Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Генома экран для микроРНК цели с помощью ID МИССИЯ целевой библиотеки

Published: April 6, 2012 doi: 10.3791/3303
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Sigma-Aldrich
* These authors contributed equally

Summary

Библиотека Target ID является плазмида основе, генома коллекции клонированных кДНК используется для идентификации микроРНК целей. Здесь мы показываем его использования и применения.

Abstract

Библиотека Target ID предназначен для оказания помощи в открытии и идентификации микроРНК (миРНК) целей. Библиотека Target ID является плазмида основе, генома библиотеки кДНК клонировали в 3'UTR вниз по течению от двойного отбора гибридного белка, тимидинкиназы-zeocin (TKzeo). Первый раунд отбора для стабильного трансформантов, а затем с введением микроРНК интерес, и, наконец, выбрать для кДНК содержащих цель в микроРНК. Выбранный кДНК определяются последовательности (см. Рисунок 1-3 для Target ID Workflow Библиотеки и детали).

Для обеспечения широкого охвата человека транскриптом, Target ID библиотеки кДНК были получены с помощью олиго-дТ грунтовки использованием пула тотальной РНК готовят из нескольких человеческих тканей и клеточных линиях. В результате кДНК в диапазоне от 0,5 до 4 кб, со средним размером 1,2 кб, и были клонированы в p3TKzeo двойного выбора плазмид (см. Рисунок 4 карта плазмиды). Ген целей, представленных в лиbrary можно найти на Sigma-Aldrich веб-страницы. Результаты Illumina последовательности (табл. 3) показывают, что библиотека включает в себя 16 922 из 21 518 уникальных генов в УСК RefGene (79%), или 14 000 генов с 10 или более чтения (66%).

Protocol

1. Трансфекция с целевой библиотеки ID и выбор для стабильных клеточных линиях

1. Zeocin убийство кривой

Zeocin используется для выбора для стабильно трансфицированных клеток. Тем не менее, избыток вызывает нежелательные zeocin фенотипические ответы в большинстве типов клеток. Таким образом, убийство анализ кривой должны быть выполнены для установления минимальной смертельной дозы.

  1. Пластина 1,6 х 10 4 клеток в лунки 96-луночного планшета в 120 мкл среды.
  2. На следующий день добавить zeocin в возрастающих концентрациях от 50 мкг / мл до 1 мг / мл в соответствующие лунки.
  3. Изучить жизнеспособность каждые 2 дня.
  4. Замените средах, содержащих zeocin каждые 3 дня. Минимальная концентрация выбор реагента, который вызывает полную гибель клеток после того, как нужное время следует использовать для этого типа клеток и эксперимент. Наши результаты показывают, что 500 мкг / мл zeocin является оптимальным для А549, HeLa и MCF7 клеток.

2.Библиотека Трансфекция через Nucleofection и селекции

  1. Выберите клеточной линии, которые либо не выражает или выражает низкий уровень микроРНК ваш интерес. МикроРНК будет введена в разделе B для выбора цели после того, как устойчивые выражения библиотеки ID цель достигнута.
  2. Культура / расширение клеток. Мы получили отличные результаты с 2 х 10 7 клеток в библиотеке трансфекции.
  3. Trypsinize клетки, которые находятся на> 80% слияния и передачи 2 х 10 7 клеток в 15 мл стерильной винт верхом трубы.
  4. Гранул трипсином клетки при 200 мкг в течение 5 мин.
  5. Удаление средних и мыть осадок клеток с HBSS или 1X PBS.
  6. Центрифуга 200 мкг в течение 5 мин и аспирации стирки.
  7. Повторите шаг мыть осадок клеток.
  8. Предварительно теплой 6-луночных с 2 мл полной среды при температуре 37 ° C.
  9. Добавить 2 мкг Библиотека Target ID (не более 10 мкл) в 0,5 мл трубки для каждой трансфекции.
  10. Ресуспендирования клеток в 15 мл трубки сверху 100 мкл раствора Nucleofection Amaxa (ячейка конкретного) на 2 х 10 6 клеток. Например, в течение 10 Nucleofections добавляют 1 мл реагента.
  11. Одной из реакций на время, добавьте 100 мкл клеток в 2 мкг плазмиды. Смешать с пипеткой.
  12. Передача смеси Nucleofector кювет.
  13. Вставьте кювету в Nucleofector инструмент и запустить оптимизированную программу подходящей для клеточной линии (High Efficiency предпочтительнее жизнеспособности клеток).
  14. Заполните передачи пипетки с предварительно нагретой среде. Возьмите клеток в той же пипеткой и передачи 6-ти луночного планшета. Повторите для каждой Nucleofection, по одному на хорошо.
  15. Возврат к росту камеры для инкубации в течение ночи.
  16. На следующий день заменить средними и позволяют клеткам восстановиться в течение 3-5 дней.
  17. Замените среду с полной среде, содержащей соответствующий уровень zeocin, а определяется из анализа кривой убийство.
  18. Моnitor клетки для выбора zeocin (клетки умирают).
  19. Замените среду с zeocin каждые 2-3 дня.
  20. После сливающийся в 6-луночного планшета, прохождение, бассейн и расширение клеток в больших колбах.
  21. Продолжительность времени для расширения клеток пользователей и клеточной линии зависит, но настоятельно рекомендуется расширить zeocin резистентных клеток для создания крио-акции для будущих скрининга (~ 2-3 недель; зависимой клеточной линии).

2. Библиотека трансфекции клеток с микроРНК-выражение Construct, выберите для Стабильная линия клеток, и выбор целей микроРНК

Примечание: Zeocin выбора больше не требуется или требуется. Воздействие на клетки zeocin в выражение микроРНК и ганцикловир (цель) выбор может привести к потере микроРНК целей.

3. Пуромицин, G418, и Ганцикловир убийство Curves

  1. Выполните убийство кривой ганцикловир с клетками стабильно выражения библиотеки Target ID и пуромицин или G418 для дикого типаклеток.
  2. Пластина 1,6 х 10 4 клеток в лунки 96-луночного планшета со 120 мкл свежей информации. На следующий день добавить от 0,1 до 10 мкг / мл puromycin/G418, или от 2 до 32 мкм ганцикловир в избранное скважин.
  3. Изучить жизнеспособность каждые 2 дня. Замените средах, содержащих выбор реагентов каждые 3 дня. Минимальная концентрация выбор реагентов, что приводит к полному * гибель клеток после того, как нужное время, должны использоваться для данного типа клеток и эксперимент. Наши результаты показывают, что 0,25 до 1 мкг / мл пуромицин является оптимальным для А549, HeLa и MCF7 клетки, 0,3 мкг / мл G418 для MCF7 клеток и 8-16 мкм ганцикловир являются оптимальными для А549, HeLa и MCF7 клеток.

    * Примечание: При выборе ганцикловир, медленно или не рост клеток может наблюдаться без полной гибели клеток. Соблюдайте клеток на лечение несколько дней, чтобы убедиться, что они не активно делиться. Если это так, то фенол красный среды остается красным. Он также может быть необходимо для выполнения киЛ.Л. Анализ кривой библиотеки ID целевой трансфекции клеток, если изменение чувствительности не наблюдается. Однако, это должны быть определены на конкретный тип клеток основе.

4. миРНК трансфекции через Nucleofection и выбора цели

  1. Рост / расширение целевой клетки ID Библиотека достичь 2 х 10 7 клеток, а trypsinize, когда клетки находятся на> 80% слияния.
  2. Передача 2 х 10 7 клеток в 15 мл стерильной Винт возглавила трубы и гранул на 200 мкг в течение 5 минут.
  3. Удаление средних и мыть осадок клеток с HBSS или 1X PBS.
  4. Центрифуга 200 мкг в течение 5 мин и аспирации стирки.
  5. Повторите шаг мыть осадок клеток.
  6. Предварительно теплой 6-луночных с 2 мл полной среды на лунку при 37 ° C.
  7. Добавить 2 мкг плазмиды экспрессии микроРНК (не более 10 мкл) в 0,5 мл трубки для каждой трансфекции. Origene микроРНК выражения плазмиды (Неомицин - G418 выбора) или самостоятельно клонированных генов микроРНК в pBABE-Puro (плазмиды 1764; Addgene) были успешно использованы. Что касается последнего, микроРНК шпильки с ~ 200 б.п. с обеих сторон были ПЦР клонировали из человеческой ДНК.
  8. Ресуспендирования клеток в 15 мл трубки сверху 100 мкл раствора Nucleofection Amaxa (ячейка конкретного) на 2 х 10 6 клеток. Например: За 10 Nucleofections, добавляют 1 мл реагента.
  9. Одной из реакций на время, добавьте 100 мкл клеток в 2 мкг плазмиды. Смешать с пипеткой.
  10. Передача смеси Nucleofector кювет.
  11. Вставьте кювету в Nucleofector инструмент и запустить оптимизированную программу подходящей для клеточной линии (высокая эффективность предпочтительнее жизнеспособности клеток).
  12. Заполните передачи пипетки с предварительно нагретой среде. Возьмите клеток в той же пипеткой и передачи 6-ти луночного планшета. Повторите для каждой Nucleofection, по одному на хорошо.
  13. Возврат к росту камеры для инкубации в течение ночи.
    14. <LI> Замена среднего и позволяют клеткам восстановиться в течение 3-5 дней.
  14. Замените среду с полной среде, содержащей соответствующий уровень пуромицин или G418, как это определено в убийство пробной кривой выполняется до трансфекции миРНК построить.
  15. Мониторинг клеток для пуромицин / G418 выбор (клетки умирают).
  16. Замените среду с пуромицин / G418 каждые 2-3 дня.
  17. После сливающийся в 6-луночного планшета, прохождение, бассейн и расширение клеток в больших колбах.
  18. Продолжительность времени для расширения клетки пользователя зависит, но настоятельно рекомендуется расширить пуромицин / G418 резистентных клеток для создания крио-акции для будущих скрининга (~ 2-3 недель; зависимой клеточной линии).
  19. Замените среды с соответствующим уровнем ганцикловир (GCV) и пуромицин / G418, который определяется из кривой убийство тест выполняется до трансфекции миРНК построить.
  20. Мониторинг клеток для выделения (клетки умираюг, микроРНК адресности и нокдаун TK-ZEO).
  21. Развернуть клеток в присутствии ВТС и пуромицин / G418.
  22. Подготовить геномной ДНК из GCV выбранные ячейки.
  23. ПЦР усилить вставки с набором праймеров (см. ПЦР).
  24. Клон в TOPOTA вектор (Invitrogen) для стандартной последовательности или представить ПЦР-продукта для глубокой последовательности.

3. ПЦР-Усиление выбранной библиотеке вставки и последовательность

Примечание: Эта процедура выполняется для ПЦР усилить библиотеки целей, которые пережили ганцикловир выбор.

5. Соберите ганцикловир выбранные ячейки подготовить хромосомной ДНК с использованием GenElute млекопитающих геномной ДНК Miniprep Kit (номер по каталогу G1N10) или эквивалент. Мы рекомендуем подготовке ДНК от линии родительской клетки, не содержащие библиотеки Target ID для использования в качестве отрицательного контроля для сравнения с ДНК из целевых выделенных ячеек в ПЦР.

  1. ПЦР-Amplify геномной ДНК с усилением Primer 1 и усиление Primer 2. Успешное усиления были получены с JumpStart REDTaq Readymix реакционной смеси - для ПЦР (Номер в каталоге P0982). Оптимизация условий может быть необходимо, если другой полимеразы используется. См. Таблицу 1 для установки образца ПЦР и в таблице 2 условия ПЦР на велосипеде.
  2. Решение 2-5 мкл ПЦР-продукта на 1% агарозном геле. Ожидаемый продукт должен быть смазать некоторые видимые полосы ДНК. Сравнить контролировать продукт ПЦР геномной ДНК из клеток без библиотеки ID цели.
  3. Продолжайте клонирование и / или глубоко секвенирования продуктов ПЦР. Если ни один продукт амплификации наблюдается или идентичные ДНК контролировать, оптимизировать условия ПЦР амплификации (например, грунтовки концентрации, температуры отжига и циклов).

6. Клонирование и секвенирование

Примечание: Мы настоятельно рекомендуем клонирования продуктов ПЦРс, а затем выполнять стандартные последовательности, по меньшей мере 96 клонов помощью усиления Грунтовки предоставляется в комплекте. Эта процедура была выполнена успешно использует 96-и ночи культуры и плазмиды системы очистки. Даже если глубоко последовательности желательно, предварительные результаты клонирования и секвенирования стандарт может быть использован как контроль качества, чтобы определить дополнительные расходы глубокую последовательность является оправданным.

  1. Следуйте протоколу TA Cloning Kit производства для клонирования продуктов ПЦР-амплификации (см. выше).
  2. Преобразование клонов в компетентные бактериальных клеток и выбрать ночь на среде, содержащей антибиотик.
  3. Изолировать и расти отдельных колоний в культуральной жидкости, содержащей соответствующие антибиотики.
  4. Очисти плазмидной ДНК. 6.5. Выполните последовательность реакций с усилением грунтовки.
  5. Определение генов мишеней BLAST выравнивание последовательностей с человека транскриптом (для известных протоколов) и генома человека (за роман трanscripts) *.

* Клонирование устранения неполадок: Если большое количество вставок из последовательности плазмиды являются последовательность, оптимизировать клонирования / последовательности условий как таковых:

  • ПЦР продукт (вставка) качество и количество
  • Реакции лигирования
  • Плазмиды подготовки (качество и количество)
  • Последовательность условий реакции

4. Представитель Результаты

Библиотека экран микроРНК-373 целей
Для оценки выполнения миссии библиотеки Target ID, микроРНК-373 цели были отобраны из MCF-7 клеток, экспрессирующих библиотеку. MCF-7 была выбрана потому, что оно выражает мало или совсем не обнаружить микроРНК-373 (данные не представлены). микроРНК-373 был выбран для его биологический интерес. микроРНК-373 способствует выражению опухолевой инвазии и метастазирования в MCF-7, как правило, не метастатическим клеточные линии [2]. Кроме того, микроРНК-373 ортологов от мыши микроРНК-290 кластеров, участвующих в мышиных эмбриональных стволовыхклетки обслуживание [3], и микроРНК-373 член семьи, микроРНК-372 способствует фибробластов для перепрограммирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток [4]. Наконец, мы использовали цинковые пальцы нуклеаз вставить ПГК промоутер-микроРНК-373 выражение построить в AAVS1 сайт в MCF-7 клеток, и составили список потенциальных микроРНК-373 мишеней РНК микрочипов анализа (данные не представлены).

Библиотека Target ID был трансфекции в MCF-7 клеток, а также стабильная популяция клеток была выбрана и усиливается в zeocin содержащей среде. В результате клетки (MCF-7, библиотека) были стабильно трансфицированных микроРНК-373 конструкции и выражения, выбранного в ганцикловир среде, содержащей обогащения для клеток, экспрессирующих микроРНК-373 целей. Мы заметили, что отрицательный контроль MCF-7 клеток библиотека (без микроРНК-373) не отделяться и становятся округлыми, как ожидается мертвых клеток. Тем не менее, они перестают расти, который легко обнаружить, так как фенол красный среде, содержащей не оранжевым, желтым, как наблюдал лГ клеток, экспрессирующих микроРНК-373 (рис. 5). Клетки были расширены в ганцикловир среде, содержащей, и целевой последовательности были изолированы с помощью ПЦР с праймерами фланговые Target ID библиотеки кДНК вставок и ДНК получали из выживших клеток. ПЦР-продукты были Illumina последовательный.

Как показано в Таблице 4, мы получили 17740719 кДНК чтения, которые отображаются на 11076 уникальных генов. Из них уникальных генов, 2898 были обнаружены более 40 прочтений, и поэтому считались достоверными хитов. 13106469 вектор читает, как ожидается, поскольку ПЦР-праймеров для амплификации кДНК вставки 40 и 300 баз от введения сайта. Таким образом, ожидается, что большинство полученной последовательности будет от вектора в отличие от более традиционных глубоких последовательность геномного материала. Четырнадцать процентов не соответствуют или вектор или кДНК, но согласовать с неизбыточных NCBI в нуклеотидных баз данных (например, с NR удар), и только 1% не имели вставки кДНК.

Первоначальный сравнения показали, что 10 уникальных генов отождествляется с библиотекой ID целевой Также в список ранее выявленных микроРНК-373 целей в TarBase (табл. 5). Эти 10 микроРНК-373 цели, ранее выявленные микрочипов с РНК из клеток HeLa временно трансфекции с синтетическим микроРНК-373 имитировать [5]. Кроме того, мы обнаружили те же 10 генов подавляется в MCF-7 клеток, экспрессирующих микроРНК-373 от AAVS1 сайта (данные не представлены). Таким образом, эти 10, скорее всего действительно целей микроРНК-373. Ведется работа, чтобы охарактеризовать список потенциальных целей и попытка проверить выбранные хиты экспериментально RT-КПЦР, Вестерн-блот и люциферазы анализа репортера.

Рисунок 1
Рисунок 1. Последовательность действий для целевой библиотеки ID. Разделы AC: обратитесь к разделам в порядке. Каждый шаг проиллюстрирован и описан в 3.

Рисунок 2
Рисунок 2. Трансфекция и Zeocin выбор. Библиотека Target ID представляет собой пул плазмид (A), каждая из кДНК человека вставляется в 3'-НТО после тимидинкиназы-zeocin гибридного белка (TKzeo; рис. 4). Клетки трансфицированных Target ID библиотеке (Б) и позволил восстановить в течение 3-5 дней. Конструкции могут интегрироваться в геном в течение этого периода восстановления (C), и выразим закодированные запись (D). После восстановления, клетки подвергаются zeocin (E). Клетки, экспрессирующие белок TKzeo слияние с стабильно интегрированных конструкций ID целевой выжить zeocin выбор (F). Нетрансфицированных клетки умирают (G). Кроме того, любые клетки, содержащие конструкцию, которая является мишенью для эндогенных микроРНК или др.э фактор выражается в клетке, который ингибирует экспрессию TKzeo с Target ID конструкция умрет (H).

Рисунок 3
Рисунок 3. Трансфекции миРНК и ганцикловир выбор. Клетки, содержащие Target ID библиотеки (например, zeocin выбранной клетки), трансфицированных выбор выражения микроРНК построить (A). Во время восстановления, конструкция выражения микроРНК могут интегрировать (B) и выразить селективного маркера закодированы на микроРНК построить. После выбора для стабильной интеграции (С), а расширение, клетки обрабатывают ганцикловир (D). Клеток, продуцирующих тимидинкиназы (TK) в присутствии ганцикловира (например, клетки, экспрессирующие TKzeo конструкций не направлены на миРНК) умрет (E) С другой стороны, клетки, содержащие библиотеки конструкций с микроРНК цель с ITES не будет производить ТЗ, а следовательно, выживет ганцикловир выбор (F). Выжившие клетки могут быть выращены, gDNA изолированных и кДНК, содержащих сайты целевой микроРНК ПЦР усиливается использованием целевых грунтовки ID усиления. ПЦР-продукты могут быть упорядочены и приведены в соответствие с геномом человека для выявления микроРНК целей.

Рисунок 4
Рисунок 4. Карта плазмиды и расположение Усиление грунтовки. Sfi я это сайты кДНК клонирование.

Грунтовка последовательности

МИССИЯ Target ID Усиление Primer 1

5 ACGACGTGACCCTGTTCATC 3

МИССИЯ Target ID Усиление Праймер 2

5 TAAAACGACGGCCAGTGAAT 3

ig5.jpg "ALT =" Рисунок 5 "/>
Рисунок 5. Ганцикловир влияние на рост клеток. Двадцать четыре луночных были посеяны с двумя-100000 MCF-7 клеток или MCF-7 клеток, содержащих библиотеки Target ID. Двадцать четыре часа спустя, среда была заменена на среде, содержащей 0, 8 или 16 мкМ ганцикловир. Через 15 дней, пластина была сфотографирована (6 верхних скважин), то скважины промывают HBSS и окрашивают Brilliant Blue Окрашивание R Решение (B6529) (6 ниже скважин). Обратите внимание, что ганцикловир не влияет на MCF-7 клеток без библиотеки, потому что они не выражают тимидинкиназы (ТК). С другой стороны, MCF-7 клеток Библиотека сделать экспресс ТК, но не полностью убил ганцикловир на 8 или 16 мкм, как показано на живые клетки занимают Brillinat Blue. Тем не менее, библиотека клетки не перестают расти в ганцикловир, о чем свидетельствует цвет фенола красного красителя в их среде. Арестован клетки не окисляются их среде, а красноватый цвет остается вместо изменения илиАнж-желтого цвета.

Реагент Объем / Реакция
Jumpstart REDTaq Readymix реакционной смеси 10 мкл
Усиление Primer 1 (25 мкм) 0,2 мкл
Усиление Праймер 2 (25 мкм) 0,2 мкл
Геномная ДНК 50-200 нг
Вода, молекулярной класса до 20 мкл

Таблица 1.

Шаг Температура Время Циклы
Начальная Денатурация 95 ° C 5 мин. 1
Денатурация 95 ° C 30 сек. кастрюля = "3"> 40 циклов
Отжиг * 62 ° C 30 сек.
Расширение 68 ° C 2 мин.
Окончательное расширение 68 ° C 5 мин. 1
Держать 4 ° C Держать

Таблица 2.

* Температура отжига может меняться, но мы наблюдали лучшие продукты амплификации с отжигом диапазоне температур от 53 до 64 ° C.

Таблица 3

Таблица 3. Target ID Библиотека содержания последовательности Illumina.

Таблица 4

Таблица 4. МикроРНК-373 выбранных целей путем Illumina последовательности.

les/ftp_upload/3303/3303table5.jpg "ALT =" Таблица 5 "/>

Таблица 5. 10 целей выявленные ранее РНК-микрочипов.

Discussion

микроРНК являются 20-24 нуклеотидных РНК, которые регулируют экспрессию генов после транскрипционно путем ингибирования перевод мРНК, и часто, дестабилизации целевой мРНК (см. обзор в [6]). Одной микроРНК могут регулировать несколько сотен мРНК контролировать реакцию клетки на развития и окружающей среды сигналы. Определение и утверждение целевой мРНК имеет важное значение в определении роли микроРНК и функции в этих путей. Тем не менее, цель идентификации не просто потому, что у животных микроРНК и их сайты цель не в полной мере дополняют друг друга. «Семя» региона, строит со 2 по 7 от 5'-конца миРНК, как правило, дополнения к своей цели. Тем не менее, есть много исключений из семян правило, ниже по течению и спариванием оснований может компенсировать несовершенным матч семян. Число компьютерных алгоритмов были разработаны для прогнозирования микроРНК целей на основе соответствия семян и вниз по течению компенсации, целевой структурыг положении, последовательность сохранения, а также различные другие параметры, которые были обнаружены экспериментально подтверждены для целей (см. обзор в [7]). В то время как в кремнии предсказания удобным и сделать выявить многие действительными целями микроРНК, большинство генов предсказал неудачу экспериментальных проверку, и многие фактические цели не прогнозируется. Кроме того, поскольку компьютерные алгоритмы основаны на ранее определенных функций цели, они не позволяют открытие цели, которые отличаются от того, что уже известно.

В ряде экспериментальных систем были успешно использованы для идентификации или обнаружить функциональные цели микроРНК в живых клетках. Эти глобальные методы обследования включают микрочипов и РНК последовательности, РНК совместной иммунопреципитации (RIP), маркировка и стабильный изотоп с аминокислоты в культуре клеток (SILAC), протеомных методов (см. обзор в [7]). Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки. С микроРНК ориентации часто дестабилизирует мРНК и приводит к ее деградации, потери оГ выигрыш в уровне мРНК после введения микроРНК имитировать или ингибиторов, соответственно, может идентифицировать микроРНК целей. Эта потеря или приобретение мРНК легко обнаружить микрочипов или глубокой последовательности. Хотя методы обнаружения РНК проще и более чувствительны, чем методы обнаружения белка, мРНК обнаружения пропустите ни микроРНК цели, которые не деградировали. Недавние сообщения из лаборатории Bartell сравнения результатов микроРНК цель от обнаружения РНК с теми, от SILAC [8] или рибосома профилирования [9] показали, что микроРНК млекопитающих преимущественно действуют за счет уменьшения уровня целевой мРНК. Тем не менее, многих других лабораториях, работающих с отдельными целями микроРНК обнаружены изменения белка, но никаких изменений в уровне мРНК. Доклады что, кажется, поступательное регулирование, не обнаруживается потеря мРНК включают в себя: Мир-10b на HOXD10 [10], miR221/222 на p27kip1 [11], Мир-21 на Pdcd4 [12], микроРНК-126 p85β [13] Мир-34 на SIRT1 [14], Мир-21 на PTEN [15], Мир-302d на Arid4b [16], Мир-200С на JAG1 [17], и микроРНК-299, 297, 567,609-й VEGFA [18]. Кроме того, Клэнси и др. [19] недавно сообщили, что поступательное регулирование let-7 была обнаружена только при отдельных изоформ мРНК, которые содержат let-7 целевом сайте были обнаружены выборочно. Последняя предполагает, что, по крайней мере в некоторых случаях, поступательное регулирования могут остаться незамеченными в композитных профилей - то есть, когда все изоформы мРНК обнаружении одной мРНК - как получить со многими микрочипов и последовательность анализа. Со-иммунопреципитации миРНК-мРНК комплексов через Argonaute (обычно ago2) или другой связанный белок (РНК иммунопреципитации или RIP) будет изолировать миРНК цели независимо от того, механизм регулирования. Кроме того, RIP определяет эндогенные, и, предположительно, биологически значимым, взаимодействий. Тем не менее, не известно, все ли микроРНК-мРНК взаимодействия функциональных и RIP будет не хватать любой мРНК целей, которые связывают только временно или быстро деградирует. Кроме того, в конкретных миРНК-мРНК партнеры должны быть выведены bioinformatiски, потому что все миРНК-мРНК пар со-осаждается вместе. Наконец, SILAC непосредственно определяет конечный продукт микроРНК регулирования, самого белка, но без учета регистра, и поэтому пропускает редкие белки и небольшие раз изменения уровня белка.

В свете ограничения современных методов идентификации микроРНК цель, мы чувствовали себя дополнительные глобального анализа для выявления функциональных целей микроРНК на альтернативный механизм было необходимо. Чтобы выполнить эту задачу, мы лицензировали технологии изобретены Joop Gaken и Азим Mohamedali из Королевского колледжа в Лондоне. Их изобретение является двойной гибридного белка выбор, в частности, тимидинкиназы-zeocin синтеза, регулируются библиотеки кДНК потенциальных микроРНК целевой последовательности в 3'UTR. Клетки стабильно трансфицированных и выражая TKzeo-кДНК конструкциями могут быть выбраны с zeocin, как показано на рисунке 2. После выражения микроРНК интересов, целей, микроРНК может быть выбран шм ганцикловир, как показано на рисунке 3. Ганцикловир убивает клетки, экспрессирующие тимидинкиназы, то есть любой клетки, экспрессирующие TKzeo-кДНК отсутствует мишень для микроРНК интерес. Целевые кДНК могут быть выделены путем ПЦР-амплификации ДНК из клеток, которые выживают ганцикловиром с использованием праймеров, что фланг кДНК и ПЦР-продукты могут быть упорядочены для определения целей.

Мы разработали технологию колледже короля в новый инструмент для глобальной идентификации и обнаружения человека функциональных целей микроРНК - ID МИССИЯ целевой библиотеки. В библиотеке ID Target, пользователи могут изолировать миРНК цели рядом млекопитающих трансфекции клеточных культур и меры выбор препарата. Библиотека носит комплексный характер и содержит 66-79% генов человека. Первые результаты показывают, что как ранее открытых, так и новые цели могут быть выделены из библиотеки ID целевой МИССИИ.

Хотя протокол некоторой длины,использование библиотеки ID целевой требует стандартных способов молекулярной лаборатории - культуры клеток млекопитающих, трансфекция, выбор препарата, ПЦР и секвенирования - и, следовательно, должна быть в пределах средств большинство биологов. Мы полагаем, что достаточно внимания уделять надлежащее опытно-конструкторских, оптимизации условий культивирования, а главное, предварительное тестирование каждого нового типа клеток, чтобы определить оптимальный уровень препарата для выбора шагов (kill-кривые), чтобы обеспечить успех с библиотекой ID цели.

Как и во всех микроРНК методы опознавания цели, настоятельно рекомендуется, чтобы цели, определенные путем скрининга библиотеки Target ID быть проверены с помощью второго метода, такие, как микрочипы, QRT-PCR, репортер анализа (например, люциферазы), или западные анализа.

Disclosures

Авторы заявляют финансовые отношения с коммерческими структурами, которые заинтересованы в представленной работе.

Acknowledgments

Мы благодарим всю жизнь Sigma наук Миссия Target ID библиотеки разработчиков, особенно Кевин Gutshall нахождения технологии и переговоры условиями лицензии, и Хизер Holemon за ее поддержку и участие в плодотворных дискуссий неисправностей. Мы также благодарим доктора Joop Gäken из Королевского колледжа в Лондоне для свободного обмена неопубликованные результаты и предложения, и Кази Хамид из RxBiosciences для подготовки большой партии кДНК и его настойчивость в получении его клонировать. Мы хотели бы выразить признательность Нань Линь и Скотт Бахр от SAFC для выполнения кДНК массивов и анализа данных.

Миссия является зарегистрированным товарным знаком Sigma-Aldrich биотехнологии LP

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JumpStart REDTaq ReadyMix Sigma-Aldrich P0982
Ganciclovir Sigma-Aldrich G2536
G418 Sigma-Aldrich G8168
Puromycin Sigma-Aldrich P9620
Topo TA Invitrogen KNM4500-01
GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit Sigma-Aldrich G1N10
Cell Specific Nucleofection kit Lonza Inc.
Nucleofector Lonza Inc. AAD-1001
Zeocin Invitrogen R250-01
Target ID Library Sigma-Aldrich MREH01

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Target ID Library Technical Bulletin, Catalog # MREH01. [Internet]. , Sigma Aldrich. St Louis. Available from: http://www.sigma-aldrich.com (2012).
  2. Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis. Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).
  3. Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells. Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).
  4. Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).
  5. Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).
  6. Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).
  7. Thomas, M. Desperately seeking microRNA targets. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).
  8. Baek, D. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).
  9. Guo, H. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).
  10. Ma, L. Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer. Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).
  11. Visone, R., et al. MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle. Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).
  12. Lu, Z., et al. MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene. Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).
  13. Guo, C., et al. The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers. Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).
  14. Yamakuchi, M., et al. miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).
  15. Wickramasinghe, N. S., et al. Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells. Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 Forthcoming.
  16. Ciaudo, C., et al. Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation. PLoS Genetics. 5, e1000620 (2009).
  17. Vallejo, D. M., et al. Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells. EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).
  18. Jafarifar, F., et al. Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP. L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).
  19. Clancy, J. L., et al. mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation. RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).

Tags

Генетика выпуск 62 Target ID микроРНК ncRNA РНК-интерференции геномика
Генома экран для микроРНК цели с помощью ID МИССИЯ целевой библиотеки
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Coussens, M. J., Forbes, K.,… More

Coussens, M. J., Forbes, K., Kreader, C., Sago, J., Cupp, C., Swarthout, J. Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library. J. Vis. Exp. (62), e3303, doi:10.3791/3303 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter