CompoZr自锌指核酸酶(ZFN)服务可在任何生物体或细胞系在由用户定义的任何轨迹的精确的基因组编辑。本文描述的CompoZr定制ZFN服务的设计,制造,验证和实施的过程。
基因组编辑是一个强大的技术,可以用来阐明基因功能和疾病的遗传基础。传统的基因编辑的方法,如化学突变或DNA序列的随机整合赋予整体低效的方式,不分青红皂白的遗传变化和要求纳入不良合成序列或使用异常的培养条件下,有可能混淆生物学研究。相比之下,在瞬态ZFN表达细胞可以方便准确,可遗传的基因在一个高效的方式编辑,而不需要管理的化学品或合成外源基因的整合。
锌指核酸酶(ZFNs)酶的不同序列的双链DNA(dsDNA)的约束和削减。一个功能CompoZr ZFN单元由两个独立的单体蛋白质结合的DNA“半现场”( 见图1)约15-18个核苷酸的。当两个ZFN单市场汇率“家”到其相邻的靶位点DNA裂解域的二聚体和创建双链断裂(DSB)的DNA。1引言ZFN介导的DNA双链断裂的基因组中奠定了基础,高效的基因组编辑。通过非同源最终连接(NHEJ)DNA修复通路在细胞的DNA双链断裂的不完善修复可能会导致小插入和缺失(INDELS),。一个细胞内的基因编码序列INDELS创作可能导致移和后续功能的一个高效率的基因位点。2淘汰赛,虽然这一协议描述ZFNs使用,以创建一个基因敲除,转基因的整合,也可以进行通过同源定向修复在ZFN切站点。
CompoZr自定义的ZFN服务代表ZFN技术与科学界针对基因编辑一个系统,全面的,良好的特点。西格玛科学家紧密合作,调查1)射孔RM尽职调查分析,包括分析有关的基因结构,生物学和模型系统,根据该项目的目标,2)申请这方面的知识,发展健全的定位策略,3),然后设计,建造和功能验证活动有关ZFNs细胞株。研究者收到阳性对照基因组DNA和引物,并准备使用的两个质粒DNA和体外转录mRNA的格式提供ZFN试剂。这些试剂可交付的瞬时表达,在研究者的细胞株或细胞类型的选择。基因编辑的样品,然后进行测试标准的分子生物学技术,包括PCR扩增,酶消化,电泳利益轨迹。经过基因编辑的积极信号在初始种群中发现,细胞的单细胞克隆和基因的突变克隆/等位基因鉴定。
一旦ZFN修饰细胞的分离,他们有永久的和遗传的DNA修改。这样的结果能够产生稳定的修改所需的遗传修饰的细胞株或繁殖动物进行研究。 CompoZr自ZFNs提供了可靠的方法,在多种细胞类型的基因组编辑。 ZFNs编辑出版成功的基因组包括但不限于人类细胞系,小鼠,大鼠,斑马鱼,蛙,猪和CHO细胞的研究模型。3,4,5,6,7,8,9的能力,以创建一个保证在特定的细胞类型所需的目标网站的双链休息时ZFNs是正确传递到一个单元格。它也可能以执行顺序锌手指修改一个单元细胞内多个基因改造,10来选择1的具体目标序列和唯一的修改,特别是轨迹1创建多个主要事业的能力修饰阳离子。
CompoZr定制ZFN分析证书生成工具包,从而保证为客户的成功,该套件的所有组件已被彻底验证提供了非常试剂。从开始到结束的工作流程中的关键步骤介绍如下:
细胞克隆
应隔离和扩大一个给定的细胞株的能力测试开始任何ZFN实验之前。应单细胞分离和扩大,以确保一个无性衍生的人口是可能的。有些细胞株顽抗在这个问题上,如编辑克隆富集,文化或空调媒体的技巧,可以帮助克服这些挑战。
交付的效率
ZFNs交付前交付效率的优化是必须的。许多方法可用于包括脂质体转染,电,并nucleofecti上。理想的传递方法,包括一个可以交付效率和细胞存活的最优化的混合。定量估计这些效率可提供GFP的对照质粒和溶出速率,通过目测或流式细胞仪24-48小时后交付。
CEL-I测定
这是当务之急,CEL-I测定平行,以确保不会干扰的ZFN实验的解释,PCR,消化,电泳参数进行适当的控制。每个套件包括控制基因组DNA,用于创建CEL-我的图像分析证书。 CEL-I测定所提供的引物控制DNA扩增,将允许用户比较与分析证书(COFA)图像所提供的结果,并隔离任何潜在的低效在这方面的实验。一个适当的,如模拟,或GFP阴性对照细胞治疗样品也应列入允许任何非特异性酶切产物澄清。
单细胞克隆的定性/定量分析
经过的ZFN治疗和单细胞克隆,细胞群体利益的轨迹编辑方法可筛选。 CEL-I测定可确定候选克隆,为进一步的基因分型的目的从克隆基因组DNA进行。重要的是穗野生成1:1的比例样本扩增PCR扩增,然后再执行CEL-我消化纯合突变克隆将包含均质分子,从而传达一个负面CEL-I测定的结果。筛选这些候选克隆的另一种方法是设计一个引物降落,直接ZFN目标站点。在控制引物一起使用,一个负的检测结果表明:野生型序列的损失。一个至少包含一个野生型等位基因的杂合性克隆将Ÿield PCR扩增信号,但可能会被隔离的SYBR qPCR的背景下进行的PCR从完全野生克隆的。
一旦候选克隆已按上述方法确定的,它们可能由焦磷酸测序技术标准,深度测序,或其他的测序方法进行基因分型。对于所有的测序方法,创建了一个从克隆基因组DNA扩增,应生成。对于传统的焦磷酸测序等位基因可能被隔离TA克隆的PCR产物,测序的个人殖民地。对于方法,如深度测序这一步是没有必要的。
同源定向修复(HDR)
该协议提供ZFN通过NHEJ能介导的基因敲除的方法。转基因的整合也可能会进行了捐助质粒的同源性武器的引进,侧翼的的ZFN切割网站。在这种情况下,在的ZFN创建双链断裂是由人类发展报告,而不是对NHEJ能修复。预托证券的i转基因ntegration可能在本协议所规定的程序,使用类似的方法得到证实。
故障排除
交付的ZFNs
ZFN传递和表达传递,可控制交付的GFP或其他类似的可视化和/或定量的质粒。交付ZFNs表达格式,可以克服由于低表达与感兴趣的细胞类型的启动子不相容。此外,冷休克法可利用,进一步提高疗效细胞ZFNs 12。如果用于表达,这是当务之急,细胞被冲交付前,以确保所有的血源性核糖核酸酶已被删除。这也是审慎解冻冰表达,并添加到最后一刻的细胞,以尽量减少任何退化的机会。
CEL-I测定
CEL-我ASSA的基础y是具体利益的轨迹和充足的放大。如果观察到了非特异性扩增产物使用标准的PCR技术的故障排除过程,以增加特异性,如模板量,引物浓度,循环参数的优化。执行PAGE分析,而不是标准的琼脂糖凝胶电泳,因为后者的方法不提供足够的分辨率和灵敏度。 CEL-我消化条件下也可以进行优化,如果没有消化的产品或过量涂抹观察。可滴定滴定CEL-1核酸和/或消化时间长,金额,以改善这些方面。
The authors have nothing to disclose.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
Nuclease S (Cel-1 Enzyme) | Transgenomic | 706025 |
Expand High Fidelity PCR System | Roche | 03 300 242 001 |
Cell Line Nucleofector Kit V | Lonza | VCA-1003 |
GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit |
Sigma-Aldrich | NA0400 |