CompoZrカスタムジンクフィンガーヌクレアーゼによるゲノム編集（ZFNs）

Summary

CompoZrカスタムジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）サービスは、ユーザーによって定義されている任意の遺伝子座でのあらゆる生物や細胞ラインの正確なゲノムの編集が可能になります。この資料では、CompoZrカスタムZFNサービスの設計、製造、検証、実装するプロセスについて説明します。

Abstract

ゲノム編集は、遺伝子機能や疾患の遺伝的基礎を解明するために使用することができる強力な手法です。そのようなDNA配列の化学ベースの変異誘発またはランダムな統合などのメソッドを編集して、従来の遺伝子が潜在的に生物学的研究を混乱させ、全体として非効率的な方法で無差別な遺伝的変化を与えると異常な培養条件の望ましくない合成配列、または使用の取り込みをする必要があります。これとは対照的に、細胞内の一過性ZFN式は、正確に容易にすることができる合成の導入遺伝子の化学物質や統合の管理のため必要とせず非常に効率的な方法で遺伝子編集を遺伝。

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFNs）が結合し、二本鎖DNA（dsDNA）の異なるシーケンスを切断する酵素である。機能的なCompoZr ZFNユニットは約15から18ヌクレオチドのDNA "半サイト"を結合する2つの個々の単量体タンパク質（ 図1を参照）で構成されています。と、2つのZFNモノマーのDNA切断ドメインは二量体化し、その隣接するターゲットサイトへの"ホーム"とDNAの二本鎖切断（DSB）を作成します。ゲノムのZFN媒介DSBの¹はじめには、非常に効率的なゲノムを編集するための基盤を提供します。非相同末端接合（NHEJ）DNA修復経路を介して細胞内でDSBの不完全な修復は、小さな挿入及び欠失（indelsの）になる可能性があります。細胞の遺伝子コード配列内indelsのの作成 ​​には、フレームシフトと高効率で遺伝子座の後続の機能的なノックアウトになる可能性があります^。2このプロトコルは、遺伝子ノックアウトを作成するZFNsの使用方法について説明しますが、導入遺伝子の統合も経由して行うことができるZFNの切断部位での相同性指向の修理。

CompoZrカスタムZFNサービスZFN技術と科学的なコミュニティのための標的遺伝子の編集に、体系的、包括的な、よく特徴付けられたアプローチを表しています。シグマの科学者は、1）研究者と密接にperfo仕事プロジェクトの目標に基づき、関連する遺伝子の構造、生物学、モデルシステムの分析、2を含むRMデューデリジェンス分析）音ターゲティング戦略、3を開発するためにこの知識を適用する）を構築し、設計し、機能的に関連の活動のためにZFNsを検証する細胞株。調査官は、陽性対照ゲノムDNAとプライマーを受信し、プラスミドDNAの両方に及びインビトロ転写されたmRNAの形式供給ZFN試薬をすぐに使用できる。これらの試薬は、その後研究者の細胞株または任意の細胞型の一過性発現のために配信されることがあります。次に、試料をPCR増幅、酵素消化、電気泳動などの標準的な分子生物学的手法によって関心の遺伝子座に遺伝子編集のためにテストされています。遺伝子編集のための肯定的な信号が初期集団で検出された後、細胞はクローン化された単一細胞と変異クローン/遺伝子の同定のための遺伝子型があります。

Protocol

1。カスタムZFNのデザインプロセス

1. ZFN設計プロセスを促進するために、研究者は提供する必要があります。
• そのような遺伝子名、種、遺伝子アノテーション/識別番号などの標的遺伝子についての情報。
• 実験の明記オーバーすべての目的（例えば、ノックアウトまたはノック）
• 非定型の遺伝子構造、遺伝子座に関与する特殊な生物学、または他のゲノム内の任意の相同性領域を含む遺伝子ターゲットの特定の要因。
• ジンクフィンガーのDNA配列の特定の範囲が対象とするヌクレアーゼ。
2. シグマバイオインフォマティクスチームは最初のジンクフィンガーターゲットサイトを開発するシリコZFNのデザインで実施しています。
3. 初期ZFNの標的部位は、ZFN科学技術コンサルタントに提供されます。もっと技術的に複雑なプロジェクトでは、このシグマの科学者は、プロジェクトの戦略を開発する研究者で動作します。
4. バイオインフォマティクスは、レビューのために調査官にトップZFNの標的部位を提供します。潜在的なZFNの標的部位の承認を得て、この情報はZFN製造プロセスを開始するZFN制作チームに提供されています。

2。カスタムZFN生産

1. ジンクフィンガーモジュールのシグマ·アーカイブが承認されたZFNのデザインを組み立てるために使用されます。
2. 各ZFNのデザインは組み立て順序は、ハイスループットクローニングプラットフォーム上で検証されます。
3. 一度すべてのZFN設計の生産は、検証に送信されるすべてのZFNを完了しています。

3。カスタムZFNsの検証

1. ZFNプロジェクトのヒト、マウス、ラットまたはCHO種それぞれの種に対して、十分に特徴付け細胞株で検証され、酵母ベースのアッセイは、他の生物や細胞の種類に使用されます。
2. ZFNコンストラクトはヌクレオことによって、適切な細胞株に配信され、ZFNsが表現されています。
3. DNAはZFNトランスフェクトした細胞のプールから収穫され、関心のある領域をPCR増幅されます。
4. CEL-1アッセイは、その後のPCR産物で実施されています。ゲル電気泳動を検証ZFN活動にCEL-1アッセイ上で実行されます。
5. CEL-1アッセイによって確認され、最高の活性ZFNのデザインは、顧客に提供されます。 ZFNsは、ポジティブコントロールとしてCEL-1アッセイとゲノムDNAのPCRプライマーと一緒にmRNAおよびプラスミドDNAで配信されます。

4。ヌクレオによって検証ZFNsの配信

1. 2×10 ⁵細胞/ mlヌクレオ前日の密度で種の細胞を。
2. ヌクレオの日に、セルラインのNucleofectorキットVを取り出し、室温にしましょう​​。
3. 製造元のプロトコールに従ってVヌクレオソリューションに補足を追加します。
4. 細胞をカウントします。細胞密度は2.5×10 ⁵細胞/ mlの間でなければなりません。
5. 前のヌクレオに少なくとも20分間37℃CO ₂インキュベーター内で各ウェルにあらかじめ暖かい媒体の2ミリリットルを6ウェルプレートを埋める。
6. 5分間200xgでトランスフェクション当たり2×10 ^6個の細胞^（8×6の合計）を遠心します。
7. ハンクス平衡塩溶液（HBSS）20 mlで2回細胞を洗浄します。
8. 実験的なチューブを準備します（カスタムZFN技術情報で表を参照してください）
9. インキュベーターからのステップ（6.5）からメディアを含む6ウェルプレートを取り外します。
10. ヌクレオソリューションの400μlの再懸濁し（100μL/反応）V.
11. 一度反応は、それぞれのDNAまたはmRNAを含むチューブに細胞100μlを追加します。 TRANSFER適切なプログラムでのNucleofectorで2ミリメートルエレクトロポレーションキュベットとnucleofectの混合物。
12. すぐに各サンプルのヌクレオした後、キュベットにステップで6ウェルプレート（6.9）から温め媒体の〜500μlを追加するには、ピペットを使用しています。その後、慎重に6ウェルプレート内の残りの温めておいた培地にキュベットから細胞を転送します。
13. すべての反応を終了し、37℃CO ₂インキュベーターに6ウェルプレートを返す

5。 ZFNsの配信後、ゲノムDNAを採取する

1. 6ウェルプレート - プールされたすべてのセルを収穫しないでください。それはあなたがCEL-1消化製品を持っていることを確認した後単一細胞希釈クローンの細胞を持つために、文化を維持することが重要です。 1〜3日後のヌクレオGenElute哺乳類のゲノムDNAミニプレップキットを使用して染色体DNAを調製するために細胞を収集します。

6。 CEL-1アッセイ

PCRは、付属のプライマーを用いて、ZFNトランスフェクションサンプルとキットに付属の陽性対照ゲノムDNAからゲノムDNAを増幅する。 （カスタムZFN技術情報で表を参照）：PCR反応は以下の条件で設定されています。

PCRのhomoduplexesからヘテロを生成するには、それぞれのZFN処理したサンプルに加え、コントロールからのPCR反応液10μlを取り、サーモサイクラー上で次のプログラムを使用します。
95°C、10分
95°C〜85°C、-2°C /秒
85°C〜25°C、-0.1°C /秒
4°C、無期限に

42各反応とインキュベート°C 20〜40分のためにエンハンサー、1μlとヌクレアーゼS 1μlを（Transgenomicカタログ番号706025）を追加。

そのようなDirectLoad WideRange DNAラダー（製品番号D7058）のような適切なマーカー（カスタムZFN技術的セキュリティ情報の結果を参照してください）​​、10％PAGE-TBEゲル上で消化を実行します。

上のCE正の信号がCEL-IアッセイによりZFN処理集団で検出された、クローンの単離および特性評価に進みます。

7。クローンの単離とキャラクタリゼーション

1. FACSおよび希釈クローニングを含む標準的な方法により単一細胞クローンZFN処理したサンプル。
2. クローンバンクの材料として残りをバック凍結、ゲノムDNAの収穫のための細胞のいくつかの割合を分割して、十分に拡張することができます。
3. CEL-Iプライマーを用いたクローンからゲノムDNAを増幅し、CEL-Iアッセイ（にスパイクWT DNAの有無にかかわらず）によりアンプリコンを分析し、あるいは遺伝子型に直接進むために、このアンプリコンを使用しています。
4. 遺伝子候補クローンが好ましい方法で編集された対立遺伝子を有するものとして同定した。

8。代表的な結果

全体CompoZr ZFNワークフローの例を図2に示されています。 ZFNsが配信されます彼らは二本鎖切断（DSB）を作成し、適切なDNA配列に結合し、切断する細胞に。自然の修復プロセスは、非相同末端接合（NHEJ）、修理DSB。ヌクレオチドの欠失、挿入または置換のいくつかのインスタンスで異常なNHEJの結果。 PCR反応の変性/アニーリングステップの後に野生型と変更されたアンプリコンとの間のヘテロ二本鎖形成に収穫されたゲノムDNAの結果のPCR増幅。任意のヘテロ分子の開裂にCEL-1酵素の添加により。 CEL-1の結果は、ZFN切断を確認するためにPAGE分析によって解決されます。 図3は、CEL-1アッセイと期待される結果の概略を提供しています。

代表的なCEL-1の結果は、 図4および図5に含まれている図4は、K562細胞におけるZFNs（21％）の非常にアクティブなペアから結果が含まれています。 図5は、ZFNsの少ないアクティブペア（2.4％）からの結果が含まれていますK562細胞。 ZFN活性は、親のPCR断片を、以下の2つのPCR断片の存在によって、両方の数字で確認されています。

図1。バインドされたジンクフィンガーヌクレアーゼの表現。ZFNsはFokI制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインに融合ジンクフィンガーDNA結合ドメインから成る組み換えタンパク質である。ヘテロ二量体として結合すると、ZFNsは、ユーザーが指定したDNA配列において二本鎖ブレークを作成します。

図2。カスタムZFNサービスワークフローの概略図。CompoZrのZFNsを使用して、遺伝子組換え細胞株を生成するためのワークフローのグラフィック表現。

図3。 CEL-1アッセイと結果の概略）。ZFNプラスミドO R mRNAは、細胞に送達されています。 B）ZFNsバインドを発現し、細胞の部分の二本鎖切断（DSB）を作成し、その標的配列を切断。 C）非相同によっていくつかのDSBの異常修復がヌクレオチド挿入または欠失で結果を結合し終了します。 D）ゲノムDNAは、細胞のトランスフェクトされたプールから収穫し、興味のある遺伝子座で増幅されています。 EF）PCR産物を変性し、野生型と変更されたアンプリコンとの間のヘテロ二本鎖形成を作成して再アニール。 G）ヘテロ分子の開裂にCEL-1の不一致エンドヌクレアーゼアッセイの結果。 H）CEL-1酵素のダイジェストは、PAGEによって解決されます。経口バンドの切断産物の観察率は、ImageJのソフトウェアによって決まり、ZFNsの端数カットと効率性を示しています。

図4。 21パーセントアクティブZFNsからCEL-1の結果 ImageJのソフトウェアは、で確認できます。_blank "> http://rsbweb.nih.gov/ij/。

図5。 2.4パーセントアクティブZFNsからCEL-1の結果 ImageJのソフトウェアは次のURLで入手できます。。 http://rsbweb.nih.gov/ij/ 。

Discussion

一度ZFN改変細胞は、彼らは永久的な持っているとDNA修飾を遺伝的に絶縁されています。研究を実施することが望ましい遺伝子改変で安定変更された細胞株または繁殖動物を生成することができ、この結果。 CompoZrカスタムZFNsは、ゲノムは、細胞の種類の多種多様な編集のための堅牢な方法を提供します。 ZFNsで編集成功したゲノムの出版物を作成する機能が含まれていますが、ヒト細胞株、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ、カエル、ブタおよびCHOの研究モデルに限定されません^{。3,4,5,6,7,8,9} ZFNsが適切に細胞内に配信されたときに、指定された細胞型の所望の標的部位における二本鎖ブレークが保証されています。それは、セル内に複数の遺伝子改変を持たせるために、セルに連続したジンクフィンガーの変更を実行することも可能です¹⁰特定の標的配列を選択して、それだけで特定の遺伝子座を変更する機能は、複数を作成する機能の主な原因です。 MODIFIカチオン。

CompoZrカスタムZFN分析証明書は、このようにキットのすべてのコンポーネントが完全に顧客の成功のために検証されていることを保証するキットで提供される非常に試薬を用いて生成されます。最初から最後までのワークフローの重要なステップを以下に示す：

細胞のクローニング

与えられた細胞株を分離して展開する能力は、任意のZFN実験を開始する前にテストする必要があります。単一細胞を単離し、クローン由来の人口は可能であることを確認するために拡大すべきである。いくつかの細胞株は、この問題では難治であり、そのような培地で編集したクローンの濃縮や、文化としてのトリックはこれらの課題を克服するのに役立ちます。

配信の効率化

配送効率の最適化はZFNsの配信前に必見です。多くの方法が脂質ベースのトランスフェクション、エレクトロポレーション、およびnucleofecti含めて使用することができで。理想的な配信方法は、配信効率と細胞生存の最適なブレンドが得られる1で構成されています。これらの効率を定量化する目視検査またはFACS 24-48時間後の配信により、GFPコントロールプラスミドと定量提供することによって推定することができる。

CEL-Iアッセイ

それはCEL-Iのアッセイは、PCR、消化、電気泳動のパラメータはZFN実験の解釈に干渉しないように、適切なコントロールを使用して並列に実行されることが不可欠です。各キットには分析証明書にCEL-Iイメージを作成するために使用されているコントロールゲノムDNAが含まれています。 CEL-Iのアッセイに続いて提供するプライマーとコントロールDNAからの増幅には、ユーザーが分析証明書（CofA）イメージで提供されると結果を比較することができ、実験のこの側面の任意の潜在的な非効率性を分離します。このようなモック、またはGFP処理した細胞などの適切なネガティブコントロールサンプルは、任意の非特異的切断産物の解明を可能にするために含まれるべきである。

単一細胞クローンの定量/定性分析

ZFN処理および単一細胞クローニング後、細胞の集団は、メソッドの番号によって、興味を持った遺伝子座で編集するためにスクリーニングすることができる。 CEL-Iのアッセイは、さらに遺伝子型の候補クローンを同定する目的のためにクローンからゲノムDNAで実施されることがあります。それはCEL-Iは、ホモ接合変異体クローンが均質分子を含むため、負のCEL-Iアッセイの結果を伝えるように消化を行う前に、1:1の比率でサンプルアンプリコンにスパイクWT PCRアンプリコンに重要です。これらの候補クローンをスクリーニングするための代替方法は、直接ZFNの標的部位に1つのPCRプライマーの着陸を設計することです。コントロールプライマーのいずれかと組み合わせて使用​​することで、負の測定結果は、WTシーケンスの損失を示しています。少なくとも一つのWT対立遺伝子を含むヘテロ接合のクローンは、Yうield PCRシグナルが、SYBR定量PCRのコンテキスト内でPCRを行うことにより完全にWTクローンから分離されることがあります。

候補クローンは、上記の方法により同定されたら、それらは標準のパイロシーケンシング、ディープシーケンシング、または他のシーケンシング法により遺伝子型を決定することができます。すべてのシーケンスメソッドでは、クローンのゲノムDNAから作成されたアンプリコンを生成する必要があります。従来のパイロシーケンシングの対立のためにTA-クローニングすることによって、PCR産物を分離し、個々のコロニーをシーケンシングすることができます。そのような深いは、この手順をシーケンシングなどの方法は必要ありません。

相同性監督修理（HDR）

このプロトコルは、NHEJを経由してZFNを介した遺伝子ノックアウトの方法を提供する。導入遺伝子の統合も、その側面ZFNカットサイトを相同性ア ​​ームを持つドナープラスミドを導入することにより行うことができる。このシナリオでは、 ^{図11に示すように} 、ZFNは、二本鎖ブレークがHDRの代わりに、NHEJによって修復されて作成されます。 HDRは、iを監督導入遺伝子のntegrationは、このプロトコルを通じて提供される手順に類似の方法を用いて確認することができる。

トラブルシューティング

ZFNsの配信

ZFNの配信と表現配信は、可視化、および/または定量するためのGFPま​​たは他のそのようなプラスミドの配信によってのために制御することができます。目的の細胞型とプロモーターの非互換性に起因する低発現は、mRNAの形式でZFNs​​の配信によって克服されることがあります。さらに、コールドショックメソッドは、さらに細胞内ZFNsの効力を高めるために利用することができる¹² mRNAが使用されている場合は、それが細胞はすべての血清由来のRNaseが除去されていることを確認するために、配信する前に洗浄されることが肝要である。それは氷の上でmRNAを解凍し、劣化の任意のチャンスを最小限に抑えるために非常に最後の瞬間で細胞にそれを追加することも賢明である。

CEL-Iアッセイ

CEL-I ASSAの基礎yは、興味のある遺伝子座の特定と十分な増幅です。非特異的増幅産物が認められた場合にはそのような鋳型量の最適化、プライマー濃度、サイクリングパラメータとして特異性を高めるために標準的なPCRのトラブルシューティング手順を使用しています。後者の方法は、十分な分解能と感度を提供していないように、標準アガロース電気泳動とは対照的に、PAGE分析を実行します。全く消化物や過度のにじみが観察されていない場合、CEL-Iダイジェスト条件も最適化することができる。 CEL-1の量の滴定ヌクレアーゼ及び/又は消化時間の長さは、これらの側面を改善するために滴定することができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nuclease S (Cel-1 Enzyme)	Transgenomic	706025
Expand High Fidelity PCR System	Roche Group	03 300 242 001
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza Inc.	VCA-1003
GenElute HP Endotoxin-Free Plasmid Maxiprep Kit	Sigma-Aldrich	NA0400