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Biology

MiRNA मिशन लक्ष्य आईडी पुस्तकालय का उपयोग लक्ष्य के लिए जीनोम चौड़ा स्क्रीन

Published: April 6, 2012 doi: 10.3791/3303
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1
1Sigma-Aldrich
* These authors contributed equally

Summary

लक्ष्य आईडी लाइब्रेरी एक प्लाज्मिड आधारित, जीनोम चौड़ा क्लोन miRNA लक्ष्यों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया सीडीएनए का संग्रह है. यहाँ हम इसके उपयोग और आवेदन प्रदर्शित करता है.

Abstract

लक्ष्य आईडी पुस्तकालय के लिए खोज और microRNA की पहचान (miRNA) के लक्ष्य में सहायता करने के लिए डिज़ाइन किया गया है. लक्ष्य आईडी लाइब्रेरी एक प्लाज्मिड आधारित, जीनोम चौड़ा सीडीएनए से दोहरे चयन संलयन प्रोटीन, thymidine kinase - zeocin के (TKzeo) से 3'UTR अनुप्रवाह में क्लोन पुस्तकालय है. चुनाव के पहले दौर स्थिर transformants के लिए है, ब्याज की एक miRNA की शुरुआत के साथ पीछा किया, और अंत में, miRNA लक्ष्य युक्त cDNAs के लिए चयन. चयनित cDNAs अनुक्रमण (चित्रा लक्ष्य आईडी लाइब्रेरी कार्यप्रवाह और जानकारी के लिए 1-3 देखें) की पहचान कर रहे हैं.

मानव transcriptome की व्यापक कवरेज सुनिश्चित करने के लिए, लक्ष्य आईडी पुस्तकालय cDNAs oligo-dt भड़काना कई मानव ऊतकों और सेल लाइनों से तैयार कुल शाही सेना के एक पूल का उपयोग कर के माध्यम से उत्पन्न किया गया. सीडीएनए रेंज 0.5 से 4 केबी करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप, 1.2 केबी के एक औसत आकार के साथ, और थे p3TKzeo दोहरे चयन प्लाज्मिड में क्लोन (चित्रा 4 के लिए प्लाज्मिड नक्शा देखें). जीन ली में प्रतिनिधित्व लक्ष्यbrary सिग्मा Aldrich वेबपृष्ठ पर पाया जा सकता है. Illumina (तालिका 3) अनुक्रमण, से परिणाम बताते हैं कि पुस्तकालय UCSC RefGene में 21,518 अद्वितीय जीन (79%) 16,922, या 10 या पढ़ता अधिक (66%) के साथ 14,000 जीन शामिल हैं.

Protocol

1. लक्ष्य आईडी और स्थिर सेल लाइन्स के लिए लाइब्रेरी चयन के साथ प्रोटोकॉल

1. Zeocin मार डालो वक्र

Zeocin स्थिरतापूर्वक ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, अतिरिक्त zeocin के सबसे प्रकार की कोशिकाओं में अवांछित प्ररूपी प्रतिक्रिया का कारण बनता है. इसलिए, एक को मार वक्र विश्लेषण करने के लिए कम से कम घातक खुराक स्थापित किया जाना चाहिए.

  1. 1.6 प्लेट x 10 कुओं में 4 मीडिया के 120 μl में 96 अच्छी तरह से थाली की कोशिकाओं.
  2. अगले दिन 50 / μg मिलीलीटर से 1 मिलीग्राम / उचित कुओं के लिए मिलीलीटर लेकर सांद्रता बढ़ाने में zeocin जोड़ें.
  3. व्यवहार्यता 2 दिन की जांच हर.
  4. हर 3 दिन zeocin युक्त मीडिया बदलें. चयन अभिकर्मक के न्यूनतम एकाग्रता है कि वांछित समय के बाद पूरी कोशिका मृत्यु का कारण बनता है कि सेल प्रकार और प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. हमारे परिणाम बताते हैं कि 500 ​​zeocin / μg एमएल A549 के लिए इष्टतम है, HeLa, और MCF7 कोशिकाओं.

2.Nucleofection और चयन के माध्यम से पुस्तकालय प्रोटोकॉल

  1. एक सेल लाइन है कि या तो व्यक्त या नहीं अपने हित की miRNA के निम्न स्तर को व्यक्त करता है. miRNA बी धारा में लक्ष्य के चयन के लिए पेश किया जाएगा लक्ष्य आईडी लाइब्रेरी की स्थिर अभिव्यक्ति के बाद हासिल की है.
  2. संस्कृति / कोशिकाओं का विस्तार. हम 2 एक्स 10 7 पुस्तकालय अभिकर्मक प्रति कोशिकाओं के साथ उत्कृष्ट परिणाम प्राप्त किया है.
  3. कोशिकाओं है कि 80% confluency हैं Trypsinize, और एक 15 मिलीलीटर बाँझ पेंच में सबसे ऊपर ट्यूबों 2 एक्स 10 7 कोशिकाओं हस्तांतरण.
  4. गोली 200 XG में 5 मिनट के लिए कोशिकाओं trypsinized.
  5. मध्यम निकालें और HbSS या 1X पीबीएस के साथ सेल गोली धोने.
  6. 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र और धोने महाप्राण (व्यंजन).
  7. सेल गोली धो कदम दोहराएँ.
  8. पूर्व गर्म 37 पर 6 अच्छी तरह से पूरा मध्यम के 2 मिलीग्राम के साथ प्लेटों डिग्री सेल्सियस
  9. 0.5 मिलीग्राम ट्यूब के प्रत्येक अभिकर्मक लिए प्रति लक्ष्य आईडी लाइब्रेरी की μg (2 से 10 μl से अधिक नहीं) जोड़ें.
  10. 100 Amaxa Nucleofection समाधान के प्रति 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं (विशेष सेल) μl के साथ ऊपर से 15 मिलीलीटर ट्यूब में resuspend कोशिकाओं. उदाहरण के लिए, 10 Nucleofections के लिए अभिकर्मक के 1 मिलीलीटर जोड़ें.
  11. एक समय में एक प्रतिक्रिया, प्लाज्मिड के 2 μg कक्षों की 100 μl जोड़ने. विंदुक के साथ मिश्रण.
  12. मिश्रण एक Nucleofector क्युवेट के लिए स्थानांतरण.
  13. Nucleofector साधन में क्युवेट डालें और अनुकूलित सेल लाइन (उच्च क्षमता सेल व्यवहार्यता से अधिक पसंद) के लिए उपयुक्त प्रोग्राम चलाते हैं.
  14. पूर्व गर्म मध्यम के साथ स्थानांतरण विंदुक भरें. वही विंदुक और 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए स्थानांतरण में कोशिकाओं को ले लो. प्रत्येक Nucleofection के लिए दोहराएँ, एक अच्छी तरह से प्रति.
  15. इस ऊष्मायन लिए रातोंरात वृद्धि कक्ष पर लौटें.
  16. अगले दिन, मध्यम जगह और 3-5 दिनों के लिए कोशिकाओं को ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं.
  17. पूरा zeocin का उचित स्तर, के रूप में मार वक्र विश्लेषण से निर्धारित युक्त मध्यम के साथ मध्यम बदलें.
  18. मोnitor zeocin चयन के लिए कोशिकाओं (कोशिकाओं को मरने).
  19. हर zeocin 2-3 दिन के साथ मध्यम बदलें.
  20. 6 अच्छी तरह से थाली, बीतने के पूल में एक बार मिला हुआ और बड़े बोतल में कोशिकाओं का विस्तार.
  21. कोशिकाओं के विस्तार के लिए समय की लंबाई उपयोगकर्ता और सेल निर्भर लाइन है, लेकिन यह अत्यधिक zeocin प्रतिरोधी कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए भविष्य में जांच के लिए क्रायो - स्टॉक उत्पन्न की सिफारिश की है (~ 2-3 सप्ताह, निर्भर सेल लाइन).

2. Transfect पुस्तकालय कक्ष, miRNA अभिव्यक्ति के निर्माण के साथ स्थिर सेल लाइन के लिए चयन करें, और miRNA लक्ष्य का चयन करें

नोट: Zeocin चयन या उससे अधिक समय की आवश्यकता है वांछित है. कोशिकाओं का एक्सपोजर miRNA अभिव्यक्ति और ganciclovir चयन (लक्ष्य) के दौरान zeocin miRNA लक्ष्य की हानि में परिणाम कर सकते हैं.

3. Puromycin, G418, और Ganciclovir मार डालो घटता

  1. जंगली प्रकार के लिए एक कोशिकाओं के साथ ganciclovir stably लक्ष्य आईडी लाइब्रेरी व्यक्त करने के लिए और puromycin या G418 के साथ मार वक्र प्रदर्शनकोशिकाओं.
  2. 1.6 प्लेट x 10 120 μl ताजा मीडिया के साथ एक 96 - अच्छी तरह से थाली के कुओं में 4 कोशिकाओं. अगले दिन 0.1 से 10 μg / puromycin/G418, या 2 मिलीलीटर 32 माइक्रोन चयनित कुओं ganciclovir जोड़ें.
  3. व्यवहार्यता 2 दिन की जांच हर. चयन अभिकर्मक हर 3 दिन युक्त मीडिया बदलें. चयन अभिकर्मक है कि वांछित समय के बाद पूरी कोशिका मृत्यु * कारणों का न्यूनतम एकाग्रता, कि कोशिका प्रकार और प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए. हमारे परिणाम बताते हैं कि 0,25 करने के लिए 1 μg / एमएल puromycin A549 के लिए इष्टतम है, HeLa, और MCF7 कोशिकाओं, 0.3 μg / MCF7 कोशिकाओं के लिए मिलीलीटर G418 और 8-16 माइक्रोन ganciclovir A549 के लिए इष्टतम है, HeLa, और MCF7 कोशिकाओं.

    * नोट: ganciclovir चयन के साथ, धीमी या कोई सेल के विकास के पूरा कोशिका मृत्यु के बिना देखा जा सकता है. कई दिनों के उपचार सत्यापित करने के लिए वे सक्रिय रूप से नहीं बांट रहे हैं पर कोशिकाओं का निरीक्षण करते हैं. यदि यह मामला है, तो मध्यम में phenol के लाल लाल रहता है. यह भी आवश्यक हो की प्रदर्शन कर सकते हैंकरेंगे वक्र विश्लेषण लक्ष्य आईडी पुस्तकालय की कोशिकाओं ट्रांसफ़ेक्ट अगर संवेदनशीलता में परिवर्तन मनाया जाता है. हालांकि, यह एक सेल विशिष्ट प्रकार के आधार पर निर्धारित करने की आवश्यकता होगी.

4. Nucleofection और लक्ष्य के चयन के माध्यम से miRNA प्रोटोकॉल

  1. आगे बढ़ें / लक्ष्य आईडी लाइब्रेरी कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए 2 एक्स 10 7 कोशिकाओं को पाने के लिए, और trypsinize जब कोशिकाओं> 80% confluency हैं.
  2. स्थानांतरण 2 एक्स 10 एक 15 मिलीलीटर बाँझ पेंच 7 कोशिकाओं 200 XG में 5 मिनट के लिए ट्यूब और गोली में सबसे ऊपर है.
  3. मध्यम निकालें और HbSS या 1X पीबीएस के साथ सेल गोली धोने.
  4. 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र और धोने महाप्राण (व्यंजन).
  5. सेल गोली धो कदम दोहराएँ.
  6. पूर्व गर्म 37 पर 6 अच्छी तरह से अच्छी तरह से प्रति पूरी तरह माध्यम के 2 मिलीग्राम के साथ प्लेटों डिग्री सेल्सियस
  7. MiRNA अभिव्यक्ति प्लाज्मिड (से 10 μl से अधिक नहीं) प्रति 0.5 प्रत्येक अभिकर्मक के लिए मिलीलीटर ट्यूब 2 μg जोड़ें. Origene MicroRNA अभिव्यक्ति प्लास्मिड (Neomycin जी418) चयन या स्वयं क्लोन pBABE Puro (प्लास्मिड 1764 में miRNA जीन, Addgene) के सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है. बाद के लिए, दोनों तरफ ~ 200 बीपी के साथ miRNA बाल के लिये कांटा पीसीआर मानव डीएनए से क्लोन किया गया था.
  8. 100 Amaxa Nucleofection समाधान के प्रति 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं (विशेष सेल) μl के साथ ऊपर से 15 मिलीलीटर ट्यूब में resuspend कोशिकाओं. उदाहरण के लिए: 10 Nucleofections के लिए, अभिकर्मक के 1 मिलीग्राम जोड़ें.
  9. एक समय में एक प्रतिक्रिया, प्लाज्मिड के 2 μg कक्षों की 100 μl जोड़ने. विंदुक के साथ मिश्रण.
  10. मिश्रण एक Nucleofector क्युवेट के लिए स्थानांतरण.
  11. Nucleofector साधन में क्युवेट डालें और अनुकूलित सेल लाइन (उच्च दक्षता सेल व्यवहार्यता से अधिक पसंद है) के लिए उपयुक्त प्रोग्राम चलाते हैं.
  12. पूर्व गर्म मध्यम के साथ स्थानांतरण विंदुक भरें. वही विंदुक और 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए स्थानांतरण में कोशिकाओं को ले लो. प्रत्येक Nucleofection के लिए दोहराएँ, एक अच्छी तरह से प्रति.
  13. इस ऊष्मायन लिए रातोंरात वृद्धि कक्ष पर लौटें.
    14. <> ली मध्यम बदलें और कोशिकाओं को 3-5 दिनों के लिए ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं.
  14. पूरा puromycin या G418 के उचित स्तर के रूप में मारने वक्र निर्माण miRNA साथ अभिकर्मक से पहले प्रदर्शन परीक्षण से निर्धारित मध्यम युक्त के साथ मध्यम बदलें.
  15. मॉनिटर / puromycin G418 चयन () कोशिकाओं को मरने के लिए कोशिकाओं को.
  16. मध्यम / puromycin G418 हर 2-3 दिन के साथ बदलें.
  17. 6 अच्छी तरह से थाली, बीतने के पूल में एक बार मिला हुआ और बड़े बोतल में कोशिकाओं का विस्तार.
  18. कोशिकाओं के विस्तार के लिए समय की लंबाई उपयोगकर्ता निर्भर है, लेकिन यह अत्यधिक की सिफारिश की है / puromycin G418 प्रतिरोधी कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए भविष्य में जांच के लिए क्रायो - स्टॉक उत्पन्न (~ 2-3 सप्ताह, निर्भर सेल लाइन).
  19. Ganciclovir का उचित स्तर (GCV) और / puromycin G418, के रूप में मारने वक्र निर्माण miRNA साथ अभिकर्मक से पहले प्रदर्शन परीक्षण से निर्धारित के साथ मध्यम बदलें.
  20. मॉनिटर के चयन के लिए कोशिकाओं (कोशिकाओं dyinजी, लक्ष्यीकरण और टी - Zeo की पछाड़ना miRNA).
  21. , GCV और G418 / puromycin के उपस्थिति में कोशिकाओं का विस्तार.
  22. GCV चयनित कक्षों से जीनोमिक डीएनए तैयार करते हैं.
  23. पीसीआर किट प्राइमरों (पीसीआर प्रवर्धन देखें) के साथ आवेषण बढ़ाना.
  24. TOPOTA वेक्टर (Invitrogen) में मानक अनुक्रमण या गहरी अनुक्रमण के लिए पीसीआर उत्पाद प्रस्तुत करने के लिए क्लोन.

3. पीसीआर बढ़ाना चयनित पुस्तकालय आवेषण और अनुक्रम

नोट: इस प्रक्रिया के लिए किया जाता है पुस्तकालय लक्ष्य कि ganciclovir चयन बच गया है पीसीआर बढ़ाना.

5. गुणसूत्र डीएनए एक GenElute स्तनधारी जीनोमिक डीएनए Miniprep किट (कैटलॉग G1N10) या समकक्ष का उपयोग कर तैयार ganciclovir चयनित कोशिकाओं को इकट्ठा. हम माता पिता सेल लाइन है कि लक्ष्य आईडी लाइब्रेरी नहीं पीसीआर में लक्ष्य चयनित कोशिकाओं से डीएनए के साथ तुलना के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में उपयोग करता है से डीएनए की तैयारी करने की सलाह देते हैं.

  1. पीसीआर हूँplify जीनोमिक डीएनए प्रवर्धन एक प्राइमर और प्रवर्धन 2 प्राइमर के साथ में. पीसीआर (सूचि P0982 संख्या) के लिए सफल प्रवर्धन के जम्पस्टार्ट REDTaq Readymix रिएक्शन मिक्स के साथ प्राप्त किया गया है. शर्तों के अनुकूलन के लिए आवश्यक हो सकता है अगर एक और पोलीमरेज़ प्रयोग किया जाता है हो सकता है. एक नमूना पीसीआर और पीसीआर साइकिल चालन की स्थिति के लिए तालिका 2 की स्थापना के लिए 1 तालिका देखें.
  2. एक 1% agarose जेल पर पीसीआर उत्पाद के 2-5 μl संकल्प. उम्मीद उत्पाद कुछ दिखाई डीएनए बैंडिंग के साथ एक धब्बा होना चाहिए. लक्ष्य आईडी पुस्तकालय के बिना जीनोमिक डीएनए की कोशिकाओं से पीसीआर उत्पाद पर नियंत्रण की तुलना करें.
  3. क्लोनिंग और / या पीसीआर उत्पाद की गहरी अनुक्रमण के साथ आगे बढ़ें. यदि कोई प्रवर्धन उत्पाद मनाया जाता है या करने के लिए डीएनए को नियंत्रित करने के लिए समान है, पीसीआर प्रवर्धन शर्तों (यानी, प्राइमर एकाग्रता, annealing के तापमान, और चक्र) का अनुकूलन.

6. क्लोनिंग और अनुक्रमण

नोट: हम अत्यधिक की सलाह देते हैं क्लोनिंग पीसीआर उत्पादऔर फिर कम से कम प्रवर्धन किट में प्रदान की प्राइमर का उपयोग कर क्लोनों में से 96 से मानक अनुक्रमण प्रदर्शन. यह प्रक्रिया सफलतापूर्वक 96 अच्छी तरह से रात भर संस्कृतियों और प्लाज्मिड शोधन प्रणाली का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है. यहां तक ​​कि अगर गहरी अनुक्रमण वांछित है, क्लोनिंग और मानक अनुक्रमण से प्रारंभिक परिणामों की एक गुणवत्ता की जांच करने के लिए तय है कि गहरी अनुक्रमण के अतिरिक्त खर्च warranted है के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.

  1. क्लोनिंग पीसीआर प्रवर्धन उत्पादों (ऊपर) के लिए टीए क्लोनिंग किट निर्माण प्रोटोकॉल का पालन करें.
  2. सक्षम बैक्टीरियल कोशिकाओं में क्लोन रूपांतरण और एंटीबायोटिक युक्त मध्यम पर रात का चयन करें.
  3. अलग करने और उचित एंटीबायोटिक युक्त तरल संस्कृति में अलग - अलग कालोनियों बढ़ने.
  4. प्लास्मिड डीएनए शुद्ध. 6.5. प्रवर्धन प्राइमरों के साथ अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन करते हैं.
  5. बम विस्फोट के मानव (ज्ञात टेप के लिए) के transcriptome और मानव जीनोम के साथ दृश्यों के संरेखण द्वारा जीन (उपन्यास tr के लिए लक्ष्यों की पहचान) anscripts *.

* क्लोनिंग समस्या निवारण: यदि अनुक्रमण से आवेषण के एक उच्च संख्या प्लाज्मिड अनुक्रम हैं, जैसे / क्लोनिंग अनुक्रमण स्थिति अनुकूलन:

  • पीसीआर प्रवर्धन उत्पाद (डालने) गुणवत्ता और मात्रा
  • Ligation प्रतिक्रिया
  • प्लाज्मिड तैयारी (गुणवत्ता और मात्रा)
  • स्थितियों की प्रतिक्रिया से अनुक्रमण

4. प्रतिनिधि परिणाम

मीर 373 लक्ष्य के लिए पुस्तकालय स्क्रीन
मिशन लक्ष्य आईडी लाइब्रेरी के प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए, मीर 373 लक्ष्य MCF 7 पुस्तकालय व्यक्त कोशिकाओं से चयन किया गया था. MCF-7, क्योंकि यह थोड़ा व्यक्त या detectable नहीं मीर 373 (नहीं दिखाया डेटा) चुना गया था. मीर-373 अपनी जैविक हित के लिए चुना गया था. मीर 373 अभिव्यक्ति MCF-7 में ट्यूमर आक्रमण और मेटास्टेसिस को बढ़ावा देता है, सामान्य रूप से एक सेल गैर metastatic लाइन [2]. इसके अलावा, माउस से मीर - 373 orthologues के मीर-290 क्लस्टर माउस भ्रूणीय स्टेम में शामिल हैंसेल रखरखाव [3], और मीर 373 परिवार के सदस्य, मीर 372, प्रेरित pluripotent स्टेम सेल reprogramming की तंतुप्रसू [4] को बढ़ावा देता है. अंत में, हम इस्तेमाल किया जस्ता उंगली लिए PGK प्रमोटर मीर 373 अभिव्यक्ति MCF 7 कोशिकाओं में AAVS1 साइट में निर्माण सम्मिलित न्युक्लिअसिज़ है, और शाही सेना माइक्रोएरे विश्लेषण (नहीं दिखाया डेटा) द्वारा संभावित मीर 373 लक्ष्यों की एक सूची उत्पन्न.

लक्ष्य आईडी लाइब्रेरी MCF 7 कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था, और कक्षों की एक स्थिर जनसंख्या चुना गया था और zeocin युक्त मध्यम में परिलक्षित. परिणामस्वरूप कोशिकाओं (लाइब्रेरी MCF 7) को stably मीर - 373 व्यक्त निर्माण के साथ ट्रांसफ़ेक्ट गया और ganciclovir युक्त मध्यम में चयनित मीर 373 लक्ष्य व्यक्त की कोशिकाओं के लिए समृद्ध है. हम ने कहा कि नकारात्मक नियंत्रण MCF-7 लाइब्रेरी कोशिकाओं मीर 373 के बिना अलग नहीं है और गोल के रूप में मृत कोशिकाओं के लिए उम्मीद बन गए. हालांकि, वे बढ़ रही है, जो आसानी से पता चला था क्योंकि phenol के माध्यम युक्त लाल नारंगी पीले बारी नहीं के रूप में के लिए मनाया था बंद कियाr-373 मीर व्यक्त कोशिकाओं (चित्र 5). कोशिकाओं ganciclovir युक्त मध्यम में विस्तार किया गया, और लक्ष्य दृश्यों लक्ष्य आईडी सीडीएनए लाइब्रेरी सम्मिलित करता है और जीवित कोशिकाओं से डीएनए तैयार flanking प्राइमरों के साथ पीसीआर से अलग थे. पीसीआर उत्पादों Illumina अनुक्रम थे.

तालिका 4 में दिखाया गया है, हम 17,740,719 सीडीएनए पढ़ता है, जो 11,076 अद्वितीय जीन मैप प्राप्त. इन अद्वितीय जीन की, 2898 40 से अधिक पढ़ता के साथ पाया गया है, और इसलिए विश्वसनीय हिट माना जाता था. 13,106,469 वेक्टर पढ़ता है क्योंकि पीसीआर लिए सीडीएनए आवेषण बढ़ाना इस्तेमाल प्राइमरों 40 हैं और 300 कुर्सियां ​​प्रविष्टि साइट से दूर की उम्मीद थी. जैसे, यह उम्मीद है कि सबसे परिणामस्वरूप दृश्यों वेक्टर से जीनोमिक सामग्री के और अधिक परंपरागत गहरी अनुक्रमण के विपरीत होगा. चौदह प्रतिशत या तो वेक्टर या सीडीएनए मैप नहीं था, लेकिन NCBI गैर अनावश्यक nucleotide डेटाबेस (यानी, एन.आर. हिट के साथ) के साथ संरेखित करें, और केवल 1% सीडीएनए डालने नहीं था.

एक प्रारंभिक तुलना में पाया गया कि 10 अद्वितीय लक्ष्य आईडी पुस्तकालय के साथ की पहचान की जीन की पहले से पहचान TarBase में मीर 373 लक्ष्य (5 टेबल) की सूची में भी हैं. इन 10 - 373 मीर लक्ष्य पहले से शाही सेना के साथ थे माइक्रोएरे द्वारा transiently HeLa एक कृत्रिम मीर 373 [5] नकल के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से पहचान. इसके अलावा, हम इन ही 10 MCF 7 मीर 373 व्यक्त साइट AAVS1 (नहीं दिखाया डेटा) से कोशिकाओं में नीचे विनियमित जीन का पता चला. इसलिए, इन 10 मीर 373 की संभावना वैध लक्ष्य कर रहे हैं. कार्य प्रगति पर है के लिए संभावित ठिकानों की सूची और RT-qPCR, पश्चिमी धब्बा, और luciferase संवाददाता परख द्वारा चयनित हिट प्रयोगात्मक मान्य करने का प्रयास विशेषताएँ.

चित्रा 1
चित्रा 1 लक्ष्य आईडी लाइब्रेरी के लिए कार्यप्रवाह. वर्गों एसी प्रक्रिया में अनुभागों को देखें. हर कदम सचित्र और में विस्तार से वर्णित 3 अंजीर.

चित्रा 2
चित्रा 2 प्रोटोकॉल और Zeocin चयन है. लक्ष्य आईडी लाइब्रेरी plasmids के एक पूल (ए), प्रत्येक के साथ एक मानव सीडीएनए thymidine संलयन kinase zeocin प्रोटीन (TKzeo, चित्र 4) के बाद 3'-UTR में डाला है. कोशिकाओं लक्ष्य आईडी लाइब्रेरी (बी) के साथ में ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं और 3-5 दिनों के लिए ठीक करने की अनुमति दी है. Constructs इस वसूली की अवधि (सी) के दौरान जीनोम में एकीकृत, और इनकोडिंग प्रतिलिपि (डी) व्यक्त कर सकते हैं. वसूली के बाद, कोशिकाओं zeocin (ई) को उजागर कर रहे है. स्थिरतापूर्वक एकीकृत लक्ष्य आईडी constructs के से TKzeo संलयन प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं zeocin चयन (एफ) जीवित रहते हैं. Untransfected कोशिकाओं मर जाते हैं (जी). इसके अलावा, किसी भी कोशिकाओं के निर्माण कि एक अंतर्जात miRNA के लिए एक लक्ष्य है, या किसी oth शामिलएर कारक सेल में व्यक्त किया है कि लक्ष्य आईडी का निर्माण मर जाएगा (एच) से TKzeo की अभिव्यक्ति को रोकता है.

चित्रा 3
चित्रा 3 miRNA अभिकर्मक और ganciclovir चयन. कक्ष लक्ष्य आईडी पुस्तकालय (यानी, zeocin चयनित कोशिकाओं) से युक्त एक चयन microRNA अभिव्यक्ति का निर्माण (ए) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं. वसूली के दौरान, miRNA अभिव्यक्ति का निर्माण (बी) एकीकृत और चयन miRNA निर्माण पर इनकोडिंग मार्कर व्यक्त कर सकते हैं. स्थिर (सी) एकीकरण और सेल के विस्तार के लिए चयन के बाद, कोशिकाओं ganciclovir (डी) के साथ व्यवहार कर रहे हैं. Ganciclovir की उपस्थिति (यानी, कोशिकाओं व्यक्त TKzeo miRNA द्वारा लक्षित नहीं का निर्माण) में thymidine kinase (टी) के उत्पादक कोशिकाओं (ई) दूसरी ओर मर जाएगा, miRNA लक्ष्य के साथ पुस्तकालय constructs युक्त कोशिकाओं आईटीईएस टी उपज नहीं है, और इसलिए, ganciclovir चयन (एफ) बच जाएगा. जीवित कोशिकाओं को विकसित किया जा सकता है gDNA अलग, और सीडीएनए युक्त miRNA लक्ष्य साइटों लक्ष्य आईडी प्रवर्धन प्राइमरों का उपयोग पीसीआर प्रवर्धित. पीसीआर उत्पादों और अनुक्रम मानव जीनोम miRNA लक्ष्यों की पहचान के साथ गठबंधन किया जा सकता है.

चित्रा 4
चित्रा 4 प्लास्मिड का नक्शा और प्रवर्धन प्राइमर्स स्थान. SFI मैं सीडीएनए का क्लोनिंग की साइटों रहे हैं.

प्राइमर दृश्यों

मिशन का लक्ष्य आईडी प्रवर्धन 1 प्राइमर

5 3 ACGACGTGACCCTGTTCATC को

मिशन का लक्ष्य आईडी प्रवर्धन 2 प्राइमर

5 3 TAAAACGACGGCCAGTGAAT को

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चित्रा 5 सेल के विकास पर Ganciclovir प्रभाव. चौबीस अच्छी तरह प्लेटें दो सौ MCF 7 कक्षों या MCF 7 लक्ष्य आईडी लाइब्रेरी युक्त कोशिकाओं हजार साथ वरीयता प्राप्त थे. चौबीस घंटे बाद, 0, 8 या 16 माइक्रोन ganciclovir युक्त मध्यम मध्यम के साथ बदल दिया गया था. 15 दिनों के बाद, प्लेट (6 ऊपरी कुओं) फोटो खिंचवाने गया था, तो कुओं HbSS और शानदार ब्लू आर धुंधला (B6529) समाधान (6 कम कुओं) के साथ दाग के साथ धोया. ध्यान दें कि पुस्तकालय के बिना ganciclovir MCF 7 कोशिकाओं पर कोई प्रभाव नहीं है क्योंकि वे thymidine kinase (टी) नहीं व्यक्त करते. दूसरी ओर, MCF 7 लाइब्रेरी कोशिकाओं व्यक्त टी पर कर रहे हैं ganciclovir द्वारा पूरी तरह से 8 या 16 माइक्रोन से कम की हत्या के रूप में रहते Brillinat ब्लू लेने कोशिकाओं द्वारा दिखाया. हालांकि, पुस्तकालय की कोशिकाओं ganciclovir में बढ़ रही है, उनके माध्यम में phenol के लाल रंग के रंग से सबूत के रूप में बंद करो. गिरफ्तार कोशिकाओं उनके माध्यम नहीं आम्लिक करना, और रंग के लिए या बदलने के बजाय लाल रहता हैange - पीला.

अभिकर्मक / मात्रा रिएक्शन
जम्पस्टार्ट REDTaq Readymix रिएक्शन मिश्रण 10 μl
प्रवर्धन एक प्राइमर (25 माइक्रोन) 0.2 μl
प्रवर्धन 2 प्राइमर (25 माइक्रोन) 0.2 μl
जीनोमिक डीएनए 50-200 एनजी
पानी, आण्विक ग्रेड 20 μl के लिए

तालिका 1.

कदम अस्थायी. समय साइकिल
प्रारंभिक विकृतीकरण 95 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट. 1
विकृतीकरण 95 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड. पैन = "3"> 40 चक्र
* एनीलिंग 62 डिग्री सेल्सियस 30 सेकंड.
विस्तार 68 ° C 2 मिनट.
अंतिम विस्तार 68 ° C 5 मिनट. 1
पकड़ डिग्री सेल्सियस 4 पकड़

तालिका 2.

* एनीलिंग तापमान में भिन्नता है, लेकिन हम annealing के 53 और 64 के बीच लेकर तापमान के साथ सबसे अच्छा प्रवर्धन उत्पादों मनाया डिग्री सेल्सियस

तालिका 3

तालिका 3. Illumina अनुक्रमण के द्वारा लक्षित आईडी पुस्तकालय सामग्री.

तालिका 4

तालिका 4 मीर 373 Illumina अनुक्रमण द्वारा चयनित लक्ष्य.

les/ftp_upload/3303/3303table5.jpg "alt =" / 5 तालिका ">

सारणी 5 10 पहले शाही सेना माइक्रोएरे द्वारा की पहचान लक्ष्य.

Discussion

microRNAs 20-24 nucleotide RNAs कि जीन की अभिव्यक्ति के बाद transcriptionally बाधा mRNA अनुवाद, विनियमित और अक्सर, लक्षित mRNA के [6] समीक्षा को अस्थिर कर रहे हैं. एक एकल miRNA कई सौ mRNAs को विनियमित करने के लिए एक सेल विकास और पर्यावरण के संकेत के लिए प्रतिक्रिया को नियंत्रित कर सकते हैं. पहचान करना और लक्ष्य mRNAs मान्य एक miRNA और इन रास्ते में भूमिका समारोह का निर्धारण करने में आवश्यक है. हालांकि, लक्ष्य पहचान सरल है, क्योंकि पशुओं में, miRNAs और उनके लक्षित साइटों को पूरी तरह से पूरक नहीं कर रहे हैं नहीं है. "बीज" क्षेत्र, के माध्यम से 7-5'miRNA के अंत से 2 कुर्सियां, आमतौर पर अपने लक्ष्य को पूरक है. हालांकि, वहाँ बीज नियम के कई अपवाद हैं, और बहाव के आधार - बाँधना एक अपूर्ण बीज मैच के लिए क्षतिपूर्ति कर सकते हैं. कंप्यूटर एल्गोरिदम के एक संख्या miRNA बीज मिलान और बहाव मुआवजा, लक्ष्य संरचना पर आधारित लक्ष्य की भविष्यवाणी एक विकसित किया गया हैघ स्थिति, अनुक्रम संरक्षण, और विभिन्न अन्य मानकों कि प्रयोगात्मक मान्य लक्ष्यों [7] समीक्षा के लिए मनाया गया है. जबकि सिलिको में भविष्यवाणी सुविधाजनक है और पहचान कई वैध miRNA लक्ष्य करते हैं, सबसे भविष्यवाणी जीन प्रयोगात्मक सत्यापन परीक्षण विफल, और कई वास्तविक लक्ष्य नहीं की भविष्यवाणी कर रहे हैं. इसके अलावा, के बाद से कंप्यूटर एल्गोरिदम पहले से निर्धारित लक्ष्य सुविधाओं पर आधारित हैं, वे लक्ष्य है कि क्या पहले से ही जाना जाता है से विचलित की खोज नहीं की अनुमति नहीं है.

प्रायोगिक प्रणाली के एक नंबर सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया गया है की पहचान करने या जीवित कोशिकाओं में कार्यात्मक miRNA लक्ष्य की खोज. इन वैश्विक स्क्रीनिंग तरीकों डीएनए और शाही सेना अनुक्रमण, शाही सेना सह immunoprecipitation (आरआईपी), और स्थिर आइसोटोप सेल संस्कृति में एमिनो एसिड के साथ लेबल (SILAC), एक प्रोटिओमिक विधि ([7] समीक्षा) शामिल हैं. प्रत्येक विधि फायदे और नुकसान है. लक्ष्यीकरण miRNA के बाद से अक्सर एक mRNA के destabilizes और उसके क्षरण, नुकसान ओ की ओर जाता हैmRNA के स्तर में शुरू एक miRNA नकल या अवरोध करनेवाला, क्रमशः के बाद आर लाभ, miRNA लक्ष्यों की पहचान कर सकते हैं. इस mRNA की हानि या लाभ माइक्रोएरे या गहरी अनुक्रमण द्वारा आसानी से पता चला है. जबकि mRNA के तरीकों का पता लगाने के रूप में सरल और प्रोटीन का पता लगाने के तरीकों की तुलना में अधिक संवेदनशील हैं, mRNA का पता लगाने के किसी भी miRNA लक्ष्य है कि अपमानित नहीं कर रहे हैं याद आएगी. Bartell प्रयोगशाला से हाल की रिपोर्ट आरएनए का पता लगाने से SILAC से उन लोगों के साथ miRNA लक्ष्य परिणामों की तुलना [8] या ribosome रूपरेखा [9] संकेत मिलता है कि स्तनधारी miRNAs मुख्य रूप से लक्ष्य mRNA स्तर को कम करने से काम करते हैं. हालांकि, कई अन्य व्यक्ति miRNA लक्ष्य के साथ काम कर रहे प्रयोगशालाओं प्रोटीन में परिवर्तन पर mRNA के स्तर में कोई परिवर्तन नहीं पाया है. क्या नहीं detectable mRNA हानि के साथ translational विनियमन होना दिखाई देते हैं की रिपोर्ट में शामिल हैं: मीर-10b HOXD10 पर [10], p27kip1 पर miR221/222 [11], Pdcd4 पर मीर-21 [12], मीर -126 p85β पर [13] SIRT1 पर मीर-34 [14], PTEN [15], मीर 302d Arid4b पर [16], मीर 200C JAG1 पर [17], और मीर 299, 297, 567, एक को मीर-21VEGFA पर एन डी 609 [18] इसके अलावा, Clancy है एट अल [19] हाल ही में खबर दी है कि चलो - 7 translational विनियमन ही पता चला था जब व्यक्ति mRNA के isoforms कि चलो-7 लक्ष्य साइट होते चुनिंदा पाया गया. बाद पता चलता है कि, कुछ मामलों में कम से कम, translational विनियमन एक समग्र प्रोफ़ाइल में अनदेखा किया जा सकता है - कि है, जब सभी mRNA के isoforms एक mRNA के रूप में पाया जाता है - के रूप में कई माइक्रोएरे और अनुक्रम विश्लेषण के साथ प्राप्त की. Argonaute (Ago2 आमतौर पर) या अन्य जुड़े प्रोटीन (आरएनए, immunoprecipitation, या आरआईपी) के माध्यम से miRNA mRNA के परिसरों के सह immunoprecipitation miRNA लक्ष्य विनियमन तंत्र की परवाह किए बिना अलग होगा. इसके अलावा, चीर अंतर्जात, और संभाव्यतः biologically प्रासंगिक पता लगाता है, बातचीत. हालांकि, यह ज्ञात नहीं है कि सभी miRNA mRNA के बातचीत कार्य कर रहे हैं, और चीर किसी भी mRNA का लक्ष्य है कि केवल अस्थायी रूप से, क्षणिक रूप से सहयोगी या तेजी से अपमानित कर रहे हैं याद होगा. इसके अलावा, विशिष्ट miRNA mRNA के भागीदारों bioinformati inferred किया जाना चाहिए हैबड़ी सफाई क्योंकि सभी miRNA mRNA के जोड़े के साथ सह उपजी. अंत में, SILAC सीधे miRNA विनियमन, प्रोटीन ही अंतिम उत्पाद को दिखाता है, लेकिन असंवेदनशील है और इसलिए दुर्लभ प्रोटीन और प्रोटीन के स्तर में छोटे गुना परिवर्तन को याद करते हैं.

वर्तमान miRNA लक्ष्य पहचान तरीकों के साथ सीमाओं के प्रकाश में, हमें लगा कि एक अतिरिक्त वैश्विक परख के लिए एक वैकल्पिक तंत्र द्वारा कार्यात्मक miRNA लक्ष्यों की पहचान की जरूरत थी. इस जरूरत को पूरा करने के लिए, हम एक - Joop Gaken और किंग्स कॉलेज लंदन के अजीम Mohamedali द्वारा आविष्कार प्रौद्योगिकी लाइसेंस. उनके आविष्कार एक दोहरी चयन संलयन प्रोटीन है, विशेष रूप से, thymidine kinase - zeocin संलयन, अपने 3'UTR में संभावित miRNA लक्ष्य दृश्यों का एक सीडीएनए लाइब्रेरी द्वारा विनियमित. Stably और व्यक्त करने के साथ TKzeo - सीडीएनए constructs ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं zeocin साथ चुना जा सकता है, के रूप में 2 चित्र में सचित्र. ब्याज की एक miRNA व्यक्त करने के बाद, कि miRNA लक्ष्य वाई चुना जा सकता हैवें ganciclovir, के रूप में 3 चित्र में सचित्र. Ganciclovir thymidine kinase, कि, किसी भी कोशिकाओं है TKzeo सीडीएनए व्यक्त ब्याज की miRNA के लिए एक लक्ष्य की कमी व्यक्त की कोशिकाओं को मारता है. लक्षित कि ganciclovir का उपयोग प्राइमरों कि पार्श्व सीडीएनए, पीसीआर और उत्पादों के लिए लक्ष्यों की पहचान अनुक्रम किया जा सकता है बच कोशिकाओं से डीएनए के पीसीआर प्रवर्धन के सीडीएनए अलग किया जा सकता है.

मिशन का लक्ष्य आईडी लाइब्रेरी - हम वैश्विक और कार्यात्मक मानव miRNA लक्ष्यों की पहचान की खोज के लिए एक नए उपकरण में कॉलेज के राजा तकनीक विकसित की है. लक्ष्य आईडी पुस्तकालय के साथ, उपयोगकर्ताओं को स्तनधारी सेल संस्कृति अभिकर्मक और दवा चयन चरणों की एक श्रृंखला के द्वारा miRNA लक्ष्य को अलग कर सकते हैं. लाइब्रेरी व्यापक है, और मानव जीन की 66-79% होता है. प्रारंभिक परिणामों से संकेत मिलता है कि दोनों पहले के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पता चला नए लक्ष्य मिशन लक्ष्य आईडी लाइब्रेरी से अलग किया जा सकता है.

हालांकि कुछ लंबाई के प्रोटोकॉल है,स्तनधारी सेल संस्कृति, अभिकर्मक, दवा चयन, पीसीआर, और अनुक्रमण - लक्ष्य आईडी पुस्तकालय का उपयोग मानक आणविक प्रयोगशाला तकनीकों की आवश्यकता होती है और इसलिए, अच्छी तरह से अधिकांश जीव के मतलब के भीतर होना चाहिए. हमारा सुझाव है कि पर्याप्त ध्यान उचित प्रयोगात्मक डिजाइन करने के लिए भुगतान किया जाएगा, संस्कृति की स्थिति के अनुकूलन, और सबसे महत्वपूर्ण बात, प्रत्येक नया सेल प्रकार चयन कदम (निकम्मा घटता) लक्ष्य आईडी पुस्तकालय के साथ सफलता सुनिश्चित करने के लिए इष्टतम दवा का स्तर निर्धारित पूर्व परीक्षण.

सभी miRNA लक्ष्य पहचान तरीकों के साथ के रूप में, यह अत्यधिक की सिफारिश की है कि लक्ष्य आईडी लाइब्रेरी स्क्रीनिंग के ठिकानों की पहचान माइक्रोएरे, qRT-पीसीआर, संवाददाता परख (यानी, luciferase) के, या पश्चिमी विश्लेषण के रूप में एक दूसरी विधि के साथ मान्य किया जा.

Disclosures

लेखक वाणिज्यिक संस्थाओं है कि प्रस्तुत काम में रुचि रखते हैं के साथ वित्तीय संबंधों घोषणा.

Acknowledgments

हम उसे समर्थन और उपयोगी समस्या निवारण चर्चा में भाग लेने के लिए पूरे सिग्मा लाइफ साइंस मिशन लक्ष्य आईडी पुस्तकालय विकास टीम, प्रौद्योगिकी खोज और लाइसेंस शर्तों को बातचीत के लिए विशेष रूप से केविन Gutshall, और हीथ Holemon के धन्यवाद. हम भी स्वतंत्र रूप से यह क्लोन में सीडीएनए का एक बड़ा बैच और उसके हठ की तैयारी के लिए अप्रकाशित परिणाम और सुझाव, और RxBiosciences काजी हामिद साझा करने के लिए किंग्स कॉलेज लंदन के डॉ. Joop Gäken धन्यवाद. हम SAFC से नेन लिन और स्कॉट बह्र सीडीएनए arrays और डेटा विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए स्वीकार करना होगा.

मिशन सिग्मा Aldrich जैव प्रौद्योगिकी एल.पी. के एक पंजीकृत ट्रेडमार्क है

Materials

Name Company Catalog Number Comments
JumpStart REDTaq ReadyMix Sigma-Aldrich P0982
Ganciclovir Sigma-Aldrich G2536
G418 Sigma-Aldrich G8168
Puromycin Sigma-Aldrich P9620
Topo TA Invitrogen KNM4500-01
GenElute Mammalian Genomic DNA Miniprep Kit Sigma-Aldrich G1N10
Cell Specific Nucleofection kit Lonza Inc.
Nucleofector Lonza Inc. AAD-1001
Zeocin Invitrogen R250-01
Target ID Library Sigma-Aldrich MREH01

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References

  1. Target ID Library Technical Bulletin, Catalog # MREH01. [Internet]. , Sigma Aldrich. St Louis. Available from: http://www.sigma-aldrich.com (2012).
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जेनेटिक्स 62 अंक लक्ष्य आईडी miRNA ncRNA आरएनएआई जीनोमिक्स
MiRNA मिशन लक्ष्य आईडी पुस्तकालय का उपयोग लक्ष्य के लिए जीनोम चौड़ा स्क्रीन
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Coussens, M. J., Forbes, K.,… More

Coussens, M. J., Forbes, K., Kreader, C., Sago, J., Cupp, C., Swarthout, J. Genome-wide Screen for miRNA Targets Using the MISSION Target ID Library. J. Vis. Exp. (62), e3303, doi:10.3791/3303 (2012).

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