av ganciklovir på 8 eller 16 mM, som vist av de levende cellene tar opp Brillinat Blue. Men stoppe Bibliotek cellene ikke vokser i ganciklovir, som dokumentert av fargen på fenol rødt fargestoff i medium. De arresterte cellene ikke forsurer deres medium, og fargen forblir rødlig stedet for å endre ellerange-gul.

Reagens	Volum / Reaction
Jumpstart REDTaq ReadyMix reaksjonsblandingen	10 mL
Forsterkning Primer 1 (25 mm)	0,2 mL
Forsterkning Primer 2 (25 mm)	0,2 mL
Genomisk DNA	50-200 ng
Vann, Molecular Grade	til 20 mL

Tabell 1.

Trinn	Temp.	Tid	Cycles
Initial denaturering	95 ° C	5 min.	1
Denaturering	95 ° C	30 sek.	pan = "3"> 40 sykluser
Annealing *	62 ° C	30 sek.
Extension	68 ° C	2 min.
Endelig Extension	68 ° C	5 min.	1
Hold	4 ° C	Hold

Tabell 2.

* Er annealing temperaturer kan variere, men vi har observert de beste forsterkningsbehov produktene med annealing temperaturer mellom 53 og 64 ° C.

Tabell 3. Target ID Library innhold av Illumina sekvensering.

Tabell 4. Mir-373 utvalgte mål av Illumina sekvensering.

les/ftp_upload/3303/3303table5.jpg "alt =" Tabell 5 "/>

Tabell 5. 10 mål tidligere identifisert av RNA microarray.

Discussion

microRNAs er 20-24 nukleotid RNA som regulerer genuttrykk post-transcriptionally ved å hemme mRNA oversettelse, og ofte, destabilisere målrettet mRNA (anmeldt i [6]). En enkelt miRNA kan regulere flere hundre mRNAs å styre en celle respons på utviklingsmessige og miljømessige signaler. Identifisering og validere målet mRNA er avgjørende for å bestemme en miRNA rolle og funksjon i disse banene. Imidlertid er målet identifikasjon ikke enkelt fordi, i dyr, miRNAs og deres målwebområder er ikke helt komplementære. Den "frø" region, bygger 2 til 7 fra 5'-enden av miRNA, er vanligvis komplementær til sine mål. Det finnes imidlertid mange unntak fra frø regelen, og nedstrøms base-paring kan kompensere for en ufullkommen frø kamp. En rekke datamaskinalgoritmer har blitt utviklet for å forutsi miRNA mål basert på frø matching og nedstrøms kompensasjon, målet struktur end posisjon, sekvens bevaring, og diverse andre parametere som er observert for eksperimentelt validerte mål (anmeldt i [7]). Mens i silico spådommer er praktisk og gjør identifisere mange gyldige miRNA mål, spådde de fleste gener mislykkes eksperimentelle validering tester, og mange faktiske mål er ikke spådd. Videre, siden datamaskinalgoritmer er basert på tidligere fastsatte målet funksjoner, har de ikke tillater oppdagelse av mål som avviker fra det som allerede er kjent.

En rekke eksperimentelle systemer har vært brukt med hell til å identifisere eller finne funksjonelle miRNA mål i levende celler. Disse globale screening metodene inkluderer mikromatriser og RNA sekvensering, RNA co-immunoprecipitation (RIP), og stabil isotop Merking med aminosyrer i cellekultur (SILAC), en proteomikk metode (anmeldt i [7]). Hver metode har fordeler og ulemper. Siden miRNA målretting destabiliserer ofte en mRNA og fører til dens degradering, tap or gevinst i mRNA nivå etter innføring av en miRNA etterligne eller hemmer henholdsvis kan identifisere miRNA mål. Dette tapet eller gevinsten av mRNA er lett oppdages av microarray eller dyp-sekvensering. Mens mRNA påvisningsmetoder er enklere og mer følsom enn protein gjenkjenning metoder, vil mRNA deteksjon savne noen miRNA mål som ikke er degradert. Nylige rapporter fra Bartell lab sammenligner miRNA resultatmål fra RNA deteksjon med de fra SILAC [8] eller ribosomet profilering [9] tyder på at pattedyr miRNAs hovedsakelig handle ved å redusere målet mRNA nivåer. Imidlertid har mange andre laboratorier som arbeider med individuelle miRNA mål påvist endring i protein, men ingen endring i mRNA nivå. Rapporter om hva synes å være translasjonell regulering uten påvisbare mRNA tap inkluderer: Mir-10B på HOXD10 [10], miR221/222 på p27kip1 [11], Mir-21 på Pdcd4 [12], Mir-126 på p85β [13] , Mir-34 på SIRT1 [14], Mir-21 på PTEN [15], Mir-302d på Arid4b [16], Mir-200C på JAG1 [17], og Mir-299, 297, 567, ennd 609 på VEGFA [18]. Videre Clancy et al [19] nylig rapportert at translasjonsforskning regulering av let-7 ble bare oppdaget når individuelle mRNA isoformer som inneholder la-7 målområde ble oppdaget selektivt. Sistnevnte tyder på at i hvert fall i noen tilfeller kan translasjonsperspektiv regulering bli oversett i en sammensatt profil - det vil si når alle mRNA isoformer blir oppdaget som en mRNA - som fås med mange microarray og rekkefølge analyser. Co-immunoprecipitation av miRNA-mRNA komplekser via argonaute (vanligvis ago2) eller en annen assosiert protein (RNA immunoprecipitation, eller RIP) vil isolere miRNA mål uavhengig av regulering mekanisme. I tillegg oppdager RIP endogen, og formodentlig biologisk relevant, interaksjoner. Det er imidlertid ikke kjent om alle miRNA-mRNA interaksjoner er funksjonelle, og RIP ville savne noen mRNA mål som forbinder bare forbigående eller er raskt degradert. Videre må spesifikke miRNA-mRNA partnere utledes bioinformatitisk fordi alle miRNA-mRNA par co-utfelt sammen. Til slutt, identifiserer SILAC direkte endelige produktet av miRNA regulering, proteinet i seg selv, men er ufølsom og derfor savner sjeldne proteiner og små brett endringer i protein nivåer.

I lys av de begrensninger med dagens miRNA målet identifikasjon metoder, følte vi en ytterligere global analyse for å identifisere funksjonelle miRNA mål ved en alternativ mekanisme var nødvendig. For å oppfylle dette behovet, lisensiert vi en teknologi oppfunnet av Joop Gaken og Azim Mohamedali av Kings College London. Deres oppfinnelse er en dual utvalg fusion protein, spesielt, en tymidinkinase-zeocin fusion, regulert av et cDNA bibliotek potensielle miRNA mål sekvenser i 3'UTR sin. Celler stabilt transfekterte med og uttrykke TKzeo-cDNA konstruerer kan velges med zeocin, som illustrert i figur 2. Etter uttrykker en miRNA av interesse, kan det miRNA målsettinger velges with ganciklovir, som illustrert i figur 3.. Ganciklovir dreper celler uttrykker tymidinkinase, som er, eventuelle celler uttrykker TKzeo-cDNA mangler et mål for miRNA av interesse. Målrettet cDNA kan isoleres ved PCR amplifisering av DNA fra celler som overlever ganciklovir bruker primere som flankerer cDNA, og PCR-produkter kan bli sekvensert å identifisere mål.

Vi har utviklet Kings College teknologi inn i et nytt verktøy for global identifisering og oppdagelse av funksjonelle menneskelige miRNA mål - MISSION Target ID Library. Med Target ID Library, kan brukerne isolere miRNA mål av en rekke pattedyr cellekultur transfeksjon og narkotika valg trinn. Biblioteket er omfattende, og inneholder 66-79% av menneskets gener. Foreløpige resultatene tyder på at både tidligere oppdaget så vel som nye mål kan bli isolert fra MISSION Target ID Library.

Selv om protokollen er av noen lengde,bruk av Target ID biblioteket krever standard molekylære lab teknikker - pattedyrcelle kultur, transfeksjon, narkotika utvalg, PCR, og sekvensering - og derfor bør være godt innenfor middel for de fleste biologer. Vi foreslår at tilstrekkelig oppmerksomhet rettes mot riktig eksperimentell design, optimalisering kultur vilkår, og viktigst, pre-testing hver ny celletype å bestemme optimale nivåer av legemiddel for valg trinn (kill-kurver) for å sikre suksess med Target ID Library.

Som med alle miRNA mål identifikasjon metoder, er det sterkt anbefalt at målene identifisert ved screening Target ID Library bli validert med en andre metoden, som microarray, QRT-PCR, reporter analysen (dvs. luciferase), eller vestlig analyse.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
JumpStart REDTaq ReadyMix	Sigma-Aldrich	P0982
Ganciclovir	Sigma-Aldrich	G2536
G418	Sigma-Aldrich	G8168
Puromycin	Sigma-Aldrich	P9620
Topo TA	Invitrogen	KNM4500-01
GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit	Sigma-Aldrich	G1N10
Cell Specific Nucleofection kit	Lonza Inc.
Nucleofector	Lonza Inc.	AAD-1001
Zeocin	Invitrogen	R250-01
Target ID Library	Sigma-Aldrich	MREH01