Summary
Target ID-bibliotek är en plasmid-baserad, genomet hela samling av klonat cDNA används för att identifiera miRNA mål. Här visar vi dess användning och tillämpning.
Abstract
Target ID-bibliotek är utformad för att hjälpa till upptäckt och identifiering av mikro-RNA (miRNA) mål. Target ID-bibliotek är en plasmid-baserad, Genomvid cDNA-bibliotek klonat in i 3'UTR nedströms från dubbla valet fusionsprotein, tymidinkinas-Zeocin (TKzeo). Den första omgången av selektion är för stabila transformanter, följt av införande av en miRNA av intresse, och slutligen, selektering med avseende på cDNA-sekvenser innehållande miRNA mål. Valda cDNA identifieras genom sekvensering (se figur 1-3 för Target ID-bibliotek arbetsflöde och detaljer).
För att säkerställa en bred täckning av den mänskliga transkriptom var Target ID-bibliotek cDNA genereras via oligo-dT priming med en pool av totalt RNA framställt från flera mänskliga vävnader och cellinjer. Resulterande cDNA intervallet från 0,5 till 4 kb, med en genomsnittlig storlek av 1,2 kb, och klenades in i p3TKzeo dubbla selektion plasmiden (se figur 4 för plasmid karta). De genmål representerade i litek kan hittas på Sigma-Aldrich hemsida. Resultaten från Illumina sekvensering (tabell 3), visar att biblioteket innehåller 16.922 av de 21,518 unika gener i UCSC RefGene (79%), eller 14.000 gener med 10 eller flera läsningar (66%).
Protocol
1. Transfektion med Target ID-bibliotek och urval för stabila cellinjer
1. Zeocin Kill Kurva
Zeocin används för att selektera för stabilt transfekterade celler. Emellertid orsakar överskott zeocin oönskade fenotypiska svar i de flesta celltyper. Därför måste en kill kurva analys utföras för att fastställa den minsta letala dosen.
- Plattan 1,6 x 10 4-celler till brunnar i en 96-brunnsplatta i 120 | il medium.
- Nästa dag lägga zeocin i ökande koncentrationer varierande från 50 | ig / ml till 1 mg / ml till de lämpliga brunnarna.
- Undersök lönsamheten var 2 dagar.
- Byt medier som innehåller zeocin var 3 dagar. Den minsta koncentration av selektion reagens som orsakar fullständig celldöd efter den önskade tiden bör användas för denna celltyp och experiment. Våra resultat visar att 500 | ag / ml zeocin är optimal för A549, HeLa och MCF7-celler.
2.Bibliotek Transfektion via Nucleofection och urval
- Välja en cellinje som antingen inte uttrycka eller uttrycker låga nivåer av en miRNA av intresse. Den miRNA kommer att införas i avsnitt B för mål val efter stabilt uttryck av Target ID-bibliotek uppnås.
- Kultur / expandera cellerna. Vi har erhållit utmärkta resultat med 2 x 10 7-celler per bibliotek transfektion.
- Trypsinisera celler som är i> 80% konfluens, och överföra 2 x 10 7-celler till en 15 ml sterila skruv topped rör.
- Pelleten trypsinerades cellerna vid 200 x g under 5 minuter.
- Ta medium och tvätta cellpelleten med HBSS eller 1X PBS.
- Centrifugera vid 200 x g under 5 min och aspirera tvätt.
- Upprepa tvättsteget av cellpelleten.
- Förvärma 6-brunnars plattor med 2 ml av komplett medium vid 37 ° C.
- Tillsätt 2 pg av Målidentiteten bibliotek (ej överstigande 10 | il) per 0,5 ml rör för varje transfektion.
- Återsuspendera celler i 15 ml rör från ovan med 100 pl av Amaxa Nucleofection lösning (cellspecifik) per 2 x 10 6-celler. Exempelvis under 10 Nucleofections tillsätt 1 ml av reagens.
- En reaktion vid en tidpunkt, tillsätt 100 | il av celler till 2 pg av plasmiden. Blanda med pipett.
- Överföra blandningen till en Nucleofector kyvett.
- Sätt kuvetten i Nucleofector instrumentet och kördes optimerad som är lämpligt för den cellinje (High Efficiency föredragna framför Cellviabilitet).
- Fyll överföringspipett med förvärmd medium. Ta upp cellerna i samma pipett och överföra till 6-brunnars platta. Upprepa för varje Nucleofection, en per brunn.
- Återgå till tillväxt kammare för inkubering över natten.
- Nästa dag, ersätta mediet och tillåta celler att återhämta sig under 3-5 dagar.
- Byt medium med komplett medium innehållande en lämplig nivå Zeocin, som bestäms från Kill kurvan analysen.
- Monitor celler för Zeocin selektion (celler dö).
- Byt medium med zeocin var 2-3 dagar.
- När sammanflytande i 6-brunnar, passage, pool och expandera celler i större kolvar.
- Tid för expansion av celler är användare och cellinje beroende, men det rekommenderas starkt att expandera zeocin resistenta celler för att generera kryo-lager för framtida screening (ca 2-3 veckor, cellinje beroende).
2. Transfektera Bibliotek Celler med miRNA-uttryck Construct, Välj för stabil cellinje och Välj miRNA mål
Obs: Zeocin valet inte längre behövs eller önskas. Exponering av celler för zeocin under miRNA uttryck och ganciklovir (mål) val kan resultera i förlust av miRNA mål.
3. Puromycin, G418, och ganciklovir Kill Kurvor
- Utföra ett byte kurva för ganciklovir med celler som stabilt uttrycker bibliotek Målidentiteten och med puromycin eller G418 för vildtypceller.
- Plattan 1,6 x 10 4-celler till brunnar i en 96-brunnsplatta med 120 | il färskt medium. Nästa dag lägga 0,1 till 10 | ig / ml puromycin/G418 eller 2 till 32 | iM ganciklovir till utvalda brunnar.
- Undersök lönsamheten var 2 dagar. Byt medier som innehåller val av reagens var 3 dagar. Den minsta koncentration av urval reagens som orsakar komplett * celldöd efter önskad tid, bör användas för detta celltyp och experiment. Våra resultat visar att från 0,25 till 1 | ig / ml puromycin är optimal för A549, HeLa och MCF7-celler, 0,3 ug / ml G418 för MCF7-celler och 8-16 pM ganciklovir är optimala för A549, HeLa och MCF7-celler.
* Obs: Med ganciklovir val får långsam eller ingen celltillväxt observeras utan fullständigt celldöd. Observera cellerna under flera dagars behandling för att verifiera att de inte aktivt dela sig. Om så är fallet så fenolrött i mediet är fortfarande röda. Det kan också vara nödvändigt att utföra en kill kurvan analys av Target ID-bibliotek transfekterade celler om en förändring av känsligheten observeras. Detta kommer dock att behöva fastställas på en celltyp granskning.
4. miRNA Transfektion via Nucleofection och Target val
- Växa / expandera Målceller ID-bibliotek för att uppnå 2 x 10 7-celler, och Trypsinisera när cellerna är i> 80% konfluens.
- Överföring 2 x 10 7-celler till en 15 ml steril skruv toppad röret och pelleten vid 200 xg under 5 minuter.
- Ta medium och tvätta cellpelleten med HBSS eller 1X PBS.
- Centrifugera vid 200 x g under 5 min och aspirera tvätt.
- Upprepa tvättsteget av cellpelleten.
- Förvärma 6-brunnars plattor med 2 ml av komplett medium per brunn vid 37 ° C.
- Tillsätt 2 g av miRNA expressionsplasmid (ej överstigande 10 | il) per 0,5 ml rör för varje transfektion. Origene mikroRNA expressionsplasmider (neomycin - G418 selektion) eller själv-klonade gener miRNA i pBABE-puro (plasmiden 1764; Addgene) har använts med framgång. För den senare var miRNA hårnålen med ~ 200 bp på vardera sidan PCR klonad från mänskligt DNA.
- Återsuspendera celler i 15 ml rör från ovan med 100 pl av Amaxa Nucleofection lösning (cellspecifik) per 2 x 10 6-celler. Till exempel: För 10 Nucleofections, tillsätt 1 ml reagens.
- En reaktion vid en tidpunkt, tillsätt 100 | il av celler till 2 pg av plasmiden. Blanda med pipett.
- Överföra blandningen till en Nucleofector kyvett.
- Sätt kuvetten i Nucleofector instrumentet och kördes optimerad som är lämpligt för den cellinje (High Efficiency föredragna framför cellviabilitet).
- Fyll överföringspipett med förvärmd medium. Ta upp cellerna i samma pipett och överföra till 6-brunnars platta. Upprepa för varje Nucleofection, en per brunn.
- Återgå till tillväxt kammare för inkubering över natten. <li> Sätt medium och tillåta celler att återhämta sig under 3-5 dagar.
- Byt medium med komplett medium innehållande en lämplig nivå av puromycin eller G418 som bestäms från Kill kurvan test innan transfektion med miRNA konstruktionen.
- Övervaka celler för puromycin / G418-selektion (celler dö).
- Byt medium med puromycin / G418 var 2-3 dagar.
- När sammanflytande i 6-brunnar, passage, pool och expandera celler i större kolvar.
- Tid för expansion av celler är användarvänligt beroende, men det rekommenderas starkt att expandera puromycin / G418 resistenta celler för att generera kryo-lager för framtida screening (ca 2-3 veckor, cellinje beroende).
- Byt medium med lämpliga nivåer av ganciklovir (GCV) och puromycin / G418 som bestäms från Kill kurvan test innan transfektion med miRNA konstruktionen.
- Övervaka celler för selektion (celler ska dög, miRNA målinriktning och knockdown av TK-Zeo).
- Expandera cellerna i närvaro av GCV och puromycin / G418.
- Framställ genom-DNA från utvalda GCV-celler.
- PCR-amplifiera skär med kit primers (se PCR-amplifiering).
- Klon i TOPOTA vektor (Invitrogen) för standard sekvensering eller skicka PCR-produkt för djup sekvensering.
3. PCR-amplifiera valda bibliotek Insatser och Sequence
Obs: Denna procedur utförs för att PCR-amplifiera biblioteket mål som har överlevt ganciklovir valet.
5. Samla ganciklovir valda celler för att förbereda kromosomalt DNA med hjälp av en GenElute däggdjur Genomiskt DNA Miniprep Kit (katalognummer G1N10) eller motsvarande. Vi rekommenderar att förbereda DNA från modercellinjen som inte innehåller biblioteket Target ID för att använda som en negativ kontroll för jämförelse med DNA från mål-selekterade celler i PCR.
- PCR-Amexemplifiera det genomiska DNA: t med amplifieringsprimer 1 och amplifieringsprimer 2. Framgångsrik amplifiering har erhållits med JumpStart REDTaq readymix Reaktionsmix - för PCR (katalognummer P0982). Optimering av betingelser kan det vara nödvändigt om en annan polymeras används. Se tabell 1 för en prov-PCR-konfiguration och tabell 2 för PCR cykelbetingelser.
- Lös 2-5 | il av PCR-produkten på en 1% agarosgel. Den förväntade produkten bör vara en fläck med lite synliga DNA band. Jämför att styra PCR-produkt av genomiskt DNA från celler utan Målidentiteten bibliotek.
- Vidare med kloning och / eller djup sekvensering av PCR-produkt. Om ingen amplifieringsprodukt observeras eller är identiska med kontroll-DNA, optimera PCR-amplifieringsprodukterna betingelser (dvs., primerkoncentration, glödgningstemperatur, och cykler).
6. Kloning och sekvensering
Obs: Vi rekommenderar att klona PCR-produktens och att sedan utföra standard sekvensering av åtminstone 96 av klonerna med amplifieringsprimrarna som tillhandahålls i kitet. Detta förfarande har utförts med framgång med användning av 96-brunnars övernattskulturer och plasmid reningssystem. Även om djup sekvensering önskas kan preliminära resultat från kloning och sekvensering standarden användas som en kvalitetskontroll för att bestämma huruvida den extra kostnaden för djup-sekvensering är befogad.
- Följa TA kloningskit tillverkarens protokoll för kloning PCR-amplifieringsprodukter (ovan).
- Förvandla kloner till kompetenta bakterieceller och välj övernattning på antibiotika medium.
- Isolera och odla individuella kolonier i flytande kultur med lämplig antibiotika.
- Rena plasmid-DNA. 6,5. Utföra sekvenseringsreaktioner med amplifieringsprimrar.
- Identifiera gen mål genom BLAST inriktning av sekvenser med humant transkriptom (för kända avskrifter) och Human Genome (för ny transcripts). *
* Kloning Felsökning: Om ett stort antal insatser från sekvensering är plasmidsekvensen, optimera kloning / sekvensering villkor som sådan:
- PCR-amplifiering produkt (insats) kvalitet och kvantitet
- Ligeringsreaktion
- Plasmidberedning (kvalitet och kvantitet)
- Sekvensering reaktionsbetingelser
4. Representativa resultat
Bibliotek skärm för mir-373 mål
För att utvärdera prestanda uppdraget Target ID-bibliotek, var mir-373 mål väljs från MCF-7 bibliotek uttryckande celler. MCF-7 valdes eftersom den uttrycker lite eller inget detekterbart miR-373 (data ej visade). miR-373 valdes för dess biologiskt intresse. miR-373 uttryck främjar tumörinvasion och metastas i MCF-7, normalt en icke-metastatisk cellinje [2]. Dessutom, miR-373 ortologer från mus miR-290 kluster är involverade i mus embryonala stamcellercellupprätthållande [3] och miR-373 familjemedlem, miR-372, främjar fibroblast omfördelas till inducerade pluripotenta stamceller [4]. Slutligen använde vi zinkfinger nukleaser att infoga en PGK promotor-miR-373 expressionskonstruktet i AAVS1 platsen i MCF-7 celler, och genererade en lista över potentiella miR-373 mål genom RNA microarray analys (data visas ej).
Target-ID-biblioteket transfekterades in MCF-7 celler, och en stabil population av celler valdes och amplifierades i zeocin-innehållande medium. De resulterande cellerna (MCF-7-bibliotek) transfekterades stabilt med en miR-373 som uttrycker konstruktionen och selekterades i ganciklovir-innehållande medium för att anrika med avseende på celler som uttrycker back-373 mål. Vi konstaterade att den negativa kontrollen MCF-7 bibliotek celler (utan att miR-373) inte lossnar och blir rundad som väntat för döda celler. Men gjorde de slutar växa, som lätt upptäcktes eftersom fenolrött-mediet inte blev orange-gula som observerades for-celler som uttrycker miR-373 (fig. 5). Cellerna expanderades i ganciklovir-innehållande medium, och målsekvenser isolerades genom PCR med primrar som flankerar mål-ID-bibliotek cDNA-insättningar och DNA som framställts från de överlevande cellerna. PCR-produkterna Illumina sekvenserades.
Såsom visas i tabell 4, erhöll vi 17.740.719 cDNA läsningar, som avbildas till 11,076 unika gener. Av dessa unika gener, var 2.898 detekterades med mer än 40 läsningar, och därför ansågs tillförlitliga träffar. Den 13.106.469 vektorn läser förväntades eftersom de PCR-primers som används för att amplifiera cDNA-insättningar är 40 och 300 baser från införingsstället. Som sådan, kan det förväntas att de flesta resulterande sekvenserna skulle vara från vektorn skillnad mer traditionella djup sekvensering av genomiskt material. Fjorton procent inte mappas till antingen vektor-eller cDNA, men fick anpassa NCBI: s icke-redundant nukleotid-databasen (dvs. med NR träff), och endast 1% hade ingen cDNA insert.
En första jämförelse visade att 10 av de unika gener som identifierats med målet ID-bibliotek också i listan över tidigare identifierats miR-373 mål i TarBase (tabell 5). Dessa 10 miR-373 mål tidigare identifierats genom mikromatris med RNA från HeLa-celler transient transfekterade med en syntetisk miR-373 efterlikna [5]. Vidare upptäckte vi dessa samma 10 gener nedreglerat i MCF-7-celler som uttrycker miR-373 från AAVS1 ställe (data ej visade). Därför är dessa 10 är troliga giltiga mål för MIR-373. Arbete pågår för att karakterisera lista över potentiella mål och försök att validera utvalda hits experimentellt av RT-qPCR, Western blot och luciferas reporter analys.
Figur 1. Arbetsflöde för Target ID-bibliotek. Sektioner AC: Se avsnitt i arbetsordningen. Varje steg visas och beskrivs i detalj i
Figur 2. Transfektion och Zeocin urval. Target-ID-bibliotek är en samling plasmider (A), vardera med en human cDNA insatt i 3'-UTR efter en tymidinkinas-zeocin-fusionsprotein (TKzeo; fig. 4). Cellerna transfekterades med Målidentiteten biblioteket (B) och fick återhämta sig under 3-5 dagar. Konstruktionerna kan integreras i genomet under denna återhämtningsperiod (C), och uttrycker det kodade transkriptet (D). Efter återhämtning, exponeras celler för Zeocin (E). Celler som uttrycker TKzeo fusionsproteinet från stabilt integrerade konstruktioner Målidentiteten överleva selektion zeocin (F). Otransfekterade celler dör (G). Dessutom, några celler innehållande en konstruktion som är ett mål för en endogen miRNA eller othER faktor uttrycks i cellen som hämmar uttrycket av TKzeo från Target ID konstruktionen kommer att dö (H).
Figur 3. MiRNA transfektion och ganciklovir selektion. Celler innehållande mål-ID-bibliotek (dvs., zeocin-selekterade celler) transfekterades med en selekterbar mikroRNA expressionskonstruktion (A). Under återhämtningen kan miRNA expressionskonstruktionen integrera (B) och uttrycka den selekterbara markör som kodas på den miRNA konstruktet. Efter selektion för stabil integrering (C) och cellexpansion behandlas celler med ganciklovir (D). Celler som producerar tymidinkinas (TK) i närvaro av ganciklovir (dvs celler som uttrycker TKzeo inte konstruktioner är målet för den miRNA) kommer att dö (E) Å andra sidan kommer celler som innehåller biblioteket konstruktioner med miRNA målet är befrielse från inkomstskatt kommer inte att ge TK, och därför kommer att överleva ganciklovir val (F). Överlevande celler kan odlas, gDNA isolerade, och cDNA innehållande miRNA målställen PCR-amplifieras med användning av de målinriktade primrar ID Amplification. PCR-produkter kan sekvenseras och i linje med det mänskliga genomet för att identifiera miRNA mål.
Figur 4. Plasmid Karta och läge av amplifieringsprimers. Sfil är ställena för cDNA-kloning.
Primersekvenser
UPPDRAG Målidentiteten amplifieringsprimer 1
5 ACGACGTGACCCTGTTCATC 3
UPPDRAG Målidentiteten amplifieringsprimer 2
5 TAAAACGACGGCCAGTGAAT 3
ig5.jpg "alt =" Bild 5 "/>
Figur 5. Ganciklovir effekt på celltillväxt. Tjugofyra brunnsplattor såddes med 2 till 100.000 MCF-7 celler eller MCF-7-celler som innehåller biblioteket Målidentiteten. Tjugofyra timmar senare ersattes mediet med medium innehållande 0, 8, eller 16 ^ iM ganciklovir. Efter 15 dagar, plattan fotograferades (6 övre brunnarna), varefter brunnarna tvättades med HBSS och färgas med Brilliant Blue R-färgningslösning (B6529) (6 nedre brunnar). Notera att ganciklovir har någon effekt på MCF-7 celler utan bibliotek eftersom de inte uttrycker tymidinkinas (TK). Å andra sidan, MCF-7-bibliotek celler uttrycker TK men är inte helt dödas av ganciklovir på 8 eller 16 pM, vilket framgår av de levande cellerna tar upp Brillinat Blue. Men sluta biblioteket cellerna växer i ganciklovir, vilket framgår av färgen på fenolrött färgämnet i deras medium. De gripna celler inte surgör inte deras medium och färgen är röd istället för att ändra ellerorange-gul.
| Reagens | Volym / reaktion |
| Jumpstart REDTaq readymix reaktionsblandning | 10 pl |
| Amplifieringsprimer 1 (25 pM) | 0,2 pl |
| Amplifieringsprimer 2 (25 ^ M) | 0,2 pl |
| Genomiskt DNA | 50-200 ng |
| Vatten, molekylärbiologisk kvalitet | till 20 | il |
Tabell 1.
| Steg | Temp. | Tid | Cykler |
| Initial denaturering | 95 ° C | 5 min. | 1 |
| Denaturering | 95 ° C | 30 sek. | pan = "3"> 40 cykler |
| Glödgning * | 62 ° C | 30 sek. | |
| Förlängning | 68 ° C | 2 min. | |
| Slutlig förlängning | 68 ° C | 5 min. | 1 |
| Hålla | 4 ° C | Hålla |
Tabell 2.
* Glödgningstemperaturer kan variera, men vi har observerat de bästa amplifieringsprodukterna med hybridisering temperaturer mellan 53 och 64 ° C.
Tabell 3. Target ID-bibliotek innehåll genom Illumina sekvensering.
Tabell 4. Mir-373 utvalda mål av Illumina sekvensering.
les/ftp_upload/3303/3303table5.jpg "alt =" Tabell 5 "/>Tabell 5. 10 mål som tidigare identifierats av RNA microarray.
Discussion
mikroRNA är 20-24 nukleotid RNA som reglerar genuttrycket efter transkriptionellt genom att hämma mRNA translation, och ofta, destabilisera de riktade mRNA (över [6]). En enda miRNA kan reglera flera hundra mRNA för att styra en cell svar på utvecklings-och miljö-signaler. Identifiering och validering mål mRNA är viktigt att bestämma ett miRNA roll och funktion i dessa vägar. Dock är målet identifiering inte okomplicerad eftersom det i djur, miRNA och deras platser mål inte är helt komplementära. "Fröet"-regionen, baserar 2 till 7 från 5'-änden av miRNA, är vanligen komplementär till sitt mål. Det finns dock många undantag från fröet regel och nedströms bas-parning kan kompensera för en bristfällig frö match. Ett antal algoritmer har utvecklats för att förutsäga miRNA mål som bygger på utsäde matchning och nedströms ersättning målstruktur end position, sekvenskonservering, och diverse andra parametrar som har undersökts för experimentellt validerade mål (över [7]). Även i silico förutsägelser är bekväma och gör identifiera många giltiga miRNA mål, förutspådde de flesta gener inte experimentella validering tester och många verkliga mål inte förutses. Eftersom algoritmer är baserade på tidigare fastställda mål funktioner, tillåter de inte upptäckten av mål som avviker från vad som redan känt.
Ett antal experimentella system har använts framgångsrikt för att identifiera eller upptäcka funktionella miRNA mål i levande celler. Dessa globala screeningsmetoder innefattar mikromatriser och RNA-sekvensering, RNA samimmunfällning (RIP), och stabil isotop märkning med Aminosyror i cellkultur (SILAC), en metod proteomik (översikt i [7]). Varje metod har sina fördelar och nackdelar. Eftersom miRNA inriktning destabiliserar ofta en mRNA och leder till dess nedbrytning, förlust or vinst i mRNA nivå efter att införa en miRNA efterlikna eller hämmare, respektive kan identifiera miRNA mål. Denna förlust eller vinst av mRNA lätt upptäcks av microarray eller djup sekvensering. Medan mRNA detekteringsmetoder är enklare och mer känsliga än metoder protein detektion kommer mRNA detektion missar några miRNA mål som inte bryts ned. Nya rapporter från Bartell labbet jämföra resultat miRNA målet från RNA-detektion med dem från SILAC [8] eller ribosomen profilering [9] visar att däggdjur miRNA huvudsakligen verkar genom att minska nivåerna mål-mRNA. Emellertid, har många andra laboratorier som arbetar med individuella miRNA mål detekterad förändring i proteinet men ingen förändring i mRNA-nivå. Rapporter om vad som verkar vara translationell reglering utan påvisbar mRNA förluster inkluderar: miR-10b den HOXD10 [10], miR221/222 den p27kip1 [11], miR-21 på Pdcd4 [12], miR-126 på p85β [13] , miR-34 den SIRT1 [14], miR-21 på PTEN [15], miR-302d den Arid4b [16], miR-200C på JAG1 [17] och miR-299, 297, 567, ennd 609 om VEGFA [18]. Dessutom Clancy et al [19] rapporterade nyligen att translationell reglering av låt-7 endast upptäcktes när enskilda mRNA-isoformer som innehåller LET-7 målområdet upptäcktes selektivt. Den senare tyder på att åtminstone i vissa fall kan translationell reglering förbises i en sammansatt profil - det vill säga när alla mRNA-isoformer upptäcks som en mRNA - som erhållits med många microarray och analyser sekvens. Co-immunoprecipitering av miRNA-mRNA-komplex via argonaute (vanligtvis ago2) eller någon annan tillhörande protein (RNA immunoprecipitation, eller RIP) kommer att isolera miRNA mål oberoende av reglering mekanism. Dessutom upptäcker RIP endogena, och förmodligen biologiskt relevanta interaktioner. Det är dock inte känt om alla miRNA-mRNA interaktioner är funktionella och RIP skulle missa några mRNA mål som associerar enbart övergående eller snabbt försämras. Dessutom måste särskilda miRNA-mRNA partner härledas bioinformatitiskt eftersom alla miRNA-mRNA paren samutfällas tillsammans. Slutligen identifierar SILAC direkt slutprodukten av miRNA reglering, proteinet i sig, utan är okänslig och därför missar sällsynta proteiner och små gånger förändringar i protein nivåer.
Mot bakgrund av de begränsningar som nuvarande identifiering miRNA mål metoder kände vi ytterligare ett globalt analys för att identifiera funktionella miRNA mål genom en alternativ mekanism behövdes. För att uppfylla detta behov licensierat vi en teknik som uppfanns av Joop Gaken och Azim Mohamedali av Kings College London. Deras uppfinning är en dubbel selektion fusionsprotein, specifikt en tymidinkinas-zeocin fusion regleras genom en cDNA-bibliotek av potentiella sekvenser miRNA mål på dess 3'UTR. Celler stabilt transfekterade med och uttryckande TKzeo-cDNA-konstruktioner kan väljas med zeocin, såsom illustreras i fig. 2. Efter att uttrycka en miRNA av intresse, som kan miRNA: s mål väljas wite ganciklovir, såsom visas i fig 3. Ganciklovir dödar celler som uttrycker tymidinkinas, det vill säga, vilka som helst celler som uttrycker TKzeo-cDNA saknar ett mål för miRNA av intresse. Riktad cDNA kan isoleras genom PCR-amplifiering av DNA från celler som överlever ganciklovir med primrar som flankerar cDNA och PCR-produkter kan sekvenseras för att identifiera mål.
Vi har utvecklat Kings College teknik i ett nytt verktyg för global identifikation och upptäckt av funktionella mänskliga miRNA mål - uppdraget Target ID-bibliotek. Med målet ID-bibliotek, kan användare isolera miRNA mål genom en serie av däggdjur cellodling transfektion och drog stegen urval. Biblioteket är omfattande och innehåller 66-79% av mänskliga gener. Initiala resultat indikerar att både tidigare upptäckt och nya mål kan isoleras från beskickningen Målidentiteten bibliotek.
Även om protokollet är av viss längd,användning av Target ID-bibliotek kräver vanliga molekylära lab tekniker - däggdjursceller kultur, transfektion, läkemedel urval, PCR och sekvensering - och därför bör vara väl inom de medel de flesta biologer. Vi föreslår att tillräcklig uppmärksamhet ägnas åt lämplig experimentell design, optimering odlingsbetingelser, och viktigast av allt, pre-test varje ny celltyp för att bestämma optimala läkemedelsnivåer vid urvalet stegen (kill-kurvor) för att säkerställa framgång med målet ID-bibliotek.
Som med alla miRNA mål identifieringsmetoder, är det starkt rekommenderat att målen identifierats genom screening biblioteket Target ID kan valideras med en andra metod, såsom microarray, QRT-PCR, reporter analys (dvs. luciferas) eller Western analys.
Disclosures
Författarna förklarar ekonomiska relationer med kommersiella aktörer som har ett intresse i det inlämnade arbetet.
Acknowledgments
Vi tackar hela Sigma Life Science Mission Target ID laget Bibliotek utveckling, särskilt Kevin Gutshall för att hitta den teknik och förhandla licensvillkoren och Heather Holemon för hennes stöd och deltagande i givande felsökning diskussioner. Vi tackar också Dr Joop Gäken av Kings College London för fritt dela opublicerade resultat och förslag och Qazi Hamid i RxBiosciences för att framställa en stor sats av cDNA och hans uthållighet att få det klonas. Vi vill tacka för Nan Lin och Scott Bahr från SAFC för att utföra cDNA arrayer och dataanalys.
Mission är ett registrerat varumärke för Sigma-Aldrich Biotechnology LP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| JumpStart REDTaq ReadyMix |  Sigma-Aldrich |
P0982 | |
| Ganciclovir | Sigma-Aldrich | G2536 | |
| G418 | Sigma-Aldrich | G8168 | |
| Puromycin | Sigma-Aldrich |
P9620 | |
| Topo TA | Invitrogen | KNM4500-01 | |
| GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit | Sigma-Aldrich |
G1N10 | |
| Cell Specific Nucleofection kit | Lonza Inc. | ||
| Nucleofector | Lonza Inc. | AAD-1001 | |
| Zeocin | Invitrogen | R250-01 | |
| Target ID Library | Sigma-Aldrich | MREH01 |
References
- Target ID Library Technical Bulletin, Catalog # MREH01. [Internet]. , Sigma Aldrich. St Louis. Available from: http://www.sigma-aldrich.com (2012).
- Huang, Q., Gumireddy, K., Schrier, M. The microRNAs miR-373 and miR-520c promote tumour invasion and metastasis. Nat. Cell Biol. 10 (2), 202-210 (2008).
- Lichner, Z., Pall, E., Kerekes, A. The miR-290-295 cluster promotes pluripotency maintenance by regulating cell cycle phase distribution in mouse embryonic stem cells. Differentiation. 81 (1), 11-24 (2011).
- Subramanyam, D., Lamouille, S., Judson, R. L. Multiple targets of miR-302 and miR-372 promote reprogramming of human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29 (5), 443-448 (2001).
- Lim, L. P., Lau, N. C., Garrett-Engele, P. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs. Nature. 433 (7027), 769-773 (2005).
- Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat. Rev. Genet. 12 (2), 99-110 (2011).
- Thomas, M. Desperately seeking microRNA targets. Nat. Struc. Mol. Biol. 17 (10), 1169-1174 (2010).
- Baek, D. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 71-71 (2008).
- Guo, H. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (3708), 835-840 (2010).
- Ma, L. Tumour invasion and metastasis initiated my microRNA-10b in breast cancer. Nature. 449 (7163), 682-688 (2007).
- Visone, R., et al. MicroRNAs miR-221 and miR-222, both overexpressed in human thyroid papillary carcinomas, regulate p27Kip1 protein levels and cell cycle. Endocrine-Related Cancer. 14 (3), 791-798 (2007).
- Lu, Z., et al. MicroRNA-21 promotes cell transformation by targeting the programmed cell death 4 gene. Oncogene. 27 (31), 4373-4379 (2008).
- Guo, C., et al. The noncoding RNA, miR-126, suppresses the growth of neoplastic cells by targeting phosphatidylinositol 3-kinase signaling and is frequently lost in colon cancers. Genes Chrom. Cancer. 47 (11), 939-946 (2008).
- Yamakuchi, M., et al. miR-34a repression of SIRT1 regulates apoptosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (36), 13421-13426 (2008).
- Wickramasinghe, N. S., et al. Estradiol downregulates miR-21 expression and increases miR-21 target gene expression in MCF-7 breast cancer cells. Nucleic Acid Res. 37 (8), 2584-2595 Forthcoming.
- Ciaudo, C., et al. Highly dynamic and sex-specific expression of microRNAs during early ES cell differentiation. PLoS Genetics. 5, e1000620 (2009).
- Vallejo, D. M., et al. Targeting Notch signaling by the conserved miR-8/200 microRNA family in development and cancer cells. EMBO J. 30 (4), 756-769 (2011).
- Jafarifar, F., et al. Repression of VEGFA by CA-rich element-binding microRNAs is modulated by hnRNAP. L. EMBO J. 30 (7), 1324-1334 (2011).
- Clancy, J. L., et al. mRNA isoform diversity can obscure detection of miRNA-mediated control of translation. RNA. 17 (6), 1025-1033 (2011).
