Summary
مخصص CompoZr الزنك فنجر Nuclease (ZFN) خدمة تمكن دقيق التحرير الجينوم في أي كائن حي أو خط خلية في أي مكان محدد من قبل المستخدم. توضح هذه المقالة عملية لتصميم والتحقق من صحة وتصنيع وتنفيذ الخدمة CompoZr ZFN مخصص.
Abstract
الجينوم التحرير هي تقنية قوية التي يمكن استخدامها لتوضيح وظيفة الجين والأساس الجيني للمرض. الجينات التقليدية أساليب تحرير مثل المواد الكيميائية القائمة على الطفرات أو التكامل عشوائية من تسلسل الحمض النووي تمنح التغييرات الجينية العشوائية بأسلوب غير فعال الشاملة وتتطلب إدراج تسلسل الاصطناعية غير مرغوب فيه أو استخدام الظروف الشاذة ثقافة، يحتمل أن تكون مربكة دراسة بيولوجية. على النقيض من ذلك، يمكن للعابر التعبير ZFN في زنزانة تسهيل دقيق، الموروثة التحرير الجين بطريقة ذات كفاءة عالية دون الحاجة لإدارة المواد الكيميائية أو التكامل من الجينات المحورة الاصطناعية.
nucleases إصبع الزنك (ZFNs) هي الانزيمات التي تربط وقطع متواليات متميزة من المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي (dsDNA). وظيفي من وحدة ZFN CompoZr يتكون من البروتينات 2 أحادى الفردية التي تربط الحمض النووي "نصف موقع" ما يقرب من 15-18 النيوكليوتيدات (انظر الشكل 1). عندما اثنين ZFN أحاديةالسائدة "الوطن" على مواقعهم الهدف المتاخمة المجالات الحمض النووي انشقاق dimerize وإنشاء فاصل مزدوج الجديلة (DSB) في الحمض النووي. 1 مقدمة من ZFN بوساطة DSBs في الجينوم يضع أساسا للتحرير الجينوم كفاءة عالية. يمكن إصلاح ناقص من DSBs في خلية عن طريق المنظمات غير المتجانسة في نهاية الانضمام (NHEJ) والحمض النووي مسار الإصلاح يؤدي إلى الإدراج الصغيرة والحذف (indels). ويمكن إنشاء indels ضمن تسلسل الجينات ترميز خلية يؤدي إلى انزياح الإطار، وبالضربة القاضية الفنية لاحق من مكان الجين على كفاءة عالية. 2 في حين أن هذا البروتوكول يصف استخدام ZFNs لخلق بالضربة القاضية جين، والتكامل من الجينات المحورة ويمكن أيضا أن تتم عن طريق تناظر الموجهة إصلاح في موقع قطع ZFN.
مخصص CompoZr ZFN الخدمة يمثل نهج منتظم وشامل، وكذلك تتميز إلى تحرير الجينات المستهدفة للأوساط العلمية مع التكنولوجيا ZFN. العلماء سيجما العمل بشكل وثيق مع المحققين إلى 1) perfoRM تحليل العناية الواجبة بما في ذلك تحليل بنية الجينات ذات الصلة، والبيولوجيا، ونظام نموذجي وفقا لأهداف المشروع، 2) تطبيق هذه المعرفة لوضع استراتيجية سليمة تستهدف، 3) ثم تصميم وبناء، والتحقق من صحة وظيفيا ZFNs عن النشاط في ذات الصلة خط خلوي. المحقق يتلقى إيجابي الحمض النووي الجيني السيطرة والاشعال، والجاهزة للاستخدام الكواشف ZFN توفيره في كل من الحمض النووي البلازميد في المختبر وتنسيق مرنا المحولة. قد ثم يتم تسليم هذه الكواشف للتعبير عابر في خط خلية المحقق أو نوع من الخلايا في الاختيار. ثم يتم اختبار عينات لتحرير الجين في موضع الاهتمام من جانب معيار تقنيات البيولوجيا الجزيئية بما في ذلك التضخيم PCR، هضم الأنزيمية، والكهربائي. بعد يتم الكشف عن إشارة إيجابية لتحرير الجين في عدد السكان الأولية، الخلايا وحيدة الخلية المستنسخة ومرمزة لتحديد من الحيوانات المستنسخة طافرة / الأليلات.
Protocol
1. عرف عملية ZFN التصميم
- للإسراع في عملية تصميم ZFN، وينبغي أن محقق توفر ما يلي:
- معلومات عن الجينات المستهدفة مثل اسم الجينات والأنواع والجينات، وعدد الشرح / تحديد الهوية.
- وبوضوح أكثر من كل شيء الهدف من التجربة (على سبيل المثال، الضربة القاضية أو Knockin)
- أي من العوامل المحددة للهدف الجينات التي تشمل شاذة بنية الجينات والبيولوجيا خاص المتورطين في مكان وراثية، أو أي مناطق متماثلة في مكان آخر في الجينوم.
- في نطاق معين من تسلسل الحمض النووي لالاصبع الزنك nucleases لاستهداف.
- فريق المعلوماتية الحيوية سيغما تجري في تصميم ZFN السيليكو الأولية لتطوير المواقع المستهدفة الزنك الاصبع.
- وتقدم الأولية المواقع المستهدفة ZFN إلى مستشار ZFN التقنية والعلمية. لمشاريع أكثر تعقيدا من الناحية الفنية، هذا عالم سيغما يعمل مع المحققين لوضع استراتيجية المشروع.
- المعلوماتية الحيوية ويوفر هدف ZFN أعلى المواقع إلى محقق للمراجعة. بناء على موافقة من المواقع ZFN هدفا محتملا، وتقدم هذه المعلومات إلى فريق الإنتاج ZFN للبدء في عملية تصنيع ZFN.
2. عرف ZFN الإنتاج
- يستخدم الأرشيف سيجما من وحدات الاصبع الزنك لتجميع التصاميم ZFN المعتمدة.
- يتم تجميع كل تصميم ZFN وتسلسل التحقق من على منصة عالية الإنتاجية الاستنساخ.
- يتم إرسالها مرة واحدة انتاج جميع التصميمات ZFN يتم استكمال كل ZFN إلى التحقق من الصحة.
3. التحقق من ZFNs مخصص
- مشاريع في ZFNيتم التحقق من صحة الإنسان، والجرذان والفئران أو CHO الأنواع في خطوط الخلايا تتميز أيضا لكل نوع، يتم استخدام فحص خميرة القائم للكائنات الحية الأخرى أو أنواع الخلايا.
- يتم تسليم البنى ZFN في خط الخلية المناسبة من قبل nucleofection وأعرب ZFNs.
- يتم حصاد الحمض النووي من تجمع لخلايا ZFN transfected والمنطقة من الفائدة هو تضخيم PCR.
- ويجري بعد ذلك فحص-1 سل على المنتج PCR. يتم تشغيل هلام إستشراد على فحص-1 سيل إلى نشاط ZFN التحقق من صحتها.
- وتقدم بعد ذلك ZFN أعلى نشاط تصميم كما أكده فحص سيل-1 إلى العميل. يتم تسليم ZFNs في مرنا والحمض النووي البلازميد مع بادئات PCR لفحص الجوف (1) والحمض النووي الجيني كعنصر تحكم إيجابية.
4. تسليم ZFNs المصادق عليها من قبل Nucleofection
- بذور الخلايا في مناطق ذات كثافة من 2x10 5 خلية / مل في اليوم السابق nucleofection.
- في يوم nucleofection،اخراج الخلية الخط Nucleofector كيت الخامس وترك الحارة إلى درجة حرارة الغرفة.
- إضافة ملحق للNucleofection الخامس الحل وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
- عد الخلايا. يجب أن تكون كثافة الخلايا بين الخلايا 5 2.5-5x10 / مل.
- شغل لوحة 6 جيدا مع 2ml من المتوسط في كل جيدا، وقبل الدافئة في حاضنة CO 2 في 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 20 دقيقة قبل nucleofection.
- منبذة 2x10 6 خلايا في ترنسفكأيشن (8X10 6 المجموع) في 200xg لمدة 5 دقائق.
- غسل الخلايا مرتين مع 20 مل من محلول هانك في سولت المتوازن (HBSS).
- إعداد أنابيب التجريبية: (انظر الجدول في النشرة الفنية مخصص ZFN)
- إزالة لوحة 6 جيدا تحتوي على وسائل الإعلام من الخطوة (6.5) من الحاضنة.
- Resuspend الخلايا في 400 ميكروليتر (100 ميكروليتر / رد فعل) من الحل Nucleofection V.
- رد فعل واحد في وقت واحد، أضف 100 ميكروليتر من الخلايا إلى كل DNA أو الرنا التي تحتوي على أنبوب. Transfإيه هذا المزيج على كوفيت مم electroporation 2 و nucleofect على Nucleofector مع البرنامج المناسب.
- مباشرة بعد nucleofection من كل عينة، واستخدام ماصة نقل لإضافة ~ 500 ميكرولتر من متوسط prewarmed من لوحة 6 جيدا في الخطوة (6.9) إلى كوفيت. ثم، بعناية نقل الخلايا من كفيت والمتوسطة في prewarmed المتبقية في لوحة 6 جيدا.
- الانتهاء من كل ردود الفعل والعودة لوحة 6 جيدا للحاضنة CO 2 في 37 درجة مئوية.
5. حصاد الحمض النووي الجينوم بعد التسليم من ZFNs
- 6 كذلك لوحة - لا حصاد كافة الخلايا المجمعة. من المهم للحفاظ على الثقافة من أجل الحصول على الخلايا وحيدة الخلية إلى استنساخ تخفيف بعد التأكد من أن لديك منتجات سيل-1 الهضم. واحد إلى ثلاثة أيام بعد nucleofection جمع الخلايا لإعداد الحمض النووي الصبغي باستخدام الحمض النووي الجيني GenElute الثدييات Miniprep كيت.
6. CEL-1 الفحص
95 درجة مئوية، 10 دقائق
95 درجة مئوية إلى 85 درجة مئوية، -2 درجة مئوية / 2
85 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية، -0،1 درجة مئوية / 2
4 درجة مئوية، إلى أجل غير مسمى
7. نسيلي عزل وتوصيف
- وحيدة الخلية استنساخ نماذج ZFN المعالجة بالطرق العادية بما في ذلك نظام مراقبة الأصول الميدانية والاستنساخ التخفيف.
- السماح للاستنساخ لتوسيع بما فيه الكفاية، ثم انشق بعض نسبة من الخلايا لحصاد الحمض النووي الجيني، وتجميد ما تبقى كما ظهر هذه المواد المخزونة.
- تضخيم الحمض النووي الجيني من الحيوانات المستنسخة باستخدام بادئات الجوف أنا وتحليل amplicon بواسطة سيل-I فحص (مع وبدون الحمض النووي WT ارتفعت في)، أو بدلا من استخدام هذه amplicon إلى الانتقال مباشرة إلى التنميط الجيني.
- استنساخ مرشح الوراثي التي تم تحديدها على أنها الأليلات قديم الأسلوب المفضل.
8. ممثل النتائج
ويقدم مثالا على سير العمل كله ZFN CompoZr في الشكل 2. يتم تسليم ZFNsإلى الخلايا حيث ربط ويلتصق تسلسل الحمض النووي المناسبة مما يؤدي إلى كسر مزدوج الجديلة (DSB). عملية الإصلاح الطبيعية، وغير المتجانسة انهاء انضمام (NHEJ)، وإصلاح جهاز تسوية المنازعات. في بعض الحالات نتائج NHEJ الشاذة في الإدراج أو الحذف أو الاستبدال من النيوكليوتيدات. PCR التضخيم من حصاد نتائج الحمض النووي الجيني في تشكيل مضاعف متغاير بين نوع البرية وamplicons تعديل بعد تمسخ / خطوة الصلب للتفاعل PCR. علاوة على ذلك من نتائج انزيم سيل-1 في شق من أي جزيئات مضاعف متغاير. يتم حل CEL-1 النتائج وفقا لتحليل PAGE لتأكيد الانقسام ZFN. الشكل (3) يوفر التخطيطي لفحص الجوف (1) والنتائج المتوقعة.
وترد ممثل سيل-1 النتائج في الأرقام 4 و 5 الشكل 4 يحتوي على النتائج من زوج نشطة جدا من ZFNs (21٪) في K562 الخلايا؛. الشكل (5) يحتوي على النتائج من زوج أقل نشاطا (2.4٪) من ZFNs فيK562 الخلايا. ويؤكد ZFN النشاط في كل من الأرقام عن وجود شظايا PCR 2 أدناه جزء PCR الوالدين.
الشكل 1. صممت تمثيل متجهة nucleases إصبع الزنك. ZFNs البروتينات تتألف من إصبع الزنك الحمض النووي ملزم نطاق تنصهر فيها إلى المجال انشقاق في نوكلياز داخلية تقييد FokI. عندما ملزمة باعتبارها مثنوي مغاير، ZFNs إنشاء فاصل المزدوج تقطعت بهم السبل في تسلسل الحمض النووي المستخدم المحدد.
الشكل 2. التخطيطي لسير عمل مخصص خدمة ZFN. التمثيل البياني لسير العمل لإنشاء خط خلية المعدلة وراثيا باستخدام ZFNs CompoZr.
الشكل 3. التخطيطي لفحص الجوف (1) والنتائج. A) ZFN س البلازميد يتم تسليم ص مرنا للخلايا. ب) أعربت عن ZFNs ربط وقطع تسلسلها الهدف خلق فاصل مزدوج الجديلة (DSB) في جزء من الخلايا. C) إصلاح الشاذة من بعض DSBs بواسطة مثلي عدم انهاء انضمام النتائج في النوكليوتيدات الإدراج أو الحذف. D) يتم حصاد الحمض النووي الجيني من تجمع transfected من الخلايا وتضخيمها في موضع الاهتمام. EF) PCR المنتج هو التشويه والتحريف وإعادة تشكيل مطوع خلق مضاعف متغاير بين نوع البرية وamplicons تعديل. ز) عدم تطابق نتائج فحص نوكلياز داخلية سيل-1 في شق من الجزيئات مضاعف متغاير. يتم حل H) سل-1 إنزيم يساعد على هضم بواسطة PAGE. الملاحظ أن نسبة من الناتج الانقسام إلى فرقة بالحقن، التي تحددها البرمجيات يماغيج، يدل على قطع جزء وكفاءة ZFNs.
الشكل 4. CEL-1 النتائج من ZFNs نشط 21٪ يماغيج البرنامج متاح في:_blank "> http://rsbweb.nih.gov/ij/.
الشكل 5. CEL-1 النتائج من 2.4٪ ZFNs نشط يماغيج البرنامج متاح على العنوان التالي:. http://rsbweb.nih.gov/ij/ .
Discussion
يتم عزل مرة ZFN المعدلة الخلايا لديهم دائم وراثية التعديلات الحمض النووي. هذه النتائج في القدرة على توليد خطوط الخلايا المعدلة ثابت أو الحيوانات تولد مع بعض التعديلات الوراثية المطلوبة لإجراء البحوث. CompoZr ZFNs مخصص توفير وسيلة قوية لجينوم التحرير في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا. نشر الخريطة الجينية الناجحة مع تحرير ZFNs يشمل لكن لا يقتصر على خطوط الخلايا البشرية، الفأر، الجرذ، الزرد، الضفادع، الخنازير ونماذج البحوث CHO. 3،4،5،6،7،8،9 والقدرة على خلق وأكد المزدوج تقطعت بهم السبل انقطاع في موقع الهدف المنشود في نوع من الخلايا المحددة عندما يتم تسليمها بشكل صحيح ZFNs في خلية. ومن الممكن أيضا لأداء تسلسلي التعديلات إصبع الزنك إلى خلية من أجل أن يكون أكثر من التعديل الوراثي داخل الخلية. (10) القدرة على تحديد تسلسل هدف محدد وتعديلها فقط أن مكان معين هو السبب الرئيسي للقدرة على إنشاء عدة modifiالكاتيونات.
يتم إنشاء شهادة CompoZr ZFN مخصص للتحليل مع الكواشف جدا المنصوص عليها في عدة وبذلك يضمن أنه تم جميع مكونات عدة التحقق من صحة تماما للنجاح العملاء. وتعرض الخطوات الحاسمة في سير العمل من البداية الى النهاية أدناه:
استنساخ الخلية
وينبغي اختبار القدرة على عزل وتوسيع خط خلية معينة قبل البدء في أي تجارب ZFN. ينبغي عزل الخلايا وحيدة وتوسيعها لضمان أن سكان clonally المستمدة من الممكن. بعض خطوط الخلايا هي المتمردة في هذه المسألة، والحيل مثل تخصيب اليورانيوم لاستنساخ التعديل، أو الثقافة مع وسائل الاعلام في ظروف يمكن أن تساعد في التغلب على هذه التحديات.
تسليم كفاءة
الاستغلال الأمثل للكفاءة تسليم أمر لا بد منه قبل تسليم ZFNs. ويمكن استخدام العديد من الأساليب بما في ذلك الدهون مقرها ترنسفكأيشن، electroporation، وnucleofectiفي. طريقة التسليم المثالي يتكون من احد ان يعطي مزيج معظم الأمثل للكفاءة تسليم وبقاء الخلية. قد Quantitating هذه الكفاءات أن يقدر من خلال تقديم سيطرة GFP البلازميد وquantitating بالمعاينة البصرية أو نظام مراقبة الأصول الميدانية 24 48hrs بعد التسليم.
CEL-I مقايسة
لا بد من أن يتم تنفيذ سيل-I فحص بالتوازي مع الضوابط المناسبة لضمان PCR، والهضم، والكهربائي المعلمات لن تتدخل في تفسير التجربة ZFN. كل مجموعة تضم الحمض النووي تحكم الجيني التي يتم استخدامها لخلق صورة سيل-I في شهادة التحليل. والتضخيم من الحمض النووي السيطرة مع الاشعال المقدمة تليها الجوف أنا الفحص تسمح للمستخدم لمقارنة النتائج مع تلك المنصوص عليها في شهادة التحليل (CofA) صورة، وعزل أي أوجه القصور المحتملة في هذا الجانب من تجربة. تعامل عنصر تحكم المناسبة السلبية مثل وهمية، أو خلية GFPوينبغي أيضا أن تدرج عينة للسماح للتوضيح أي من منتجات الانقسام غير محددة.
نوعي / التحليل الكمي وحيدة الخلية المستنسخة
بعد العلاج ZFN واحد استنساخ الخلية، قد يتم فحص السكان من الخلايا للتحرير في موضع الاهتمام من جانب عدد من الطرق. ويمكن إجراء CEL-I فحص الحمض النووي في الجينوم من الحيوانات المستنسخة لغرض تحديد استنساخ مرشح لمزيد من التنميط الجيني. من المهم أن amplicon ارتفاع PCR WT في amplicons عينة بنسبة 1:1 قبل تنفيذ سيل-I هضم مثل الحيوانات المستنسخة طافرة متماثل سوف تحتوي على جزيئات متجانسة، وبالتالي نقل سلبي سيل-I فحص النتيجة. طريقة بديلة لفحص هذه الحيوانات المستنسخة مرشح هو تصميم واحد هبوط التمهيدي PCR مباشرة على موقع الهدف ZFN. تستخدم جنبا إلى جنب مع واحدة من الاشعال السيطرة، نتيجة الفحص سلبية تشير إلى فقدان تسلسل WT. وهناك نسخة متخالف التي تحتوي على واحد على الأقل الأليل WT ذويمكن فصل درع PCR إشارة، ولكن من الحيوانات المستنسخة WT تماما قبل تنفيذ PCR في سياق qPCR SYBR.
مرة واحدة وقد تم تحديد مرشح استنساخ بواسطة الطرق المذكورة أعلاه، قد تكون مرمزة من قبل pyrosequencing القياسية، وتسلسل عميق، أو تسلسل أساليب أخرى. لجميع طرق التسلسل، ينبغي إنشاء amplicon إنشاؤها من الحمض النووي الجيني نسيلي. ويمكن فصل لالأليلات pyrosequencing التقليدية بواسطة TA-PCR الاستنساخ المنتج، والتسلسل المستعمرات الفردية. لأساليب مثل التسلسل عميق هذه الخطوة ليست ضرورية.
إصلاح تناظر إخراج (تقرير)
يتيح هذا البروتوكول طريقة للخروج المغلوب ZFN بوساطة الجينات عبر NHEJ. ويمكن أيضا دمج الجينات المحورة سيجريه مقدمة من إحدى الجهات المانحة البلازميد مع الأسلحة التي تناظر الجناح موقع قطع ZFN. 11 في هذا السيناريو، ZFN خلقت يتم إصلاح المزدوج تقطعت بهم السبل انقطاع بواسطة HDR بدلا من NHEJ. توجه تقرير التنمية البشرية الأولويمكن تأكيد ntegration من الجينات المحورة باستخدام أساليب مماثلة للإجراءات المنصوص عليها في جميع أنحاء هذا البروتوكول.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها
تسليم ZFNs
ويمكن السيطرة على تسليم ZFN والتعبير التسليم عن طريق التسليم من GFP أو غيرها. هذا البلازميد و / أو التصور تحديد الكميات ويمكن التغلب على التعبير منخفضة نظرا لعدم توافق المروج مع نوع من الخلايا في المصالح عن طريق التسليم من ZFNs في شكل مرنا. وبالإضافة إلى ذلك، قد يتم استخدام أسلوب الصدمة الباردة لزيادة فعالية ZFNs في الخلايا. 12 إذا تم استخدام مرنا لا بد من أن تغسل الخلايا قبل التسليم لضمان أن يتم نقل جميع Rnases المصل المشتقة. بل هو أيضا من الحكمة أن ذوبان الجليد ومرنا على الجليد، وإضافة إلى هذه الخلايا في آخر لحظة جدا للحد من أي فرصة للتحلل.
CEL-I مقايسة
تأسيس آسا سيل-Iy هو التضخيم محددة وافرة من موضع الاهتمام. إذا لاحظت منتجات التضخيم غير محددة استخدام معيار PCR إجراءات استكشاف الأخطاء وإصلاحها لزيادة خصوصية مثل الاستفادة المثلى من كمية القالب، وتركيز التمهيدي، وركوب الدراجات المعلمات. لتحليل PAGE في مقابل الكهربائي الاغاروز معيار كأسلوب الأخير لا يوفر القرار الملائم وحساسية. ويمكن أيضا CEL-I ظروف هضم يكون الأمثل في حال ملاحظة أي منتج هضمها أو تلطيخ المفرطة. ويمكن معاير معايرة كمية سيل-1 / وnuclease أو طول الفترة الزمنية الهضم لتحسين هذه الجوانب.
Disclosures
يمكن للباحثين تقديم ZFN خلايا معدلة أو الحيوانات للمتعاونين في إطار اتفاق للبحوث الترخيص القياسية. في هذا الظرف سيغما يطلب أن يتم وضع اتفاق لنقل المواد في مكان ما بين سيجما، والعملاء والمتعاونين ZFN بهم. ويمكن الاطلاع على الترخيص بحث في: http://www.sigma.com/zfn .
إذا كان هناك إمكانية لتطبيق التجارية باستخدام الخلايا المعدلة ZFN سيجما ثم يطلب أن يتم وضع رخصة تجارية في المكان.
وترعى الإنتاج وحرية الوصول إلى هذه المادة من قبل سيغما، وشركة
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nuclease S (Cel-1 Enzyme) | Transgenomic | 706025 | |
| Expand High Fidelity PCR System | Roche Group | 03 300 242 001 | |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza Inc. | VCA-1003 | |
| GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit | Sigma-Aldrich | NA0400 |
References
- Kim, Y. G. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to FokI cleavage domain. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 1156-1160 (1996).
- Urnov, F. D. Highly efficient endogenous human gene correction using designed zinc-finger nucleases. Nature. 435, 646-651 (2005).
- Moehle, E. A. Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).
- Meyer, M. Gene targeting by homologous recombination in mouse zygotes mediated by zinc-finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 15022 (2010).
- Geurts, A. M. Knockout rats via microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433 (2009).
- Meng, X. Targeted gene inactivation in zebrafish using engineered zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 26, 695-701 (2008).
- Young, J. J. Efficient targeted gene disruption in the soma and germ line of the frog Xenopus tropicalis using engineered zinc-finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. , Forthcoming (2011).
- Wanatabe, M. Knockout of exogenous EGFP gene in porcine somatic cells using zinc-finger nucleases. Biochem. Biophys. Res. Commun. 402, 14-18 (2010).
- Santiago, Y. Targeted gene knockout in mammalian cells by using engineered zinc-finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5809-5814 (2008).
- Lui, P. Q. Generation of a triple-gene knockout mammalian cell line using engineered zinc-finger nucleases. Biotechnol. Bioeng. 106, 97-105 (2010).
- Moehle, E. A. Targeted gene addition into a specified location in the human genome using designed zinc finger nucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3055-3060 (2007).
- Doyon, Y. Transient cold shock enhances zinc-finger nuclease mediated gene disruption. Nat. Methods. 7, 459-460 (2010).
